發(fā)酵工業(yè)微生物菌種制備與培養(yǎng)基

發(fā)酵工業(yè)微生物菌種制備與培養(yǎng)基第一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五二：工業(yè)化菌種的要求能夠利用廉價的原料，簡單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產(chǎn)物有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的可操作性要強(qiáng)遺傳性能要相對穩(wěn)定不易感染它種微生物或噬菌體產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必須考慮（在分類學(xué)上最好與致病菌無關(guān)）生產(chǎn)特性要符合工藝要求第二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

由于發(fā)酵工程本身的發(fā)展以及遺傳工程的介入，藻類（alga）、病毒（virus）等也正在逐步地變?yōu)楣I(yè)生產(chǎn)用的生物。

盡管如此，目前人們對微生物的認(rèn)識還是十分不夠的。已經(jīng)初步研究的不超過自然界微生物總量的10%左右。

微生物的代謝產(chǎn)物據(jù)統(tǒng)計(jì)已超過一千三百多種，而大規(guī)模生產(chǎn)的不超過一百多種；

微生物酶有近千種，而在工業(yè)上利用的不過四五十種?？梢姖摿κ呛艽蟮?。

在工業(yè)生產(chǎn)中常用的微生物主要有細(xì)菌、酵母菌、霉菌和放線菌。三、工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物第三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五1、細(xì)菌（bacteria）：可粗分為6種類型，即細(xì)菌（狹義）、放線菌、螺旋體、支原體、立克次氏體和衣原體。是一類形狀細(xì)短，結(jié)構(gòu)簡單，多以二分裂方式進(jìn)行繁殖的原核生物，是在自然界分布最廣、個體數(shù)量最多的有機(jī)體，是大自然物質(zhì)循環(huán)的主要參與者。根據(jù)形狀分為三類，即：球菌、桿菌和螺形菌。按細(xì)菌的生活方式來分類，分為兩大類：自養(yǎng)菌和異養(yǎng)菌，其中異養(yǎng)菌包括腐生菌和寄生菌。按細(xì)菌對氧氣的需求來分類，可分為需氧（完全需氧和微需氧）和厭氧（不完全厭氧、有氧耐受和完全厭氧）細(xì)菌。

第四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五工業(yè)生產(chǎn)常用的細(xì)菌有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)

乳酸桿菌(Lactobacilluslactics)

醋酸桿菌(Acetobacter)

棒狀桿菌(Corynebacterium)

短桿菌(Brevibacterium)

用于生產(chǎn)：生產(chǎn)淀粉酶(amylase）蛋白酶（proteinase）乳酸(lacticacid)

醋酸(aceticacid)

氨基酸(aminoacid)

肌苷酸(inosinicacid)

第五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

2、酵母菌（yeast）

酵母菌為單細(xì)胞真核生物（unicellulareukaryote），在自然界中普遍存在，主要分布于含糖質(zhì)較多的的酸性環(huán)境中，如水果、蔬菜、花蜜（nectar）和植物葉子上，以及果園土壤中。石油酵母（petroleumyeast）較多地分布在油田周圍的土壤中。

酵母菌大多為腐生，常以單個細(xì)胞存在，以發(fā)芽形式進(jìn)行繁殖。母細(xì)胞體積長到一定程度時就開始發(fā)芽。芽長大的同時母細(xì)胞縮小，在母子細(xì)胞間形成隔膜，最后形成同樣大小的母細(xì)胞。如果子芽不與母細(xì)胞脫離就形成鏈狀細(xì)胞，稱為假菌絲(pseudomycelium)。

工業(yè)上用的酵母菌有：啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、假絲酵母(Candida)、類酵母(Saccharomycodes)等，用于釀酒(Brewing)、制造面包、制造低凝固點(diǎn)石油、生產(chǎn)脂肪酶（lipase），以及生產(chǎn)可食用、藥用和飼料用酵母菌體蛋白等。第六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

