埃博拉出血熱病毒的樣本采集運送和實驗室檢測

埃博拉出血熱病毒的樣本采集運送和實驗室檢測第一頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五埃博拉出血熱病毒的樣本采集、運送和實驗室檢測浙江省CDC盧亦愚2014年8月第二頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五主要內(nèi)容標本采集標本包裝與運送實驗室檢測第三頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五（一）標本采集第四頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五標本采集人員的防護按照2014年8月19日發(fā)布的《中國疾病預防控制中心關(guān)于埃博拉出血熱個人防護技術(shù)方案指南（第一版）（試行）》的要求，采樣人員應穿戴防護用品包括:一次性工作帽一次性防滲漏防護服防水靴（或者密閉式、防穿刺防水的鞋加穿一次性鞋套）防護眼罩或防護面屏醫(yī)用防護口罩（N95及以上）或全面型自吸過濾式呼吸器雙層一次性乳膠手套第五頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五標本采集人員的防護穿戴順序：步驟1：手衛(wèi)生步驟2：一次性工作帽（如需要）步驟3：醫(yī)用防護口罩（N95及以上）或全面型自吸過濾式呼吸器步驟4：防護眼罩或防護面屏，如選擇全面型自吸過濾式呼吸器時無需佩戴步驟5：里層一次性乳膠手套步驟6：一次性防滲漏防護服（必要時，可加穿防水圍裙）步驟7：外層一次性乳膠手套步驟8：防水靴或防水靴套（或者密閉式、防穿刺防水的鞋加穿一次性鞋套）第六頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五標本采集人員的防護脫摘順序：步驟1：外層一次性乳膠手套步驟2：防水靴或防水靴套（或者密閉式、防穿刺防水的鞋加穿一次性鞋套）步驟3：內(nèi)層手套消毒步驟4：一次性防滲漏防護服（需要時，先脫防水圍裙）步驟5：內(nèi)層手套消毒步驟6：防護眼罩或防護面屏步驟7：醫(yī)用防護口罩（N95及以上）或全面型自吸過濾式呼吸器步驟8：一次性工作帽（如需要）步驟9：里層一次性乳膠手套步驟10：手衛(wèi)生第七頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五標本采集按照《埃博拉出血熱防控方案（第二版）》規(guī)定，定點醫(yī)院負責病例的標本采集工作根據(jù)流行病學史、癥狀等判別結(jié)果，采集留觀病例、疑似病例和確診病例的標本目前僅需采集血液標本，大小便、唾液和組織也可用于檢測第八頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五標本采集用分離膠無菌真空促凝管采集靜脈血，每管3mL，標記后4℃保存，填寫標本采集登記表留觀病例、疑似病例采集4管，其中2管盡快送省疾控中心實驗室，2管保存于樣本采集單位，待排除埃博拉病毒感染后用于其它病原體的篩查第九頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五（二）標本包裝與運送第十頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五標本包裝、運送按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定》要求運輸至具有從事埃博拉病毒相關(guān)實驗活動資質(zhì)的實驗室標本應當置于符合國際民航組織規(guī)定的A類包裝運輸材料之中低溫冷藏運輸，避免反復凍融第十一頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五標本包裝、運送A類包裝，符合UN2814要求，按照三重包裝系統(tǒng)包裝：第一層包裝（可密封樣本袋、50mL離心管等）；第二層安全殼容器（防水、防漏）；外層運輸包裝組成樣本袋放入防水防漏的第二層安全殼容器中，為降低破碎或泄漏的風險，用吸水紙等填充物固定標本袋。安全殼容器和外包裝之間放冰袋不要打開采集管或分裝樣本不要離心分離血清第十二頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五標本包裝、運送第十三頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五（三）實驗室檢測第十四頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五實驗室檢測的生物安全要求實驗室病原學和血清學檢測相關(guān)活動嚴格按照《人間傳染的病原微生物名錄》的要求，在相應的生物安全級別實驗室開展。病毒培養(yǎng)在BSL-4實驗室動物感染實驗在ABSL-4實驗室未經(jīng)培養(yǎng)的感染材料的操作在BSL-3實驗室滅活材料的操作在BSL-2實驗室無感染性材料的操作在BSL-1實驗室中進行第十五頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五實驗人員個人防護口罩、帽子、防滲漏防護服、乳膠手套、高筒鞋套、防護面罩（正壓頭盔）等；注：手套、防護服大小要合適，檢查有無破漏；手套的量要充足，滿足隨時更換。所有涉及感染性材料的操作均應在BSL-3實驗室二級生物安全柜內(nèi)進行；方便取用的消毒劑（0.5%次氯酸鈉溶液、75%酒精等），空間噴霧消毒設備（使用過氧乙酸，過氧化氫等）。第十六頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五埃博拉出血熱病毒實驗室檢測實驗室檢測（1）病毒抗原陽性（2）血清特異性IgM抗體陽性（3）恢復期血清特異性IgG抗體滴度比急性期有4倍以上升高（4）從患者標本中檢出埃博拉病毒RNA（5）從患者標本中分離到埃博拉病毒診斷

