發(fā)酵工程第四章發(fā)酵工業(yè)無菌技術(shù)

發(fā)酵工程第四章發(fā)酵工業(yè)無菌技術(shù)第一頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五第四章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)第二頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五本章內(nèi)容第一節(jié)概念第二節(jié)發(fā)酵工業(yè)污染的防治策略第三節(jié)發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)第四節(jié)培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌第五節(jié)空氣除菌第三頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五一、概念第一節(jié)發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)滅菌消毒除菌防腐

目前，絕大多數(shù)工業(yè)發(fā)酵都采用純種培養(yǎng)，要求整個發(fā)酵過程無雜菌。為保證純種發(fā)酵，在生產(chǎn)菌種接種之前要對發(fā)酵培養(yǎng)基、空氣系統(tǒng)、流加料、發(fā)酵罐及管道系統(tǒng)等進(jìn)行滅菌，對環(huán)境消毒。發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)第四頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五滅菌(sterilization):

用化學(xué)或物理方法殺死物料或設(shè)備中所有有生命物質(zhì)的過程。

消毒(disinfection):

用物理或化學(xué)方法殺死空氣、地表以及容器和器具表面的微生物。

除菌(degermation):

用過濾方法除去空氣或液體中的微生物及其孢子。

第五頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五防腐(antisepsis):

用物理或化學(xué)方法殺死或抑制微生物的生長和繁殖。發(fā)酵工業(yè)無雜菌技術(shù)：

一般采用“污染概率”作為評價標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)酵工業(yè)中允許的染菌率是10-3，即滅菌1000批次的發(fā)酵中只允許有1次染菌。第六頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五二、消毒與滅菌的區(qū)別消毒僅僅是殺滅生物體或非生物體表面的微生物，一般只能殺死營養(yǎng)細(xì)胞，不能殺死細(xì)菌芽孢和真菌孢子，適合于發(fā)酵車間的環(huán)境和發(fā)酵設(shè)備、器具的無菌處理；滅菌是殺滅所有的生命體，適合于培養(yǎng)基等物料的無菌處理。第七頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)發(fā)酵工業(yè)污染的防治策略

一、污染的危害二、污染危害的具體分析三、污染的防治第八頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五一、污染的危害

雜菌造成培養(yǎng)基營養(yǎng)消耗雜菌合成新產(chǎn)物；或改變了發(fā)酵液的某些理化性質(zhì)，菌體自溶、發(fā)粘等造成產(chǎn)物提取分離困難，收率低，質(zhì)量下降；雜菌的代謝會改變原反應(yīng)體系的pH，發(fā)生異常變化；雜菌分解產(chǎn)物，使生產(chǎn)失??；噬菌體污染后，微生物細(xì)胞裂解，生產(chǎn)失敗。第九頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五染菌率國外：抗生素發(fā)酵染菌率為2%~5%。國內(nèi)：青霉素發(fā)酵染菌率為2%；鏈霉素、紅霉素和四環(huán)素發(fā)酵染菌率為5%；谷氨酸發(fā)酵噬菌體的染菌率為1%~2%

。第十頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五二、染菌危害的具體分析

1、染菌對不同菌種發(fā)酵的影響A．細(xì)菌谷氨酸：發(fā)酵周期短，培養(yǎng)基不太豐富，較少染雜菌，但噬菌體威脅大，難以防治。肌苷：缺陷型生產(chǎn)菌，培養(yǎng)基豐富，易染菌，染菌后，營養(yǎng)成分迅速被消耗，嚴(yán)重抑制菌生長和合成代謝產(chǎn)物。發(fā)酵菌體不同，培養(yǎng)基、發(fā)酵條件、周期及產(chǎn)物性質(zhì)不同，染菌類型及危害不同。第十一頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五B.

霉菌PenG：易染菌，雜菌分泌青霉素水解酶，PenG迅速被破壞，發(fā)酵一無所獲。檸檬酸：產(chǎn)酸后，pH降為2.0，不易染菌，主要防止前期染菌，后期注意酸性菌感染。C.

酵母菌:主要防止細(xì)菌以及野生酵母菌污染。

D.

疫苗：要求高，一旦染菌，無論污染的是活菌、死菌或內(nèi)外毒素，都應(yīng)全部廢棄。第十二頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五2、染菌種類對發(fā)酵的影響青霉素：怕染細(xì)短產(chǎn)氣桿菌鏈霉素：怕染細(xì)短桿菌、假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌四環(huán)素：怕染雙球菌、芽孢桿菌和莢膜桿菌檸檬酸：怕染青霉菌肌苷（酸）：怕染芽孢桿菌谷氨酸：怕染噬菌體，易造成連續(xù)污染第十三頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五