3、

霉菌（mould）

霉菌不是一個分類學(xué)上的名詞。凡生長在營養(yǎng)基質(zhì)上形成絨毛狀、網(wǎng)狀或絮狀菌絲的真菌(fungi)統(tǒng)稱為霉菌。霉菌在自然界分布很廣，大量存在于土壤、空氣、水和生物體內(nèi)外等處。它喜歡偏酸性環(huán)境，大多數(shù)為好氧性(aerobiotic)，多腐生，少數(shù)寄生。霉菌的繁殖能力很強(qiáng)，它以無性孢子和有性孢子進(jìn)行繁殖，大多以無性孢子繁殖為主。第七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

生長方式是菌絲末端的伸長和頂端分支，彼此交錯呈網(wǎng)狀。菌絲的長度既受遺傳性的控制，又受環(huán)境的影響，其分支數(shù)量取決于環(huán)境條件。菌絲或呈分散生長，或呈菌絲團(tuán)狀生長。工業(yè)上常用的霉菌有：藻狀菌綱的根霉、毛霉、犁頭霉，子囊菌綱的紅曲霉，半知菌類的曲霉、青霉等；產(chǎn)品：酶制劑（enzymepreparation）、抗生素(antibiotic)、有機(jī)酸（organicacid）及甾體激素（steroidhormone）等。第八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

4、放線菌(Actinomycetes)

放線菌因菌落呈防線狀而得名。它是一個原核生物類群，在自然界中分布很廣，尤其在含有機(jī)質(zhì)豐富的微堿性土壤中較廣。大多腐生，少數(shù)寄生。放線菌主要以無性孢子進(jìn)行繁殖，也可借菌絲片段進(jìn)行繁殖。后一種繁殖方式見于液體沉浸培養(yǎng)（submergedcultures）中。其生長方式是菌絲末端伸長和分支，彼此交錯成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，成為菌絲體。菌絲長度既受遺傳性的控制，又與環(huán)境相關(guān)。

第九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五在液體沉浸培養(yǎng)中由于攪拌器（agitator）的作用，常常形成短的分支旺盛的菌絲體，或呈分散生長，或呈菌絲團(tuán)狀生長。它的最大經(jīng)濟(jì)價值在于能產(chǎn)生多種抗生素（antibiotics）。從微生物中發(fā)現(xiàn)的抗生素，有60%以上是放線菌產(chǎn)生的，如鏈霉素、紅霉素、金霉素、慶大霉素等。常用的放線菌主要來自以下幾個屬：鏈霉菌屬、小單孢菌屬和諾卡氏菌屬等。第十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

5、擔(dān)子菌（Basidiomycetes）：所謂的擔(dān)子菌就是人們通常所說的菇類(mushroom)生物。擔(dān)子菌資源的利用正愈來愈引起人們的重視，如多糖(polysaccharide)、抗癌(anticancer)藥物的開發(fā)。近幾年來，日本、美國的一些科學(xué)家對香菇的抗癌作用進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)香菇中的“1，2-β-葡萄糖苷酶”及兩種糖類物質(zhì)具有抗癌作用。第十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

6、藻類（alga）：培養(yǎng)螺旋藻，按干重計(jì)算每公頃可收獲60噸，而種植大豆每公頃才可獲4噸；從蛋白質(zhì)產(chǎn)率來看，螺旋藻是大豆28倍。培養(yǎng)珊列藻，從蛋白質(zhì)產(chǎn)率計(jì)算，每公頃珊列藻所得蛋白質(zhì)是小麥的20-35倍。此外，還可通過藻類將CO２轉(zhuǎn)變?yōu)槭?，培養(yǎng)單胞藻或其他藻類而獲得的石油，可占細(xì)胞干重得5%-50%,合成的油與重油相同，加工后可轉(zhuǎn)變汽油、煤油、和其他產(chǎn)品。有的國家已建立培植單胞藻的農(nóng)場，每年每公頃地培植的單胞藻暗5%干物質(zhì)為碳水化合物（石油）計(jì)算，可得60噸石油燃料。此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用，還可減輕因工業(yè)生產(chǎn)而大量排放CO２造成的溫室效應(yīng)。國外還有人從“藻類農(nóng)場”獲取氫能的報(bào)道，大量培養(yǎng)藻類，利用其光合放氫作用來取得氫能。第十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)

菌種的衰退、復(fù)壯與保藏

一、微生物菌種衰退的原因

1、原因一是菌種保藏不妥;