疑似病例基礎上具備診斷依據(jù)中實驗室檢查任一項檢測陽性者第十七頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五檢測內(nèi)容目前省疾控中心實驗室報送審批的檢測項目包括：埃博拉病毒核酸檢測抗埃博拉病毒IgM、IgG抗體檢測第十八頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五標本處理與保存省疾控中心在BSL-3實驗室盡快分離血清，離心時使用有密封蓋的離心桶或轉(zhuǎn)頭進行標本離心，應在生物安全柜內(nèi)打開離心轉(zhuǎn)頭放入或取出裝有標本的離心管分離的血清標本長期保存應置于-70℃以下，保存不超過1周可置-20℃第十九頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五實驗操作的生物安全要求核酸提取時，加入核酸提取裂解液后，可在BSL-2及以上實驗室進行。血清學檢測時，應先60℃1小時滅活，滅活材料免疫學檢測應在生物安全3級（BSL-3）實驗室內(nèi)進行在進行感染性材料操作時，每次標本份數(shù)不宜過多，每份標本量不宜過大

第二十頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五核酸檢測是目前早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)埃博拉出血熱病例的主要檢測方法采用熒光定量PCR進行病毒核酸檢測，患者標本中擴增到特異性核酸，可確診埃博拉病毒感染傳統(tǒng)RT-PCR因易出現(xiàn)污染使用受限，但可以獲得病毒基因序列第二十一頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五核酸檢測發(fā)病后3天內(nèi)，血標本中埃博拉病毒核酸檢出率低，檢測陰性不能排除埃博拉病毒感染，應結(jié)合病例的流行病學史和臨床表現(xiàn)進行綜合判斷發(fā)病后3～10天血標本病毒核酸檢出率高，檢測陰性可排除埃博拉病毒感染。第二十二頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五酶標檢測病毒抗原檢測：用酶聯(lián)免疫法檢測埃博拉病毒核蛋白抗原。病毒抗原檢測陽性可確診。血清特異性IgM抗體：采用捕獲法ELISA方法檢測。疑似病例具有疫區(qū)旅行史或患者接觸史，IgM抗體陽性，可確診，陰性不排除埃博拉病毒感染。血清特異性IgG抗體：目前主要采用間接法ELISA或免疫熒光方法檢測IgG抗體。單份血清埃博拉病毒IgG抗體陽性為曾感染埃博拉病毒，雙份血清埃博拉病毒IgG抗體陽轉(zhuǎn)或恢復期滴度較急性期4倍或者以上增高者，可確診，陰性不排除埃博拉病毒感染。第二十三頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五核酸檢測流程圖反應體系混合物正、反向引物混合物特異性熒光探針1)核酸分離，BSL-32)Real-timePCR檢測20μl5μl反應條件取決于病原體特異性PCR儀合適的PCR管第二十四頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五引物/探針序列引物探針1ZEBOV-FCGCCGAGTCTCACTGAATCTGZEBOV-RAGTTGGCAAATTTCTTCAAGATTGTZEBOV-PFAM-CGGCAAAGAGTCATCCCAGTGTATCAAGTAA-BHQ1引物探針2EBOGP1D-fwdTGGGCTGAAAAYTGCTACAATCEBOGP1D-revCTTTGTGMACATASCGGCACEBOGP1DZ-PrbFAM-CTACCAGCAGCGCCAGACGG-BHQ1RNA模板5μl，酶（25x）1μl，緩沖液12.5μl，引物（10uM）各1μl，探針（10uM）0.5μl，加水至總體積25μl。推薦反應條件為50℃30min，95℃10min，95℃15s、60℃45s反應40個循環(huán)。結(jié)果判斷：以定量熒光PCR反應的前3～15個循環(huán)的熒光信號作為本底信號，以本底信號標準差的10倍作為熒光閾值，標本擴增產(chǎn)生的熒光信號達到熒光閾值時所對應的循環(huán)數(shù)為循環(huán)閾值（Ct值），以Ct<35熒光信號數(shù)據(jù)線性化處理后對應循環(huán)數(shù)生成的曲線圖成“S”形的標本，可判斷為相應的埃博拉病毒核酸檢測陽性。實時定量RT-PCR方法第二十五頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五ZEBOVy=-3.469x+39.75

R2=0.999SEBOVy=-3.533x+38.41R2=1.000CEBOVy=-3.478x+38.87

R2=0.999ZEBOVy=-3.540x+39.69R2=1.000REBOVy=-3.509x+38.54R2=0.999BEBOVy=-3.470x+38.75R2=1.0002套實時定量PCR檢測方法檢出限50～100拷貝體外轉(zhuǎn)錄RNA參考品1套引物探針序列與目前西非流行株一致；1套采用兼并引物，與目前西非流行株差別2個堿基，但理論上不影響檢測。第二十六頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期五引物序列大小方法1EBVGP451-472F5’-TGGGCTGAAAACTGCTACAATC-3’EBVGP1024-1003R5’-TTTTAGTTTCCCAGAAGGCCCA-3’570bp方法2Filo-A1ATCGGAATTTTTCTTTCTCATT