種子擴(kuò)大時期染菌:危害極大，滅菌后棄去。發(fā)酵前期染菌：應(yīng)迅速重新滅菌，補(bǔ)充必要的營養(yǎng)成分，重新接種。發(fā)酵中期染菌：挽救困難，應(yīng)早發(fā)現(xiàn)，盡快處理，處理方法應(yīng)根據(jù)各種發(fā)酵的特點(diǎn)和具體情況來決定。3、不同發(fā)酵時期染菌對發(fā)酵的影響第十四頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五檸檬酸發(fā)酵（分別處理）a.污染細(xì)菌：加大通風(fēng)，加速產(chǎn)酸，調(diào)pH3.0以下，抑制細(xì)菌生長。b.污染酵母：加入0.025~0.035g/LCuSO4抑制酵母；通風(fēng)加大，加速產(chǎn)酸。c.染黃曲霉：加入另一罐將近發(fā)酵成熟的醪液，

pH下降，黃曲霉自溶。d.染青霉菌：在pH很低下能夠生長。提前放罐。

第十五頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五發(fā)酵后期污染染菌量不太多，可繼續(xù)發(fā)酵。污染嚴(yán)重，則提前放罐。殺菌劑的添加：前期無必要，增加成本；發(fā)現(xiàn)后加入，效果要具體評價。第十六頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五4、雜菌污染對發(fā)酵產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響絲狀菌發(fā)酵被產(chǎn)酸菌污染：pH不斷下降，菌絲大量自溶，發(fā)酵液粘度增加，過濾困難。處理方法：①將發(fā)酵液加熱后再加助濾劑；②先加絮凝劑使蛋白質(zhì)凝聚后沉淀。雜菌分泌較多蛋白質(zhì)雜質(zhì)時，對發(fā)酵后處理過程中采用溶媒萃取的提取工藝非常不利，使水相和溶媒之間極易發(fā)生乳化，水相和溶劑相難分離，應(yīng)提前去除。第十七頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五1、染菌的檢查與類型的判斷顯微鏡檢查法平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法肉湯培養(yǎng)檢查法發(fā)酵過程的異?，F(xiàn)象判斷發(fā)酵過程中，如何及早發(fā)現(xiàn)雜菌、及時處理是避免染菌造成嚴(yán)重?fù)p失的重要手段。要求用準(zhǔn)確、迅速的方法檢查出染菌類型及可能的染菌途徑。第十八頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五1）顯微鏡檢查法

采用簡單染色法或革蘭氏染色法，也可進(jìn)行芽孢和鞭毛染色。此法簡單、直接，雜菌污染需要繁殖一定數(shù)量才能鏡檢，檢出雜菌需要一定時間。2）平板劃線培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)檢查法

將待檢樣品在無菌平板上劃線，根據(jù)可能的污染類別分別于37℃、27℃培養(yǎng)，8h后觀察。噬菌體檢查可采用雙層平板法：噬菌斑12~20h第十九頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五3）肉湯培養(yǎng)檢查法將待檢樣品接入無菌肉湯培養(yǎng)基，根據(jù)可能的污染類別分別于37℃、27℃培養(yǎng)，8h后觀察。4）發(fā)酵過程的異?，F(xiàn)象觀察法溶解氧水平異常變化pH異常變化尾氣CO2異常變化

發(fā)酵液黏度、發(fā)酵液顏色及泡沫等異常變化第二十頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五12溶解氧水平異常變化染噬菌體異常發(fā)酵菌體濃度變化第二十一頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五通過傳感器或取樣分析，發(fā)現(xiàn)pH的變化和正常發(fā)酵有較大差別，一般有雜菌污染。污染產(chǎn)酸菌或利用碳源效率高生長較快的雜菌，會出現(xiàn)pH下降現(xiàn)象。pH異常變化第二十二頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五對于特定的發(fā)酵，工藝一定時，尾氣中CO2含量變化是有規(guī)律的。染菌后，培養(yǎng)基中糖的消耗速度發(fā)生變化，引起尾氣中CO2含量的異常變化。染雜菌，耗糖加快，尾氣中CO2含量增加；染噬菌體，耗糖減慢，尾氣中CO2含量減少。尾氣中CO2異常變化第二十三頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五2、污染原因分析

主要原因：

①

種子帶菌②無菌空氣帶菌③設(shè)備滲漏④滅菌不徹底

⑤操作失誤⑥技術(shù)管理不善第二十四頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五從污染時間看：早期污染可能與①②④⑤→接種操作不當(dāng)有關(guān)；后期污染可能與③⑤及中間補(bǔ)料有關(guān)。從染菌幅度看：各個發(fā)酵罐或多數(shù)發(fā)酵罐染菌，且所污染的是同一種雜菌，一般是空氣系統(tǒng)問題，若個別罐連續(xù)染菌，一般是設(shè)備問題。第二十五頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五從雜菌種類看：耐熱芽孢桿菌：與④有關(guān)。球菌、無芽孢桿菌：與①②③⑤有關(guān)。淺綠色菌落的雜菌：與水有關(guān)，即冷卻盤管滲漏。霉菌：與④⑤有關(guān)，即無菌室滅菌不徹底或操作問題。酵母菌：糖液滅菌不徹底或放置時間較長。第二十六頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五3、雜菌污染的途徑及其預(yù)防A、種子帶菌的防治