二是菌種生長的要求沒有得到滿足，或是遇到不利的條件，或是失去某些需要的條件；三是經(jīng)誘變獲得的新菌株發(fā)生回復(fù)突變，從而喪失新的特征的情況。連續(xù)傳代是菌種退化的直接原因。衰退菌株的特點(diǎn)：個體或群體特征發(fā)生變化；生產(chǎn)能力降低；代謝能力降低；發(fā)酵周期延長；抗不良環(huán)境能力降低。

第十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

2、防止菌種衰退的措施菌種的分離:。對于已衰退的菌株采用單細(xì)胞菌株分離的措施，即用稀釋平板法或用平板劃線法，以取得單細(xì)胞所長成的菌落（colony），再通過菌落和菌體的特征分析和性能測定，就可獲得具有原來形狀的菌株，甚至性能更好的菌株（strain）。

如果菌種已經(jīng)發(fā)生退化，產(chǎn)量下降，則要進(jìn)行分離復(fù)壯。第十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五如對芽孢桿菌(Bacillus)，可先將菌液用沸水處理幾分鐘，再用平板進(jìn)行分離，從所剩下的孢子中挑選出最優(yōu)的菌體。某些菌株即使進(jìn)行單細(xì)胞分離，仍不能達(dá)到復(fù)壯的效果，則可改變培養(yǎng)條件，達(dá)到復(fù)壯的目的。

如AT3.942棲土曲霉(Aspergillusterricola)的產(chǎn)孢子能力下降，可適當(dāng)提高培養(yǎng)溫度，恢復(fù)其能力。同時通過實(shí)驗(yàn)選擇一種有利于高產(chǎn)菌株而不利于低產(chǎn)菌株的培養(yǎng)條件。第十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五二菌種的復(fù)壯通過分離達(dá)到復(fù)壯:

在瓊脂平板劃線、涂布或與瓊脂培養(yǎng)基混合培養(yǎng)再分離，達(dá)到菌落純采用單細(xì)胞或單孢子分離法達(dá)到細(xì)胞純通過寄主體達(dá)到復(fù)壯:

將菌株接種到寄主細(xì)胞進(jìn)行繁殖達(dá)到復(fù)壯。第十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三

菌種保藏（strainpreservation）

基本原理：根據(jù)菌種的生理、生化特點(diǎn)，人工地創(chuàng)造條件，使菌種的代謝活動處于不活波狀態(tài)。要求：維持菌種的存活和減少菌種的變異，盡量使菌種保持原來優(yōu)良的生產(chǎn)性能。保藏時首先選擇優(yōu)良純菌種，最好是它們的休眠體如孢子（spore）、芽孢(gemma)等；其次是要創(chuàng)造一個有利于休眠的環(huán)境條件，如低溫、干燥、缺氧和缺乏營養(yǎng)物質(zhì)的，即可達(dá)到降低其代謝活動，延長其保存期的目的。

第十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五保存方法：

應(yīng)能較長期地保存原有菌種的優(yōu)良性能，使菌種穩(wěn)定，同時也要考慮到方法本身的經(jīng)濟(jì)簡便。不同的菌種有不同的保存方法，以便長期保藏。酵母菌：定期移植斜面低溫保藏法。也可采用石蠟油封保藏法。霉菌：沙土管保藏法。細(xì)菌和放線菌：一般細(xì)菌以采用冷凍干燥保藏法為佳。放線菌可用沙土或冷凍保藏法保藏。

保藏應(yīng)注意的問題：

菌體狀態(tài)：休眠體基質(zhì)：營養(yǎng)貧乏操作過程：不應(yīng)對細(xì)胞造成傷害第十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)菌株選育目的提高生產(chǎn)能力提高產(chǎn)品質(zhì)量開發(fā)新產(chǎn)品解決生產(chǎn)實(shí)際問題防止菌種退化第十九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五方法基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質(zhì)體融合、基因工程第二十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五自然狀態(tài)下，發(fā)生自然突變的機(jī)率為10-8-10-9自然突變有兩種情況：一種是我們生產(chǎn)上所不希望看到的，表現(xiàn)為菌株的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量的下降，這種突變成為負(fù)突變。另一種是我們生產(chǎn)上希望看到的，對生產(chǎn)有利，這種突變成為正突變。一、自然選育第二十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五自然選育操作步驟：一般習(xí)慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。單細(xì)胞(孢子)懸液的制備平板分離挑選單菌落(注意形態(tài)的觀察)發(fā)酵試驗(yàn)第二十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五二、誘變育種用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變進(jìn)行的篩選，稱為誘變育種誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑誘變劑物理：紫外，快中子化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍{第二十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五原種（出發(fā)菌株）純化斜面培養(yǎng)完全培養(yǎng)基同步培養(yǎng)離心洗滌玻璃珠震蕩分散過濾單細(xì)胞或孢子懸浮液

