嘔吐物微生物檢驗(yàn)

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微生物學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

2009.7

一，《微生物學(xué)檢驗(yàn)》實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?/p>

1.通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證理論知識(shí),并掌握比較全面的微生物學(xué)基本操作技術(shù).

2.在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)過程中建立無菌觀念,掌握無菌操作技術(shù).

3.通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步掌握臨床常見病原微生物的生物學(xué)性狀,分離培養(yǎng)和

鑒定的方法,各種臨床標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn)程序和方法.

4.在實(shí)驗(yàn)過程中逐漸培養(yǎng)獨(dú)立思考問題,分析問題和解決問題的能力.

二,微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則及實(shí)驗(yàn)室意外處理方法

1.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則

由于微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是以病原微生物為研究對象，在實(shí)驗(yàn)過程中任何疏忽

大意都有可能引起實(shí)驗(yàn)人員的自身感染或?qū)嶒?yàn)室和周圍環(huán)境的污染.因

此,實(shí)驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)規(guī)則,建立無菌觀念,嚴(yán)格無菌操作，防止實(shí)

驗(yàn)過程中出現(xiàn)意外情況,并確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確.

(1)試驗(yàn)前須預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，了解實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，方法和注意事?xiàng)，做到心中

有數(shù),避免發(fā)生錯(cuò)誤,提高實(shí)驗(yàn)效率.

⑵進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須穿工作服,必要時(shí)還須戴口罩，帽子和手套,并做好

實(shí)驗(yàn)前的各項(xiàng)準(zhǔn)備工作.

(3)非必需物品禁止帶入實(shí)驗(yàn)室,帶入實(shí)驗(yàn)室的物品應(yīng)遠(yuǎn)離操作區(qū),放在

指定的區(qū)域.

(4)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不準(zhǔn)大聲喧嘩,嬉戲,應(yīng)保持實(shí)驗(yàn)室的安靜,整潔和有序.不

準(zhǔn)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)吸煙,飲水和進(jìn)食,盡量避免用手觸摸頭,面部,防止感染,

盡量減少室內(nèi)活動(dòng)，以免引起風(fēng)動(dòng).

⑸實(shí)驗(yàn)中注意節(jié)約試劑,愛護(hù)儀器,避免有菌材料的污染,如有傳染性

材料污染桌面,地面,手,衣服或發(fā)生其他意外情況,應(yīng)立即報(bào)告老師及

時(shí)作適當(dāng)處理.

(6)用過的污染物品應(yīng)放到指定的地點(diǎn),經(jīng)專人消毒滅菌之后再進(jìn)行清

洗,切勿亂丟或沖入水池中.禁止將本實(shí)驗(yàn)室的物品帶出實(shí)驗(yàn)室外.需送

溫箱培養(yǎng)的物品,應(yīng)標(biāo)記清楚后送到指定地點(diǎn).

(7)實(shí)驗(yàn)完畢后應(yīng)將桌面整理清潔,試劑,儀器放I可原處,并用浸有消毒

液的抹布將操作臺(tái)擦拭干凈,打掃衛(wèi)生,關(guān)好水，電,門窗.

⑻離室前脫下工作服，反折放在指定的地方；雙手在2%來蘇液中浸泡

5min左右,再用肥皂,清水洗凈,方可離開實(shí)驗(yàn)室.

2.實(shí)驗(yàn)室意外的緊急處理方法

(1)發(fā)生皮膚破損或刺傷:首先用肥皂和水沖洗傷口，盡量擠出損傷處的

血液,并用70%乙醇或其他皮膚消毒劑進(jìn)行消毒,立即進(jìn)行醫(yī)療處理.

(2)化學(xué)藥品腐蝕傷:若為強(qiáng)酸，用大量清水沖洗后再以5%碳酸氫鈉溶液

中和；若為強(qiáng)堿,用大量清水沖洗后再以5%醋酸或5%硼酸溶液中和;若受

傷處是眼部,經(jīng)上述方法處理后,再滴入橄欖油或液體石蠟廠2滴.

(3)燒傷:局部涂凡士林,5%鞅酸或2%苦味酸.

(4)菌液誤入口中：立即將菌液吐入消毒容器中，再用1:1000高鎰酸鉀或

3%過氧化氫漱口，根據(jù)菌種服用適當(dāng)抗生素預(yù)防感染.

⑸菌液污染環(huán)境:將適量2~3%來蘇或0.1%新潔爾滅浸泡污染面半小時(shí)

后除去，如手上有菌污染,也可浸泡于上述消毒液中3~5min,之后用肥皂

和清水洗凈.