滅菌鍋滅菌徹底接種可靠：無菌室、設(shè)備及無菌操作可靠保藏可靠無菌室：

1）一般紫外線殺滅；

2）如有較多的細(xì)菌，用石碳酸或土霉素殺滅；

3）如有較多的霉菌，用制霉菌素殺滅；

4）如有噬菌體，用甲醛、雙氧水或高錳酸鉀等殺滅。

第二十七頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五B、過濾空氣帶菌的防治

從空氣的除菌凈化流程和設(shè)備的設(shè)計、過濾介質(zhì)的選用和填裝，以及過濾介質(zhì)的滅菌和管理等方面完善空氣凈化系統(tǒng)。1）正確選擇采氣口提高采氣口的位置或安裝前置粗過濾器，提高空壓機(jī)進(jìn)口空氣的潔凈度。2）設(shè)計合理的空氣預(yù)處理流程，盡可能減少過濾空氣的含油量和濕度，提高溫度，保持過濾介質(zhì)的干燥狀態(tài)。第二十八頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五3）設(shè)計和安裝合理的空氣過濾器，防止過濾器失效，選用除菌效率高的過濾介質(zhì)。C、設(shè)備的滲漏或“死角”造成的染菌及其防治滲漏染菌1）設(shè)備、管道、閥門在使用過程中，由于腐蝕、加工制做不良等原因形成微小漏孔后，發(fā)生滲漏而染菌。選用優(yōu)質(zhì)材料，并定期進(jìn)行檢查。2）冷卻用的夾套內(nèi)壁或蛇管的微小漏孔不易被發(fā)現(xiàn)，可以壓入弱堿性水，在罐內(nèi)可疑地方用浸濕酚酞指示劑的白布擦，有滲漏則白布變紅。第二十九頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五“死角”染菌由于操作、設(shè)備結(jié)構(gòu)或人為因素造成的屏障等原因，使蒸汽不能到達(dá)預(yù)定的滅菌部位或該部位的冷空氣不易在加熱過程中排凈，從而不能達(dá)到徹底滅菌要求的部位。往往是發(fā)酵罐和設(shè)備的盲端。第三十頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五1）發(fā)酵罐的“死角”

法蘭、內(nèi)襯、接口、表頭、罐內(nèi)部件及其支撐件如攪拌軸拉桿、聯(lián)軸器、冷卻盤管、擋板、空氣分布管及其支撐件?？冢喝肟祝ɑ蚴挚祝?、排風(fēng)管接口、燈孔、視鏡口、進(jìn)料管口。

發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢造成“死角”

消除方法：加強(qiáng)清洗并定期鏟除污垢；安裝放汽邊閥第三十一頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢造成“死角”

第三十二頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五法蘭連接不當(dāng)造成的“死角”第三十三頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五2）管道安裝不當(dāng)或配置不合理形成的“死角”

采用單獨(dú)的排氣、排水和排污管可有效防止染菌的發(fā)生。接種、取樣、補(bǔ)料和加消泡劑等的管道一般配置單獨(dú)的滅菌系統(tǒng)。法蘭的加工、焊接和安裝要符合滅菌要求，使銜接處管道暢通、光滑、密封性好，墊片和法蘭內(nèi)徑匹配，安裝時對準(zhǔn)中心。

第三十四頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五滅菌時蒸汽不易通達(dá)的“死角”及其消除方法第三十五頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五D、培養(yǎng)基與設(shè)備滅菌不徹底的防治原料性狀：大顆粒的原料過篩除去，淀粉質(zhì)原料、麩皮及黃豆餅攪拌均勻，防止結(jié)塊，并加入一定量的淀粉酶液化。實(shí)罐滅菌時要打開所有的液面下的進(jìn)氣閥和液面上的排氣閥及連接管、壓力表的邊閥，充分排除罐內(nèi)冷空氣，避免罐內(nèi)的溫度和壓力表指示不符，徹底滅菌。滅菌過程中產(chǎn)生的泡沫造成染菌：添加消泡劑，防止泡沫升頂。連續(xù)滅菌過程中，最好采用自動控制裝置，避免蒸汽壓力波動過大，溫度達(dá)不到要求。滅菌后期罐壓驟變滅菌不徹底，冷卻發(fā)酵罐過快，造成罐內(nèi)負(fù)壓，而使帶菌空氣從密封不嚴(yán)處進(jìn)入。冷卻發(fā)酵罐前，要通入無菌空氣。第三十六頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五E、操作不當(dāng)造成染菌（操作嚴(yán)格規(guī)范）

在放大移種或發(fā)酵過程中，罐內(nèi)壓力跌至零，外界空氣進(jìn)入染菌；泡沫頂蓋染菌；管道閥門操作不當(dāng)致使壓縮空氣的壓力突然下降，罐內(nèi)壓力高，發(fā)酵液倒流進(jìn)入液面以下管道及空氣濾器而染菌。F、噬菌體染菌及其防治

環(huán)境污染導(dǎo)致空氣傳播的噬菌體染菌。采用抗噬菌體菌種；提高空氣潔凈度，凈化生產(chǎn)環(huán)境。第三十七頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五采取哪些措施能夠保持無菌發(fā)酵？物料、培養(yǎng)基、中間補(bǔ)料要滅菌；發(fā)酵設(shè)備及輔助設(shè)備（空氣過濾裝置、各種發(fā)酵罐進(jìn)出口連接裝置）和管道要滅菌；好氣發(fā)酵通入的空氣要除菌；種子無污染；接種無菌操作過關(guān)；為了保持發(fā)酵的長期無菌狀態(tài)，需維持正壓。第三十八頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)干熱滅菌法濕熱滅菌法射線滅菌法化學(xué)藥劑滅菌法過濾除菌法火焰滅菌法第三十九頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五原理：利用電熱或紅外加熱到高溫殺死微生物。溫度、時間：160~170℃、1~2h。設(shè)備：恒溫電熱干燥箱。優(yōu)點(diǎn)：滅菌器皿保持干燥。適宜對象：要求保持干燥的器具和材料。如培養(yǎng)皿、移液管等。一、干熱滅菌法第四十頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五原理：利用高溫氺蒸汽殺死微生物。溫度、時間：121℃、0.5h。設(shè)備：高壓蒸汽滅菌鍋。優(yōu)點(diǎn)：滅菌徹底。適宜對象：培養(yǎng)基、玻璃器皿、無菌水、緩沖液、金屬器具等。二、濕熱滅菌法第四十一頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五原理：利用紫外線、高能電磁波、或放射性物質(zhì)產(chǎn)生的高能粒子殺死微生物。時間：10～50s

