動物細胞培養(yǎng)技術(shù)研究進展

動物細胞培養(yǎng)技術(shù)研究進展張云生西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院陜西楊凌712100)[摘要]:動物細胞培養(yǎng)是生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法，可分為原代和傳代培養(yǎng)，有貼壁、懸浮和固定化培養(yǎng)等培養(yǎng)方式。細胞生長具有特殊的生物學(xué)性質(zhì)，需要無菌、恒溫和充分的營養(yǎng)環(huán)境。動物細胞培養(yǎng)技術(shù)在擁有廣闊的發(fā)展空間和光明前景的同時也面臨著諸多問題和挑戰(zhàn)。[關(guān)鍵詞]:細胞培養(yǎng)；微載體；中空纖維；微囊；生物反應(yīng)器1885年，WRou〉嘗試使組織離體培養(yǎng)，被認為是組織細胞培養(yǎng)技術(shù)的萌芽；1907年Harrison和1912年Carrel開始把組織培養(yǎng)作為一種方法,用于研究離體動物細胞的培養(yǎng)，標志著細胞培養(yǎng)技術(shù)(Cellculturetechnology)的誕生。此后,隨著抗生素、培養(yǎng)基、培養(yǎng)裝置以及工藝方法的不斷改進，動物細胞培養(yǎng)(Animalcellculture)的研究和應(yīng)用逐步增多和深入，發(fā)展至今已成為在生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法。利用細胞培養(yǎng)開展體外試驗，成為了闡釋生命現(xiàn)象、發(fā)病機理和篩選藥物的重要手段；利用細胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合細胞融合(Cellfusion)、細胞雜交(Cellhybridization)以及轉(zhuǎn)基因(Transgene)技術(shù)進行基因重組、組織構(gòu)建是遺傳和組織工程的重要工具；利用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等，已成為醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要部分[1]。[1,2]細胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細胞模擬體內(nèi)生存環(huán)境，在無菌、適當溫度及酸堿1度基本概和念一定營養(yǎng)條件下，使其生長繁殖并維持結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。從體內(nèi)取出細胞首次培養(yǎng)即為原代培養(yǎng)(PrimaryCulture)，這是細胞培養(yǎng)的最初和必經(jīng)階段。當原代培養(yǎng)細胞生長到一定時期，受到群體環(huán)境限制，就需要轉(zhuǎn)移到另一容器才能繼續(xù)生長，稱為傳代或繼代培養(yǎng)(Subculture)。根據(jù)原代培物性狀的一致性與否，傳代成功后稱為細胞系(Cellline) 或細胞株(CellStrain)。這些細胞一般可順利傳40?50代次，并保持染色體二倍體數(shù)量和接觸抑制，傳至 50代左右時則出現(xiàn)生長停滯，大部分衰老死亡，此類稱為有限細胞系/株；在細胞傳代的過程中，有些因發(fā)生遺傳突變獲得了持久性增殖能力的細胞稱為無限細胞系/株。2體外培養(yǎng)動物細胞的生物學(xué)特性動物細胞無細胞壁，機械強度低，對剪切力敏感，適應(yīng)環(huán)境能力差；倍增時間長，生長緩慢，易受微生物污染；對生長環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境要求苛刻[3]。2.1細胞生命周期性變化[1]體外培養(yǎng)的細胞從適應(yīng)環(huán)境、旺盛生長到由于自身和環(huán)境限制緩慢或停滯生長經(jīng)歷一個周期變化。潛伏期(Latentphase)細胞從接種到適應(yīng)新環(huán)境生長繁殖的一段時間，此間細胞胞質(zhì)回縮，代謝緩慢。指數(shù)生長期(Logarthmicgrowthphase)指數(shù)生長期是細胞活力最好的時期，細胞增殖旺盛。在接種細胞數(shù)量適宜的情況下。指數(shù)生長期持續(xù) 3?5d后，隨細胞數(shù)量不斷增多，生長空間日趨減少,營養(yǎng)環(huán)境惡化，呈現(xiàn)接觸抑制(Contactinhibition)。惡性細胞則由于營養(yǎng)成分的消耗和細胞代謝產(chǎn)物的影響而發(fā)生密度抑制(Densityinhibition)。穩(wěn)定期(Stagnatephase)細胞數(shù)量達到飽和密度后，細胞與營養(yǎng)液的交換面積減少，代謝產(chǎn)物積累，pH值下降，細胞停止增殖,進入停滯期。營養(yǎng)環(huán)境繼續(xù)惡化后,細胞受損直至死亡。2體內(nèi)外細胞的差異細胞在體外培養(yǎng)后，失去了神經(jīng)體液調(diào)節(jié)和細胞間相互影響，生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中，失去原有組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)，分化特性減弱或不明顯，直至發(fā)展[1,2]3細胞培養(yǎng)成惡性環(huán)細胞境和。生長條件1無菌無毒環(huán)境無菌無毒的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是保證細胞在體外培養(yǎng)成功的首要條件。