三,生物安全防護(hù)知識(shí)簡介

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)匚作人員長期接觸有潛在傳染性的血液,糞便,體液等標(biāo)本,這

些標(biāo)本往往是各種細(xì)菌,病毒等病原微生物的傳播載體,無論是實(shí)驗(yàn)人

員感染,還是造成實(shí)驗(yàn)室和周圍環(huán)境的污染,都將導(dǎo)致嚴(yán)重的后果.因此

實(shí)驗(yàn)室工作人員在實(shí)驗(yàn)過程中必須高度重視實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)，強(qiáng)化

生物安全意識(shí),熟悉生物安全防護(hù)有關(guān)知識(shí),嚴(yán)格無菌操作.

1.微生物的分類等級(jí)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)出版的《實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊》，將微生物分為

四個(gè)不同危險(xiǎn)度等級(jí):危險(xiǎn)度1級(jí)是指不能引起人或動(dòng)物致病的微生物,

此類微生物無或僅具有極低的個(gè)體和群體危險(xiǎn);危險(xiǎn)度2級(jí)的病原體具

有中度個(gè)體危險(xiǎn)，低度群體危險(xiǎn),能引起人或動(dòng)物致病，但對實(shí)驗(yàn)室工作

人員，社區(qū),家畜或環(huán)境不易導(dǎo)致嚴(yán)重危害,所引起的感染具有有效的預(yù)

防和治療措施,并且疾病傳播的危險(xiǎn)有限;危險(xiǎn)度3級(jí)的病原體具有高度

個(gè)體危險(xiǎn)，低度群體危險(xiǎn),通常能引起人或動(dòng)物的嚴(yán)重疾病，但一般不會(huì)

發(fā)生感染的播散,并且對感染具有有效的預(yù)防和治療措施;危險(xiǎn)度4級(jí)的

病原體具有高度的個(gè)體危險(xiǎn)和群體危險(xiǎn)，通常能引起人或生物的嚴(yán)重疾

病，并且很容易發(fā)生個(gè)體之間的直接或間接傳播,對感染一般沒有有效

的預(yù)防和治療措施.

基于以上劃分標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合微生物的致病性，傳播方式，目前所具有的預(yù)防

和治療措施等因素,我國衛(wèi)生部于2006年制定了《人間傳染的病原微生

物名錄》，對各種病原微生物的危害程度及其相關(guān)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)需要達(dá)到的

生物安全實(shí)驗(yàn)室級(jí)別做了詳細(xì)分類，各實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行有關(guān)實(shí)驗(yàn)均需參照此

標(biāo)準(zhǔn).

2.生物安全實(shí)驗(yàn)室分級(jí)與要求

由于各種病原微生物的危險(xiǎn)度等級(jí)不同，因此實(shí)驗(yàn)室必須達(dá)到相應(yīng)的生

物防護(hù)等級(jí)才能開展有關(guān)實(shí)驗(yàn).根據(jù)WHO《實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊》和我國

衛(wèi)生部2002年頒布的《微生物和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則》，

實(shí)驗(yàn)室從生物安全防護(hù)的角度共分為四級(jí)：一級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室

(BSLT)為實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)設(shè)施,安全操作規(guī)程,安全設(shè)備適用于危險(xiǎn)度1級(jí)

的微生物,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作程序可進(jìn)行開放性操作,如用于教學(xué)的普通微

生物實(shí)驗(yàn)室即屬此類.二級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室(BSL-2)適用于對人或

環(huán)境具有中等潛在危害的微生物,即危險(xiǎn)度2級(jí)的病原體,該級(jí)別實(shí)驗(yàn)室

應(yīng)具備生物安全柜和密封的離心管，以免發(fā)生泄漏和產(chǎn)生氣溶膠.三級(jí)

生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室(BSL-3)適用于有明顯危害,可以通過空氣傳播的

病原微生物(如結(jié)核桿菌，伯氏立克次體等)，通常已有預(yù)防傳染的疫苗,

該級(jí)別實(shí)驗(yàn)室除了有嚴(yán)格的一級(jí)和二級(jí)安全設(shè)施要求外,還需具備合適

的空氣凈化系統(tǒng).四級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室(BSL-4)適用于對人體具有

高度的危險(xiǎn)性,通過氣溶膠途徑傳播或傳播途徑不明，目前尚無有效的

疫苗或治療方法的致病微生物及其毒素.BSL-4實(shí)驗(yàn)室必須與其他實(shí)驗(yàn)

室隔離，并具備特殊的空氣和廢物處理系統(tǒng),實(shí)驗(yàn)操作須在m級(jí)生物安

全柜內(nèi)或全身穿戴特制的正壓防護(hù)服.