。設(shè)備：紫外燈、粒子發(fā)射儀等。缺點(diǎn)：滅菌不徹底。適宜對象：物體表面、超凈臺及培養(yǎng)室等環(huán)境滅菌。三、射線滅菌法第四十二頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五原理：利用化學(xué)藥劑與微生物發(fā)生反應(yīng)殺死微生物。藥劑：甲醛、漂白粉、高錳酸鉀、環(huán)氧乙烷及季銨鹽（新潔爾滅）缺點(diǎn)：不能對培養(yǎng)基滅菌。適宜對象：發(fā)酵工廠環(huán)境滅菌。四、化學(xué)藥劑滅菌法第四十三頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五原理：利用過濾方法阻留微生物以達(dá)到除菌的目的。適宜對象：不耐高溫的液體培養(yǎng)基組分和空氣過濾除菌。五、過濾滅菌法第四十四頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五原理：利用火焰直接殺死微生物以達(dá)到除菌的目的。優(yōu)點(diǎn)：方法簡單，滅菌徹底。適宜對象：金屬器具（接種針、接種環(huán)、接種鏟、小刀及鑷子）和玻璃器具滅菌。六、火焰滅菌法第四十五頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基及設(shè)備管道滅菌

一、濕熱滅菌原理

二、分批滅菌（實(shí)罐滅菌）三、連續(xù)滅菌（連消）四、分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較五、發(fā)酵培養(yǎng)基及設(shè)備管道滅菌技術(shù)

第四十六頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五1、微生物熱阻2、微生物熱死定律：對數(shù)殘留定律3、非對數(shù)殘留定律4、滅菌溫度和時間的選擇5、影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素一、濕熱滅菌原理第四十七頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五1、熱阻

定義：微生物對熱的抵抗力稱為熱阻，指微生物在某一特定條件下（主要是溫度）的致死時間。相對熱阻：某一微生物在某一條件下的致死時間與另一微生物在相同條件下的致死時間比。致死溫度：殺死微生物的極限溫度。致死時間：在致死溫度下，殺死全部微生物所需要的時間。一般微生物的營養(yǎng)細(xì)胞60℃加熱10min全部死亡，芽孢100℃加熱數(shù)分鐘甚至數(shù)小時才能被殺死。第四十八頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五2.對數(shù)殘留定律

在一定溫度下，微生物受熱致死遵循分子反應(yīng)速度理論，微生物受熱死亡的速率-dN/dt與任何瞬間殘留的活菌數(shù)N成正比，即

式中：

N:殘留活菌數(shù)，個；N0:開始滅菌時的活菌數(shù)，個；

Nt:經(jīng)過t時間滅菌后的活菌數(shù)，個；t：受熱時間，min；

k：比死亡速率常數(shù)（滅菌速率常數(shù)），min-1

DN/dt:活菌數(shù)瞬時變化速率，及死亡速率。第四十九頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五計算滅菌的基本公式：滅菌時間取決于：污染程度（N0）滅菌程度（Nt）殘留菌數(shù)

k值由上式可知：當(dāng)Nt=0時，t=∞，既無意義，也不可能。一般采用Nt=0.001，即1000次滅菌中只有一次失敗。第五十頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五判斷微生物受熱死亡難易程度的基本依據(jù)。不同微生物在相同溫度下的k值是不同的，k值愈小，則此微生物愈耐熱，熱阻愈大。（k↓，熱阻↑,滅菌t↑）比死亡速率k將存活率Nt/N0對時間t在半對數(shù)坐標(biāo)上作圖，可以得到一條直線，其斜率的絕對值即比死亡速率

k。第五十一頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五大腸桿菌在不同溫度下的殘留曲線第五十二頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五3、非對數(shù)殘留定律

雜實(shí)際過程中，某些微生物受熱死亡的速率不符合對數(shù)殘留定律，如一些微生物芽孢。

將存活率Nt/N0對時間t在半對數(shù)坐標(biāo)上作圖，可以得到殘留曲線，而不是一條直線。呈現(xiàn)這種熱死亡非對數(shù)動力學(xué)行為的主要是芽孢，可以最具代表性的“菌體循序死亡模型”來描述。第五十三頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在不同溫度下的死亡曲線

第五十四頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五

kRksNRNsNDdNR/dt=-kRNRdNs/dt=kRNR-ksNs→Nt/N0=KR/(kR-kS)[ekst-ks/kRe-kRt]

式中NR：耐熱性活芽孢數(shù)；Ns：敏感性活芽孢數(shù)

ND：死亡的芽孢數(shù)；kR：耐熱性芽孢的比死亡速率；

ks：敏感性芽孢的比死亡速率；

N0：初始活芽孢數(shù)。菌體循序死亡模型第五十五頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五培養(yǎng)基中含有大量的不耐熱的微生物和相當(dāng)數(shù)量的耐熱性微生物時的滅菌殘留曲線