在體外培養(yǎng)的細胞，由于缺乏對微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物質(zhì)污染,或者自身代謝物質(zhì)積累,就可能會導(dǎo)致細胞中毒死亡。因此，在體外培養(yǎng)細胞時，應(yīng)及時清除細胞代謝產(chǎn)物,以保持細胞生存環(huán)境無菌無毒。2恒溫要維持培養(yǎng)的細胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。偏離適當?shù)臏囟确秶?，細胞會受到損傷，影響正常代謝甚至死亡。3氣體環(huán)境氣體是哺乳動物細胞培養(yǎng)所必需的條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環(huán)供給細胞能量和生長組分；二氧化碳既是細胞代謝產(chǎn)物，也是細胞增殖所需成分，并對調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值有重要作用。4緩沖環(huán)境該環(huán)境的作用是維持細胞滲透壓，提供緩沖系統(tǒng)，使培養(yǎng)液的酸堿度維持在培養(yǎng)細胞生理范圍內(nèi)，提供細胞正常代謝所需的水分和無機離子等。5培養(yǎng)基培養(yǎng)基既是細胞培養(yǎng)中供給細胞營養(yǎng)和促進增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是細胞生長繁殖的直接環(huán)境。培養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基從動物體液或組織中分離提取，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等；合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，模擬合成、配制的培養(yǎng)基。它包含細胞生長的無機鹽、氨基酸、維生素、糖類等基本物質(zhì)和一些特殊的添加成分結(jié)合適量添加血清，廣泛應(yīng)用于動物細胞培養(yǎng)。4細胞的培養(yǎng)方式1貼壁培養(yǎng)(Monolayerculture)貼壁培養(yǎng)主要適用于貼壁依賴性細胞。一般源于實體組織的細胞需要相互依賴，需貼附于不起化學(xué)作用的物質(zhì)(玻璃或塑料等無活性物質(zhì))的表面生長、生存和維持，并最終在附著面生長至單層,鋪滿平面時便會發(fā)生接觸抑制。2懸浮培養(yǎng)(Suspensionculture)懸浮適應(yīng)細胞、源于循環(huán)系統(tǒng)的細胞及腫瘤細胞等非貼壁依賴性細胞無需支撐面，細胞或細胞聚集體懸浮于液體培養(yǎng)基中增殖。懸浮培養(yǎng)是大規(guī)模細胞培養(yǎng)的理想方式。3固定化培養(yǎng)(Immobilizingculture)固定化培養(yǎng)是一種包埋培養(yǎng)方式，適用于貼壁依賴性細胞和非貼壁依賴性細胞。它具有剪切力低、傳遞效果好和抗污染能力強、細胞生長密度高、產(chǎn)物易于收集和分離純化等特點。微載體培養(yǎng)(Micro-carrierculture)傳統(tǒng)的貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)通過靜止或轉(zhuǎn)瓶等培養(yǎng)來獲得，操作繁復(fù)，且耗費空間及人力。1967年,VanWezel首次提出了“微載體”培養(yǎng)系統(tǒng)[3]，使貼壁依賴型細胞貼附在微載體上懸浮于液體培養(yǎng)基中生長，兼具平板培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢，增加培養(yǎng)面積同時獲得均一的環(huán)境培養(yǎng)條件(溫度、pH值、CO濃度、葡萄糖濃度等)，便于控制放大獲得高密度培養(yǎng)細胞和優(yōu)化下游控制。中空纖維培養(yǎng)(Hollowfibresculture)1972年，RichardKnazek首次報道該技術(shù)⑻。該技術(shù)是模擬細胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)，利用一種人工的“毛細管”即中空纖維給培養(yǎng)的細胞提供物質(zhì)代謝條件而建立的一種體外培養(yǎng)系統(tǒng)。中空纖維表面具有海綿狀多孔結(jié)構(gòu),既能使水分子、營養(yǎng)物質(zhì)和氣體透過,也能使細胞在上面貼附生長。該技術(shù)的特點是:細胞培養(yǎng)環(huán)境溫和，培養(yǎng)細胞密度較高，產(chǎn)品較容易分離純化[4]。微囊法培養(yǎng)[4](Micro-encapsulationculture)微囊化培養(yǎng)技術(shù)是20世紀70年代由Lin和Sun創(chuàng)建的一種大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)[4]。其要點是：在無菌條件下將擬培養(yǎng)的細胞、生物活性物質(zhì)及生長介質(zhì)共同包裹在薄的半透膜中形成微囊，再將微囊放入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進行培養(yǎng)。培養(yǎng)液中的水和營養(yǎng)物質(zhì)可透過半透膜進入微囊供應(yīng)給細胞，細胞的代謝物也可透過半透膜被排出，而細胞分泌的大分子物質(zhì)則被阻留而積累在囊內(nèi)。