氯胺酮對哮喘大鼠機械通氣肺損傷的保護(hù)作用

氯胺酮對哮喘大鼠機械通氣肺損傷的保護(hù)作用【摘要】目的:探討氯胺酮對哮喘大鼠機械通氣肺損傷的影響。方法:40只SD大鼠制備慢性哮喘模型后隨機分成4組：對照組，哮喘大鼠曠置8h，不行機械通氣；機械通氣組(A組)，采用容量控制機械通氣模式通氣8h；不同劑量氯胺酮干預(yù)組(K1、K2組)，機械通氣前K1組靜脈注射氯胺酮5mg/kg，K2組靜脈注射氯胺酮10mg/kg，余同A組。實驗結(jié)束后處死大鼠，測量肺濕干重比及支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量、白細(xì)胞計數(shù)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)及一氧化氮含量，觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果:與N組比較，A組、K1組、K2組W/D增加，BALF中蛋白含量、白細(xì)胞計數(shù)、TNF-α、IL-6、NO含量增高，病理損傷程度加重；與A組比較，K1組、K2組W/D降低，BALF中蛋白含量、白細(xì)胞計數(shù)、TNF-α、IL-6、NO含量下降，病理損傷程度減輕；K2組蛋白含量、白細(xì)胞計數(shù)低于K1組，其余指標(biāo)K1、K2兩組間差異無顯著性。結(jié)論:氯胺酮可抑制TNF-α、IL-6及NO的釋放，從而對哮喘大鼠機械通氣所致肺損傷起到保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】氯胺酮；機械通氣；肺損傷；哮喘；大鼠

Abstract:Objective:Toinvestigatetheeffectofketamineonventilator-inducedlunginjury(VILI)inasthmaticrats.Methods:FortySprague-Dawley(SD)asthmaticratswereanesthetized,tracheotomizedandrandomlydividedintofourgroups:groupNreceivednormalsalineiv.butnotmechanicallyventilation,theotherthreegroupswereventilatedfor8h.GroupAreceivednormalsalineiv,groupK1receivedketamineivinabolusof5mg/kgandgroupK2receivedketamineivinabolusof10mg/kg.Thelungswereremovedfordeterminationofthewettodryweightratio(W/D),TNF-α,IL-6,NOandproteincontentinbronchoalveolarlavagefluid(BALF).Totalwhitebloodcells(WBC)inBALFwerecountedandlunghistopathologywereassessedamongfourgroups.Results:ThecontentofTNF-α,IL-6,NO,proteinofBALF,togetherwiththevalueofW/DweresignificantlyhigheringroupAthanthatingroupN,K1andK2,whiledecreasedingroupK1andK2thanthatin,groupA().AlargequantityofWBCwerefoundinBALFofgroupA,whiletheamountofWBCwasdecreasedingroupK1andK2thanthatingroupA().HistopathologicfindingsdemonstratedmoreinfiltratingneutrophilsanddestructivechangesofthealveolarwallingroupAthanthatinothergroups.Thecontentofprotein,thequantityofWBCinBALFwerehigheringroupK1thanthatingroupK2.Conclusion:Longtimeventilationcanaggravatelunginjuryofasthmarats.KetamineattenuatesVILIinasthmaratsinpartbecauseofprobablyinhibitingTNF-α,IL-6andNOcontentinlungtissues.

Keywords:ketamine;ventilation;lunginjury;asthma;rat

機械通氣所致肺損傷是機械通氣并發(fā)癥之一。以往VILI模型多由健康動物制備，而臨床上行全麻機械通氣或呼吸機支持治療的患者常伴有哮喘病史，機械通氣更容易造成肺損傷[1]。如何更好地防治哮喘患者VILI，成為臨床上關(guān)注的熱點。氯胺酮作為常用的靜脈麻醉藥，除具有麻醉作用外，還有抗炎、舒張支氣管平滑肌、降低氣道反應(yīng)性等作用。氯胺酮對哮喘患者機械通氣所致肺損傷的影響，尚未見報道。本研究通過制備哮喘大鼠機械通氣肺損傷模型，觀察氯胺酮的干預(yù)作用，探討其可能的機制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1材料和方法