。

在溫度T相同時，對數(shù)與非對數(shù)定律的滅菌時間t則不同。第五十六頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五4、滅菌溫度和時間的選擇

微生物的受熱死亡屬于單分子反應(yīng)，其滅菌速率常數(shù)k與溫度之間的關(guān)系可用阿累尼烏斯方程表示：

k=Aexp(-△E/RT)

式中：A為阿累尼烏斯常數(shù)，s-1；

k為滅菌速度常數(shù)；

T為熱力學(xué)溫度，K；

R為氣體常數(shù)，8.314J/(mol●K)；△E為微生物死亡活化能，J/mol。第五十七頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五滅菌過程中培養(yǎng)物質(zhì)受熱破壞也可看作一級反應(yīng)：式中C：對熱不穩(wěn)定物質(zhì)的濃度，mol/L；

t：分解反應(yīng)時間,s；k’：分解速度常數(shù),s-1。k’的變化也遵循阿累尼烏斯方程：

都與相應(yīng)的活化能及T有關(guān)第五十八頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五

當(dāng)溫度從T1→T2㏑(k2/k1)/㏑(k2’/k1’)=ΔE/ΔE’>1(∵ΔE>ΔE’即殺死微生物的活化能大于成分分解活化能)

∴隨著T上升，菌死亡速率增加倍數(shù)大于培養(yǎng)基成分分解速率增加倍數(shù)，故一般選擇高溫快速滅菌。第五十九頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五5.影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素

1）培養(yǎng)基成分油脂、糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)、高濃度有機(jī)物等可以增加微生物的耐熱性；低濃度（1%-2%）NaCl對微生物有保護(hù)作用，隨著濃度增加，保護(hù)作用減弱，當(dāng)濃度達(dá)8%-10%以上，則減弱微生物的耐熱性。第六十頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五2）pH：

pH6.0-8.0，微生物最耐熱，pH<6.0，H+易滲入微生物細(xì)胞內(nèi)，改變細(xì)胞的生理反應(yīng)促使其死亡?！嗯囵B(yǎng)基pH愈低，滅菌所需時間愈短。3）培養(yǎng)基的物理狀態(tài)

固體培養(yǎng)基的滅菌時間比液體的（對流作用）要長。相同溫度下，固體培養(yǎng)基的滅菌時間比液體培養(yǎng)基的滅菌時間要長2~3倍。第六十一頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五4）泡沫泡沫中的空氣形成隔熱層，對滅菌極為不利，可加入少量消泡劑。5）培養(yǎng)基中的微生物數(shù)量

培養(yǎng)基中微生物的數(shù)量與滅菌時間呈正比。天然基質(zhì)培養(yǎng)基、營養(yǎng)豐富或變質(zhì)的原料中含菌較多。第六十二頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五二、分批滅菌（實(shí)罐滅菌）定義：分批滅菌就是將配制好的培養(yǎng)基放入發(fā)酵罐或其他裝置中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設(shè)備一起進(jìn)行滅菌的操作過程，也稱為實(shí)罐滅菌。優(yōu)點(diǎn)：不需要專門的滅菌設(shè)備，投資少，設(shè)備簡單，滅菌效果可靠，對蒸汽的要求較低。第六十三頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五用空氣過濾器滅菌并用空氣吹干夾套或蛇管排冷水，開啟排氣管閥，空氣管通蒸汽，也可夾套內(nèi)通蒸汽達(dá)70℃左右取樣管放料管通蒸汽120℃，1×105pa保溫保溫階段，凡液面以下各管道都應(yīng)通蒸汽，液面上其余各管道則應(yīng)排蒸汽，不留死角，維持壓力、溫度恒定罐壓接近空氣壓力向罐內(nèi)通無菌空氣保溫結(jié)束，依次關(guān)閉各排汽、進(jìn)汽閥門夾套或蛇管中通冷水培養(yǎng)基降溫到所需溫度

1.滅菌工藝過程第六十四頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五分批滅菌包括升溫、保溫和冷卻三個階段。升溫、冷卻兩階段也有一定的滅菌效果，考慮到滅菌的可靠性主要在保溫階段進(jìn)行，故可以簡單地利用式

㏑(Nt/N0)=-kt

來粗略估算滅菌所需時間。2.滅菌時間的估算第六十五頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五例1：有一發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，在1210C溫度下實(shí)罐滅菌，原污染程度為每1ml有2×105個耐熱細(xì)菌芽孢，已知1210C時滅菌速度常數(shù)k=1.8min-1，求滅菌失敗機(jī)率為0.001時所需時間。

解：N0=40×106×2×105=8×1012(個)Nt=0.001(個)k=1.8(min-1)

㏑(Nt/N0)=-kt

t=2.303/k[lg(N0/Nt)]=2.303/1.8[lg(8×1015)]=20.34(min)由于升溫階段就有部分菌被殺滅，特別是當(dāng)培養(yǎng)基加熱至1000C以上，這個作用較為顯著，實(shí)際保溫階段時間比計算值要短。