微囊化培養(yǎng)有諸多優(yōu)點：首先，細胞能生長和維持在小體積的培養(yǎng)液中，這使培養(yǎng)液中的分泌產(chǎn)物變濃，簡化了下游加工；其次，培養(yǎng)液易于迅速改變，且無分離細胞與培養(yǎng)液的困難；最后，微囊固定化細胞還能使細胞較少暴露于物理損傷環(huán)境中。用微膠囊培養(yǎng)可保護細胞在膠囊內(nèi)，可起到中空纖維的某些作用，也可避免反應(yīng)器的剪切力對細胞的損傷。5存在問題與展望體外動物細胞培養(yǎng)中銨離子、乳酸和CO2的積累對細胞產(chǎn)生毒性作用或者改變細胞代謝水平,抑制細胞生長[5]，需要及時改善培養(yǎng)環(huán)境。細胞凋亡是大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程的重要制約環(huán)節(jié)，用基因工程方法將bcl-2基因這種細胞凋亡抑制基因?qū)爰毎?成為眾多研究者的選擇[6,7]。Bcl-2基因的過量表達能抑制Gin或氧缺乏引起的細胞凋亡，減少細胞特定營養(yǎng)成分的消耗,提高細胞密度和目的蛋白產(chǎn)量[7]。培養(yǎng)基中所添加的血清主要來源于動物或人，但存在潛在的污染源、不同批次間蛋白含量差異大及價格高等缺點。有些細胞株依賴于血清源性生長因子的特性可通過分子遺傳途徑予以改變，即導(dǎo)入特異生長因子的基因，使細胞能合成自身的生長因子來滿足細胞生長需要，而對細胞生長無副作用[8]。另外，導(dǎo)入一些基因改變細胞生長周期的調(diào)控也可使細胞在無血清/蛋白的培養(yǎng)基中生長[9]。只要在培養(yǎng)基中增加某些適于細胞生長的成分，如纖連蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和表皮生長因子等，不少細胞即能在無血清供應(yīng)的情況下生長[10]。通過細胞工程方法使細胞高水平表達外源基因并正確加工表達產(chǎn)物，從而提高整個表達系統(tǒng)的產(chǎn)率，也成為應(yīng)用大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)外源目的蛋白的研究的重要手段。改善細胞環(huán)境是當前眾多生物反應(yīng)器及控制器研究者的不懈努力方向。隨著對細胞生長和產(chǎn)物生成之間相關(guān)性研究的深入，對生物反應(yīng)器更多培養(yǎng)狀態(tài)參數(shù)的在線檢測以及各種新細胞生物反應(yīng)器系統(tǒng)的開發(fā)利用，新的培養(yǎng)/控制模式將會在現(xiàn)有基礎(chǔ)上不斷產(chǎn)生。經(jīng)過幾十年來的研究與實踐應(yīng)用,動物細胞培養(yǎng)技術(shù)已日趨完善，發(fā)展方向?qū)⒓性诟倪M細胞特性，優(yōu)化細胞環(huán)境，擴大生產(chǎn)規(guī)模和提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)率與產(chǎn)量等幾方面。開發(fā)能高密度生長、能分泌大量目標產(chǎn)品的細胞系；研制細胞生長性能優(yōu)良、吸附細胞容易、解離細胞容易并能重復(fù)使用的新型微載體；研制規(guī)模化生物反應(yīng)器，實時檢測系統(tǒng)，剪切力小、混臺性能好的新型細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和細胞培養(yǎng)與產(chǎn)物分離的耦合系統(tǒng)；設(shè)計新的適合于各個體細胞株(系)的無血清、無蛋白培養(yǎng)基，使生物制品更安全；開展三維細胞培養(yǎng)及組織工程研究。[參考文獻]王捷,等.動物細胞培養(yǎng)技術(shù)與應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004:1-9.翟中和,王喜忠,丁明孝,等.細胞生物學(xué)[M].北京:高等教育出版社,2000:66-67.石凱,熊曉輝,許建生.固定化動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)研究進展[J].化工進展,2002,21(8):556-559.MaryaIC,JulioAL,RicardoJG.Solvingdesignequationsforahollowfiberbioreactorwitharbitrarykinetics[J].ChemicalEngineeringJournal,2001(84):445-461.林福玉,陳昭烈,劉紅,等.大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)的問題及對策[J].生物技術(shù)通報,1999,10(1):32-35.SuzukiE,TeradaS,UedaH,etal.Establishingapoptosisresistantcelllinesforimprovingproteinproductivityofcellline[J].Cytotech,1997(23):55-59.TeradaS,ItohY,UedaH,etal.Characterizationandfed-batchcultureofhybridomaoverexpressingapoptosissuppressinggenebcl-2[J].Cytotech,1997(24):135-141.PackSCO,HuntSMN,BridgesMJ,etal.SuperCHOacelllinecapableofautocrinegrowthunderfullydefinedprotein-freeconditions[J].Cytotechnology,1996(22):139-146.RennerWA,LeeKH,HatzimanikatisV,etal.Recombinant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