材料健康SPF級成年雄性SD大鼠40只，體重300～350g，由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。鹽酸氯胺酮注射液50mg/ml，超聲霧化吸入器，卵清蛋白，氫氧化鋁凝膠，大鼠TNF-α、IL-6ELISA檢測試劑盒，NO試劑盒，其余試劑均為市售分析純。

模型制備和實驗分組大鼠慢性哮喘模型的制備參照謝敏等的方法并稍加改進(jìn)：第1天和第8天腹腔內(nèi)注射10%的OVA和10%的氫氧化鋁混合液1ml致敏，第15天開始，予1%OVA霧化吸入激發(fā)哮喘，每周3次，每次30min，連續(xù)8周。慢性哮喘大鼠禁食8h，腹腔注射20%烏拉坦8ml/kg麻醉，行左股靜脈插管用于輸液和給藥；暴露氣管，14號BD留置針行氣管插管，接小動物呼吸機行機械通氣；呼吸參數(shù)設(shè)定：頻率30次/min，潮氣量10ml/kg，吸呼比=1:2，氧濃度:100%。

大鼠隨機分成4組，每組10只：①對照組，哮喘大鼠麻醉后行氣管插管，曠置8h，不行機械通氣。②機械通氣組，采用容量控制機械通氣模式通氣8h。③K1組，機械通氣前靜脈注射氯胺酮5mg/kg。④K2組，機械通氣前靜脈注射氯胺酮10mg/kg。K1、K2組，通氣模式同A組,實驗期間輸液速度維持在5ml·kg-1·h-1，動物體溫維持在37℃，8h后處死大鼠。

BALF中TNF-α、IL-6、NO、蛋白含量測定及WBC計數(shù)大鼠處死后迅速摘取心肺，4℃生理鹽水沖洗，將左肺門結(jié)扎，用4℃生理鹽水經(jīng)氣管插管緩慢注入右肺內(nèi)進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，停留30s后吸出，每次灌洗量為3ml，反復(fù)抽吸，共灌洗3次。4℃下3000r/min離心10min，沉淀物用1ml生理鹽水稀釋后行WBC計數(shù)，取上清液-70℃凍存待測。BALF中TNF-α和IL-6含量測定采用雙抗體夾心ELISA法，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行,先在酶標(biāo)儀上測量標(biāo)準(zhǔn)品A值并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后測量樣品A值,并根據(jù)測得的A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品的濃度。BALF中蛋白含量用考馬斯蘭法測定，NO含量采用硝酸還原酶法檢測。

肺組織濕干重比測定取左肺下部組織用冷生理鹽水沖去殘血，濾紙吸干水份，在分析天平上精確稱濕重后放入80℃烤箱中48h，烘干至恒重后稱干重，計算W/D。

病理學(xué)改變?nèi)∽蠓紊喜拷M織固定于10%多聚甲醛中，石蠟包埋，切片及HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

統(tǒng)計學(xué)處理方法采用統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊性者采用LSD法，方差不齊者進(jìn)行Dunnet‘sT3檢驗。

2結(jié)果

BALF中TNF-α、IL-6、NO、蛋白含量測定及WBC計數(shù)與N組相比，A組、K1組、K2組W/D增加，BALF中TNF-α、IL-6、NO、蛋白含量、WBC計數(shù)增高；與A組相比，K1組、K2組W/D降低，BALF中TNF-α、IL-6、NO、蛋白含量、白細(xì)胞計數(shù)降低；K2組蛋白含量、白細(xì)胞計數(shù)低于K1組，其余指標(biāo)K1、K2兩組間差異無顯著性。

病理學(xué)改變N組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡內(nèi)可見少量炎性細(xì)胞，肺間質(zhì)無明顯炎性細(xì)胞浸潤及水腫；A組肺泡壁明顯充血、滲出、增厚，肺泡壁及肺間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞；K1、K2組肺泡結(jié)構(gòu)較清晰，肺泡壁稍增厚，斷裂較A組為輕，局灶性肺間質(zhì)水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤。