自然分離（對照液）活菌計(jì)數(shù)誘變處理誘變處理預(yù)備實(shí)驗(yàn)

處理液活菌計(jì)數(shù)平板分離

形態(tài)變異并計(jì)算其變異率斜面培養(yǎng)

初篩、復(fù)篩

自然分離和再復(fù)篩

保藏及擴(kuò)大試驗(yàn)誘變育種第二十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

第四節(jié)種子擴(kuò)大培養(yǎng)

一、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)1、提供相當(dāng)數(shù)量的代謝旺盛的種子。接種量大，發(fā)酵時間則短。

2、得到純而壯的培養(yǎng)物，還要獲得活力旺盛的、接種數(shù)量足夠的培養(yǎng)物。

不同產(chǎn)品的發(fā)酵，決定種子擴(kuò)大培養(yǎng)的級數(shù)。第二十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

第五節(jié)培養(yǎng)基及其制備

培養(yǎng)基是提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要的、按一定比例配制的的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基組成對菌體生長繁殖、產(chǎn)物的生物合成、產(chǎn)品的分離精致、產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量都有重要的影響。微生物的營養(yǎng)活動，是依靠向外界分泌大量的酶，將周圍環(huán)境中大分子的蛋白質(zhì)、糖類、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)分解成小分子化合物，在借助于細(xì)胞膜的滲透作用，吸收這些小分子營養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)的。第二十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

一、培養(yǎng)基的類型和用途天然培養(yǎng)基化學(xué)成分不清楚或化學(xué)成分不恒定的各種植物和動物組織或微生物的浸出物、水解液等物質(zhì)（例如牛肉膏、酵母膏、麥芽汁、蛋白胨等）合成培養(yǎng)基:

使用化學(xué)成分和數(shù)量完全了解的物質(zhì)配制而成的。使用于實(shí)驗(yàn)室范圍作有關(guān)營養(yǎng)、代謝、分類鑒定、生物測定及選育菌種、遺傳分析定量研究工作。半合成培養(yǎng)基：既含有天然成分又含有純化學(xué)試劑的培養(yǎng)基。第二十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（生物）鑒別培養(yǎng)基：培養(yǎng)基中加入能與某一菌的無色代謝物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑，從而用肉眼區(qū)別于該菌與其他菌。

選擇培養(yǎng)基：根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)要求或其對某化學(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基。

固體培養(yǎng)基：外觀呈固體的培養(yǎng)基。半固體培養(yǎng)基：凝固劑量低于正常量液體培養(yǎng)基：呈液體狀態(tài)的培養(yǎng)基。第二十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

孢子培養(yǎng)基：供制備孢子用的培養(yǎng)基?；|(zhì)濃度（有機(jī)氮）要低些，否則影響孢子的的形成。無機(jī)鹽要適量，否則影響孢子的數(shù)量和質(zhì)量。常用的有麩皮、大（小）米，無機(jī)鹽、蛋白胨等配制的瓊脂斜面培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：供孢子發(fā)芽和菌體生長用的培養(yǎng)基。為使培養(yǎng)的種子能較快適應(yīng)發(fā)酵罐內(nèi)的環(huán)境，在設(shè)計(jì)種子培養(yǎng)基時要考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基組成的內(nèi)在聯(lián)系。第二十九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五發(fā)酵培養(yǎng)基：