第六十六頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五三、連續(xù)滅菌（連消）定義：連續(xù)滅菌就是將配制耗的培養(yǎng)基向發(fā)酵罐等培養(yǎng)裝置輸送的同時進(jìn)行加熱、保溫和冷卻等滅菌操作過程。優(yōu)點(diǎn)：可以在比分批滅菌更高的溫度下滅菌，保溫時間很短，減少營養(yǎng)物的破壞，提高發(fā)酵產(chǎn)率。注意：連續(xù)滅菌前要進(jìn)行空罐滅菌，加熱器、維持罐及冷卻器也應(yīng)先進(jìn)行滅菌。第六十七頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五1、工藝流程噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程噴射加熱連續(xù)滅菌流程薄板式換熱器連續(xù)滅菌流程2、滅菌時間的計算

㏑(Ct/C0)=－ktt=2.303/k[lg(C0/Ct)]

式中：C0、Ct分別為單位體積培養(yǎng)基滅菌前、后的含菌數(shù)。第六十八頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五例2．某發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，采用連續(xù)滅菌，滅菌溫度為1310C，原污染程度為每1ml含有2×105個雜菌，已知1310C時滅菌速度常數(shù)為15min-1，求滅菌所需的維持時間。連續(xù)滅菌時間的估算解：C0=2×105(個/ml)Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(個/ml)t=2.303/k[lg(C0/Ct)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]=2.37min第六十九頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程維持8~25min預(yù)加熱110~130℃第七十頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五維持管子長度保證保溫時間急速升溫急速冷卻冷卻段加熱段第七十一頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五四、分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較

連續(xù)滅菌的優(yōu)點(diǎn)：（適用于大型罐）可采用高溫短時滅菌，營養(yǎng)成分破壞少，有利于提高發(fā)酵產(chǎn)率；發(fā)酵罐利用率高；蒸汽負(fù)荷均衡；采用板式換熱器時，可節(jié)約大量能量；適宜采用自動控制，勞動強(qiáng)度小；可實(shí)現(xiàn)將耐熱性物料和不耐熱性物料在不同溫度下分開滅菌，減少營養(yǎng)成分的破壞。第七十二頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五缺點(diǎn)：對小型罐無優(yōu)勢，不方便，對設(shè)備要求高；蒸汽波動時滅菌不徹底；當(dāng)培養(yǎng)基中含有固體顆粒或有較多泡沫時，以分批滅菌好，防止滅菌不徹底。

第七十三頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五五、發(fā)酵培養(yǎng)基及設(shè)備管道滅菌技術(shù)1、種子罐、發(fā)酵罐、計量罐、補(bǔ)料罐等的空罐滅菌及管道滅菌2、空氣總過濾器和分過濾器滅菌3、種子培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌4、發(fā)酵培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌5、發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)滅菌6、補(bǔ)料實(shí)罐滅菌第七十四頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五1、種子罐、發(fā)酵罐、計量罐、補(bǔ)料罐等的

空罐滅菌及管道滅菌從有關(guān)管道通入蒸汽，使罐內(nèi)蒸汽壓力達(dá)0.147MPa，維持45min。滅菌過程中，液位以上的閥門和邊閥門打開排氣，滅菌完畢后關(guān)閉，待罐內(nèi)壓力低于空氣過濾器壓力時，通入無菌空氣保壓0.098MPa。第七十五頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五2、空氣總過濾器和分過濾器滅菌排出過濾器中的空氣，從過濾器上部通入蒸汽，并從上下排氣口排蒸汽，維持壓力0.147MPa

滅菌2h。滅菌完畢，通入壓縮空氣吹干。第七十六頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五3、種子培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌從夾層通入蒸汽間接加熱至80℃

，再從取樣管、進(jìn)風(fēng)管、接種管等液面以下的閥門通入蒸汽，進(jìn)行直接加熱。同時，關(guān)閉夾層蒸汽進(jìn)口閥門，升溫至121℃

，維持30min。期間，所有液面以上的閥門保持一定時間的排蒸汽狀態(tài)。第七十七頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五4、發(fā)酵培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌從夾層或盤管式熱交換器通入蒸汽，間接加熱至90℃

，關(guān)閉夾層或盤管蒸汽；從取樣管、進(jìn)風(fēng)管、放料管等液面以下的閥門通入蒸汽，直接加熱至121℃

，維持30min；期間，所有液面以上的閥門保持一定時間的排蒸汽狀態(tài)。第七十八頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五5、發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)滅菌一般培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌采用滅菌溫度為130℃

，維持5min。根據(jù)料液不同而異，淀粉料液為121℃

，維持5~10min。尿素溶液滅菌為105℃

，維持5min。6、補(bǔ)料實(shí)罐滅菌第七十九頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五第五節(jié)空氣除菌

一、概述二、空氣過濾除菌流程三、空氣預(yù)處理四、空氣預(yù)處理流程設(shè)計應(yīng)用舉例五、空氣過濾介質(zhì)六、空氣過濾除菌原理七、提高過濾除菌效率的措施第八十頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五一、概述空氣除菌的必要性

以一個50m3的發(fā)酵罐為例，若裝料系數(shù)為0.7，要求每立方米發(fā)酵液每分鐘通氣0.8m3，培養(yǎng)周期170h，那么每個周期需通氣量2.86×105m3(50×0.7×0.8×170×60)，而每立方米大氣中約有103-104個微生物。