3討論

盡管臨床上采用的通氣模式在不斷改進(jìn)，機械通氣仍是引起肺損傷的風(fēng)險因素之一。研究發(fā)現(xiàn)VILI最后共同途徑可能是激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，活化炎性細(xì)胞，產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，最終導(dǎo)致肺損傷。哮喘的本質(zhì)是細(xì)胞因子參與的慢性氣道炎癥，部分炎癥介質(zhì)在機械通氣過程中介導(dǎo)了各種炎性細(xì)胞的活化和炎癥介質(zhì)的釋放，形成級聯(lián)效應(yīng)，不斷放大炎癥反應(yīng)，加重機械通氣對肺組織的損傷。本實驗制備大鼠慢性哮喘模型，不激發(fā)哮喘發(fā)作，采用常規(guī)的潮氣量、較長的通氣時間來復(fù)制VILI模型，更接近臨床實際情況。以BALF中蛋白含量、白細(xì)胞計數(shù)、肺濕干重比及肺組織形態(tài)學(xué)變化作為判斷肺組織受損程度的指標(biāo)。A組大鼠經(jīng)過8h的機械通氣后，BALF中蛋白含量、白細(xì)胞計數(shù)、肺W/D明顯增高，肺組織形態(tài)學(xué)明顯改變，表明哮喘大鼠的VILI模型復(fù)制成功。氯胺酮干預(yù)能不同程度地抑制上述改變，表現(xiàn)為BALF中蛋白含量、白細(xì)胞計數(shù)下降，肺W/D降低以及肺組織病理學(xué)變化改善，大劑量組效果更為明顯，提示氯胺酮可以減輕哮喘大鼠VILI的程度。

TNF-α是引起多種促炎細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)失控性釋放的關(guān)鍵細(xì)胞因子，IL-6與TNF-α共同作用，促進(jìn)T細(xì)胞增殖及多形核中性粒細(xì)胞(PMN)的聚集和活化。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-6的水平與急性肺損傷的患病率、死亡率直接相關(guān)。氯胺酮對TNF-α、IL-1、IL-6等的產(chǎn)生及其效應(yīng)具有抑制作用，并具有抑制炎癥細(xì)胞黏附、減少白蛋白外滲并減輕水腫等作用。靜脈注射氯胺酮配合機械通氣可以有效地控制內(nèi)科治療無效的哮喘持續(xù)狀態(tài)及緩解麻醉手術(shù)中發(fā)生的支氣管痙攣。本實驗也觀察到，A組大鼠BALF中TNF-α、IL-6水平明顯升高，提示機械通氣后啟動了肺組織的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)了炎性因子的釋放。氯胺酮干預(yù)組大鼠BALF中TNF-α、IL-6水平明顯降低，提示氯胺酮可通過抑制炎性因子這一環(huán)節(jié)發(fā)揮抗炎效應(yīng)，減輕了肺損傷嚴(yán)重程度。

NO由L-精氨酸在血管內(nèi)皮中的一氧化氮合酶(NOS)作用下生成，與氣道感染及氣道高反應(yīng)性有密切關(guān)系，是造成組織損傷和炎性反應(yīng)的重要炎癥介質(zhì)之一。NO在代謝過程中產(chǎn)生大量的毒性氧自由基，導(dǎo)致對肺實質(zhì)及肺泡的破壞，過量的NO可刺激大量其他炎癥介質(zhì)及炎性細(xì)胞因子的釋放，加重炎癥過程，形成惡性循環(huán)。氯胺酮可以通過阻斷N-甲基-D-天門冬氨酸受體，減少Ca2+內(nèi)流，繼而抑制iNOS活性，減少NO的合成[10]，這與本實驗中觀察到的結(jié)果相同，可能是其發(fā)揮保護(hù)作用的機制之一。

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