供菌體生長和合成大量代謝產(chǎn)物用的培養(yǎng)基。不同的菌體，不同的產(chǎn)品，對培養(yǎng)基的要求是不同的。不同的發(fā)酵產(chǎn)品，培養(yǎng)基的狀態(tài)、粘度、各成分的含量也是不同的。但是，基本的營養(yǎng)需求是一致。因此，應(yīng)根據(jù)不同的情況選擇發(fā)酵培養(yǎng)基。第三十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

二、發(fā)酵培養(yǎng)基選擇的應(yīng)遵循的原則：

1、提供合成微生物細(xì)胞和發(fā)酵產(chǎn)物的基本成分.2、有利于提高培養(yǎng)基中產(chǎn)物的濃度，以提高單位容積發(fā)酵罐的生產(chǎn)能力。

3、有利于提高產(chǎn)物的合成速度，縮短發(fā)酵周期.

第三十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五4、盡量減少副產(chǎn)物的形成，便于產(chǎn)物的分離純化5、原料價格低廉，質(zhì)量穩(wěn)定，取材容易。6、所用原料盡可能減少對發(fā)酵過程中通氣攪拌的影響，利于提高氧的利用率降低能耗。有利于產(chǎn)品的分離和純化，并盡可能減少產(chǎn)生“三廢”的物質(zhì)。另外，要考慮配比、滲透壓、PH、氧化還原等因素。第三十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

碳源：供給菌體生命活動所需的能量和構(gòu)成菌體細(xì)胞以及代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)。有糖類、脂肪、某些有機(jī)酸等等。氮源：主要構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，可分為有機(jī)氮源和無機(jī)氮源。功能：構(gòu)成菌體成分；作為酶的組成分或維持酶的活性；調(diào)節(jié)滲透壓、PH值、氧化還原電位等。

第二節(jié)工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基第三十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五無機(jī)鹽：鈣、鎂、硫、磷、鉀、鈉、氯、鋅、鈷、錳。特殊生長因子：其功能是構(gòu)成輔酶的組成分，促進(jìn)生命活動的進(jìn)行。如生物素、硫胺素、肌醇等，但需要量是極少的。水：體內(nèi)各種生化作用必須在水溶液中進(jìn)行。營養(yǎng)物質(zhì)必須溶解于水中，才能透過細(xì)胞膜被微生物利用。誘導(dǎo)劑、前體和促進(jìn)劑：胞外酶合成需要誘導(dǎo)物。第三十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五不同的發(fā)酵產(chǎn)物，不同的菌種所選擇的發(fā)酵培養(yǎng)基是不同的。白酒(chinesespirit)發(fā)酵：固體發(fā)酵培養(yǎng)基；果酒(fruitspirit)發(fā)酵：fruitjuiceorfruitsauce；啤酒(beer)發(fā)酵：麥芽汁(wort)液體培養(yǎng)基；酒精(alcohol)發(fā)酵：淀粉糖化醪(starchmash)；氨基酸(aminoacid)發(fā)酵：水解糖液加其他營養(yǎng)成分；檸檬酸(citricacid)發(fā)酵：淀粉液化醪(starchdextrinizatemash)；乳酸(lacticacid)發(fā)酵：淀粉糖化醪(starchmash)；甲烷(methane)發(fā)酵：復(fù)雜的有機(jī)廢物發(fā)酵；抗生素(antibiotic)發(fā)酵：淀粉糖化醪(starchmash)+豆餅粉+麩皮粉；第三十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五一、工業(yè)常用的碳源葡萄糖：純葡萄糖、水解淀粉乳糖：純?nèi)樘恰⑷榍宸鄣矸郏捍篼?、花生粉、燕麥粉、黑麥粉蔗糖：甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗紅糖、精白糖醋酸、乙醇、亞硫酸紙漿廢液、食品工廠的下腳等等。第三十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

糖蜜中主要含有蔗糖，總糖含量可達(dá)50%~70%。糖蜜分為甘蔗糖蜜(canemolasses)和甜菜糖蜜(beetmolasses)，二者在糖的含量和無機(jī)鹽的含量都有所不同，使用時應(yīng)注意。糖蜜常用在酵母和丙酮丁醇的生產(chǎn)中，抗生素等微生物工業(yè)也常用它作為碳源。酒精工業(yè)中若用糖蜜代甘薯粉，則可省去蒸煮、制曲、糖化等過程，簡化了酒精生產(chǎn)