空氣帶菌是發(fā)酵染菌的主要原因之一。第八十一頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五空氣除菌方法輻射殺菌：超聲波、高能陰極射線，x射線、β射線、γ射線、紫外線(2265?~3287?)加熱殺菌：加熱方法可用蒸汽、電和空氣壓縮機(jī)產(chǎn)生的熱量靜電除菌：常用于潔凈工作臺、潔凈工作室所需無菌無塵空氣的第一次除塵，配合高效過濾器使用。過濾除菌：采用定期滅菌的介質(zhì)來阻截流過的空氣所含的微生物而取得無菌空氣。常用的過濾介質(zhì)有棉花、活性炭、玻璃纖維、有機(jī)合成纖維、有機(jī)和無機(jī)燒結(jié)材料等等。第八十二頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五第八十三頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五二、空氣過濾除菌流程空氣過濾除菌：

采用定期滅菌的介質(zhì)來阻截流過的空氣中所含微生物而制得無菌壓縮空氣。過濾介質(zhì)：

棉花、活性炭、玻璃纖維、有機(jī)合成纖維、有機(jī)或無機(jī)燒結(jié)材料等。第八十四頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五流程主要設(shè)備：空氣壓縮機(jī)、空氣過濾器

附屬設(shè)備：粗過濾器、氣液分離器、空氣貯罐、空氣冷卻器第八十五頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五空氣過濾除菌的一般流程：前置空氣過濾器進(jìn)行粗濾空壓機(jī)升壓一級冷凝器對壓縮空氣降溫二級甚至多級冷凝器降溫除水、除油空氣加熱器降低濕度空氣儲罐穩(wěn)壓空氣過濾器除菌無菌空氣進(jìn)入發(fā)酵罐。1、對空氣過濾除菌流程的要求第八十六頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五流程的制定應(yīng)根據(jù)所在地的地理、氣候環(huán)境和設(shè)備條件綜合考慮環(huán)境污染比較嚴(yán)重的地方，要考慮改變吸風(fēng)的條件（升高10米，大氣中的微生物下降一個數(shù)量級）；在溫暖潮濕的南方，要加強(qiáng)除水設(shè)施；壓縮機(jī)耗油嚴(yán)重的設(shè)備流程中則要加強(qiáng)消除油霧的污染，也可采用無油潤滑的往復(fù)式壓縮機(jī)；往復(fù)式壓縮機(jī)，要配備前置粗過濾器及空氣貯罐。通常要求壓縮空氣的相對濕度Φ=50%~60%時通過過濾器為好。第八十七頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五2、空氣除菌流程的分析空氣除菌系統(tǒng)包括：冷卻、分離油水、加熱、過濾幾種典型的設(shè)備流程兩級冷卻、加熱除菌流程冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程高效前置過濾空氣除菌流程將空氣冷卻至露點(diǎn)以上的流程利用熱空氣加熱冷空氣流程一次冷卻和析水的空氣過濾流程第八十八頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五

兩級冷卻、加熱除菌流程圖1-粗過濾器；2-空壓機(jī)；3-貯罐；4，6-冷卻器；5-旋風(fēng)分離器；7-絲網(wǎng)分離器；8-加熱器；9-過濾器30~35℃20~25℃100%50~60%第八十九頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五

冷熱空氣直接混合式空氣除菌流程圖

1-粗過濾器；2-壓縮機(jī)；3-貯罐；

4-冷卻器；5-絲網(wǎng)分離器；6-過濾器冷熱空氣直接混合第九十頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五

利用熱空氣加熱冷空氣的流程示意圖1-高空采風(fēng)；2-粗過濾器；3-壓縮機(jī)；4-熱交換器；5-冷卻器；6，7-析水器；8-空氣總過濾器；9-空氣分過濾器第九十一頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五

將空氣冷卻至露點(diǎn)以上的流程1－高空采風(fēng)；2－粗過濾器；3－壓縮機(jī)；4－冷卻器；5－冷卻器；6－空氣總過濾器；7－空氣分過濾器第九十二頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五

高效前置過濾空氣除菌流程圖1—高效前置過濾器；2—壓縮機(jī)；3—貯罐；4—冷卻器；5—絲網(wǎng)分離器；6—加熱器；7—過濾器第九十三頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五

一次冷卻和析水的空氣過濾流程示意圖1－高空采風(fēng)；2－粗過濾器；3－壓縮機(jī)；4－冷卻器；5，6—析水器；7—貯罐；8—加熱器；9—空氣總過濾器；10—空氣分過濾器第九十四頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五三、空氣預(yù)處理原理：除塵(外源空氣的前處理)：防塞，提高過濾效率和濾器壽命；措施：建吸風(fēng)塔、粗過濾器、高效前置過濾器降溫：防燒傷介質(zhì)及水分蒸發(fā)嚴(yán)重，對發(fā)酵不利除油、除水：防塞（因油膜堵），防止過濾器長菌堵塞（因水滴）加熱：保持相對濕度穩(wěn)壓：防止壓力波動，貯罐第九十五頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五目的：提高空氣壓縮前的潔凈度，減小壓縮機(jī)的磨損和主過濾器的負(fù)荷。措施：1）建吸風(fēng)塔，提高空氣吸氣口的位置；

2）設(shè)置粗過濾器，濾去大塵埃和菌類。粗過濾器：

布袋過濾器、填料過濾器、油浴洗滌和水霧除塵裝置等。1、外源空氣的前過程第九十六頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五2、空氣壓縮和壓縮空氣的冷卻

1）目的：為了克服輸送過程中過濾介質(zhì)等的阻力。2）設(shè)備：

渦輪式空壓機(jī)、往復(fù)式空壓機(jī)

空氣凈壓縮后，溫度會顯著升高，壓縮比愈高，溫度也愈高。第九十七頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五空氣壓縮后溫度的計算：空氣的壓縮過程可看作絕熱過程，故壓縮后的空氣溫度與被壓縮的程度有關(guān)：

T2=T1(P2/P1)(k-1)/k

式中T1,T2——壓縮前后空氣的絕對溫度，KP1,P2——

壓縮前后空氣的絕對壓強(qiáng)，Pak——絕熱指數(shù)，空氣為1.4

若壓縮為多變過程，則可用多變指數(shù)m（對于空氣m=1.2-1.3）代替絕熱指數(shù)k。第九十八頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五例3：20oC的大氣被壓縮至表壓2.5kg/cm2時溫度是多少？解：T1=20+273=293kP2/P1=（2.5+1.033）/1.033=3.42m=1.3T2=T1(P2/P1)(m-1)/m=293×3.420.3/1.3=389k∴t2=389-273=116oC第九十九頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五高溫壓縮空氣需要冷卻降溫防止引起過濾介質(zhì)的碳化或燃燒；防止引起菌種損傷；減小發(fā)酵罐降溫負(fù)荷。第一百頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五3、壓縮空氣冷卻后的除水、除油經(jīng)冷卻降溫的壓縮空氣相對濕度增大，會析出水來，使過濾介質(zhì)受潮失效。采用含油空壓機(jī)壓縮空氣時，會不可避免地夾帶潤滑油。

需要除水、除油。第一百零一頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五1）幾個與濕空氣相關(guān)的概念空氣的絕對濕度：1m3

濕空氣中含有的水蒸氣絕對量(kg)空氣的相對濕度（Φ）：空氣的絕對濕度與同溫度下飽和絕對濕度之比值或者空氣中水蒸汽分壓與同溫度時的飽和水蒸汽壓之比值，稱為空氣的相對濕度。

Φ=Pw/Ps

式中

Pw——空氣中水蒸氣分壓，

Pa

Ps——同溫度下水的飽和蒸氣壓，Pa，

它可由各類手冊中查到?？諝獾臐窈浚╔）：1kg干空氣中含有的水汽量

（kg/kg干空氣）第一百零二頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五1）幾個與濕空氣相關(guān)的概念A(yù)、空氣的絕對濕度：

1m3

濕空氣中含有的水蒸氣絕對量(kg)。B、空氣的相對濕度（Φ）：

空氣的絕對濕度與同溫度下飽和絕對濕度之比值或空氣中水蒸汽分壓與同溫度時的飽和水蒸汽壓之比稱為空氣的相對濕度。

Φ=Pw/Ps

式中：Pw——空氣中水蒸氣分壓，Pa；

Ps——同溫度下水的飽和蒸氣壓，Pa；可由各類手冊中查到。第一百零三頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五C、空氣的濕含量（X）空氣的濕含量是指1kg干空氣中含有的水汽量。

設(shè)Ggkg干空氣中含Gwkg水蒸汽時，則

X=Gw/Gg

又Pw/Pg=nw/ng=(Gw/Mw)/(Gg/Mg)=(Gw/Gg)·(Mg/Mw)

（Mw，Mg分別為水和空氣的分子量）∴X=Gw/Gg=(PwMw)/(PgMg)=(18/28.94)·(Pw/Pg)X=0.622Pw/Pg

X=0.622Pw/(P-Pw)

（4-1）第一百零四頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五2）Φ與X的關(guān)系

將ΦPs=Pw代入式4-1中得

X=0.622ΦPs/（P-ΦPs）所以，已知某一溫度T時Φ值，便可求得X。①當(dāng)X一定時，T1→T2，導(dǎo)致Φ1→Φ2，則X1=0.622Φ1Ps1/(P1-Φ1Ps1)X2=0.622Φ2Ps2/(P2-Φ2Ps2)∵X1=X2∴Φ2=Φ1(PS1/PS2)(P2/P1)

（式4-2）第一百零五頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五②當(dāng)X發(fā)生變化，即有水析出時，X降低，此時Φ2=100%，

定義：當(dāng)Ф=1時，空氣中水蒸氣已飽和，此時溫度稱為露點(diǎn)Td。當(dāng)T<Td時，有水析出，X↓。當(dāng)ΔX=0時，壓縮過程中，隨著T↑，Ps↑，P↑，Ф↓；降溫過程中，隨著T↓，Ps↓，P一定，Ф↑。第一百零六頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五壓縮空氣冷卻到一定溫度，除去油水后，空氣的相對濕度會達(dá)到100%。溫度稍一下降，還會析出水來。還需加熱，以降低空氣的相對濕度，達(dá)到50~60%?？諌簷C(jī)出來的空氣是脈沖式的，安裝空氣儲罐可消除，維持罐亞穩(wěn)定，還可使剩余液滴沉降除去。3）空氣的再加熱和穩(wěn)定

第一百零七頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五預(yù)處理流程設(shè)計的簡繁關(guān)鍵：去濕問題四、空氣預(yù)處理流程設(shè)計第一百零八頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五思考題壓縮空氣的露點(diǎn)比原始空氣的露點(diǎn)更高，即更易析出水分，且壓縮比愈大，露點(diǎn)愈高，為什么？第一百零九頁，共一百二十三頁，編輯于2023年，星期五