根據(jù)以上定義，醫(yī)院內(nèi)的臨床實(shí)驗(yàn)室因接觸可能含有致病微生物的標(biāo)本,

通常應(yīng)達(dá)到二級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室要求.根據(jù)《實(shí)驗(yàn)室生物安全認(rèn)可

準(zhǔn)則》，二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)設(shè)施需符合以下兒點(diǎn)：（1）實(shí)驗(yàn)室需具

有防止節(jié)肢動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物進(jìn)入的設(shè)計(jì),有可開啟的窗戶，有紗窗,實(shí)驗(yàn)

室門有可視窗帶鎖并能自動(dòng)關(guān)閉.（2）每個(gè)實(shí)驗(yàn)室均應(yīng)設(shè)置洗手池,宜設(shè)

置在靠近出口處.（3）實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)域外有足夠的存儲(chǔ)空間及擺放個(gè)人

衣物的設(shè)施.（4）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)墻壁，地面應(yīng)平整，防滑，易于清潔,不適宜用

地毯.（5）實(shí)驗(yàn)臺(tái)面應(yīng)能防水,耐腐蝕，耐熱.（6）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)保證工作照

明，避免反光和強(qiáng)光.（7）在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)穿戴隔離衣,帽,手套,必要時(shí)戴

防護(hù)眼鏡.實(shí)驗(yàn)室應(yīng)備有生物安全柜.（8）有適當(dāng)?shù)南驹O(shè)施,如高壓蒸

汽滅菌器，并設(shè)置洗眼裝置，應(yīng)急噴淋裝置，急救藥箱,滅火器等.（9）有

可靠的電力供應(yīng)和應(yīng)急照明.（10）在實(shí)驗(yàn)室出口處設(shè)有在黑暗中可明確

辨認(rèn)方向，通道的標(biāo)識(shí).（11）在實(shí)驗(yàn)室入口處和裝有傳染性物質(zhì)的設(shè)備

表面貼有生物危險(xiǎn)標(biāo)志.

3.實(shí)驗(yàn)室生物安全管理制度

實(shí)驗(yàn)室生物安全制度建設(shè)對于臨床實(shí)驗(yàn)室而言是生物安全防護(hù)的核心，

實(shí)驗(yàn)室生物安全管理制度應(yīng)包括:實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)入制度,生物安全培訓(xùn)制度，

生物安全責(zé)任制和責(zé)任追究制度,生物防護(hù)與安全制度,安全檢查制度，

個(gè)人防護(hù)制度,實(shí)驗(yàn)室管理制度,清潔消毒制度,安全計(jì)劃審核制度,廢

棄物處理制度,事故報(bào)告制度,生物安全防護(hù)應(yīng)急預(yù)案,標(biāo)準(zhǔn)操作程序等.

建立健全了各項(xiàng)生物安全制度,還應(yīng)成立生物安全管理領(lǐng)導(dǎo)小組，加強(qiáng)

生物安全制度實(shí)施情況的監(jiān)督管理,實(shí)驗(yàn)室入口處須粘貼生物安全標(biāo)志,

注明危險(xiǎn)因素,生物安全級(jí)別，負(fù)責(zé)人姓名和電話,進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的特殊要

求及離開程序,禁止非工作人員進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室,如需參觀實(shí)驗(yàn)室等特殊行

為需經(jīng)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人的批準(zhǔn)后方可進(jìn)入.

4.實(shí)驗(yàn)室常見生物危險(xiǎn)

實(shí)驗(yàn)室生物污染的途徑包括：空氣傳播（臨床標(biāo)本中的污染源在空氣中

傳播,微生物氣溶膠的吸入），直接傳播（工作中偶然刺傷,割傷,碎玻璃

劃傷直接感染），皮膚粘膜接觸（臨床標(biāo)本中的傳染源通過破損皮膚粘膜

接觸造成的感染），其他不明原因的實(shí)驗(yàn)室相關(guān)感染.

實(shí)驗(yàn)室傷害以及與工作有關(guān)的感染主要是由于人為失誤、不良實(shí)驗(yàn)技術(shù)

以及儀器使用不當(dāng)造成的.因此,實(shí)驗(yàn)室人員必須提高生物安全意識(shí)，認(rèn)

真學(xué)習(xí)生物安全相關(guān)的各種法規(guī)和文件，定期進(jìn)行生物安全防護(hù)知識(shí)培

訓(xùn)，熟悉生物防護(hù)有關(guān)知識(shí),加強(qiáng)基本技能的培養(yǎng),嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程.

實(shí)驗(yàn)室管理者應(yīng)對實(shí)驗(yàn)室的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別進(jìn)行分析,尤其對風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別較高的,

接觸高危標(biāo)本幾率較大的區(qū)域如微生物和分子生物學(xué)室予以高度重視，

保護(hù)實(shí)驗(yàn)室工作人員和環(huán)境的安全.

5.生物廢棄材料的管理

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所有用過的樣本，培養(yǎng)物及其他生物性材料等廢棄物,嚴(yán)禁未

經(jīng)處理就隨意丟棄,應(yīng)置于貼有生物危害標(biāo)志的專用廢棄物處理容器內(nèi),

注意容器的充滿量不能超過其設(shè)計(jì)容量,利器（如針頭,小刀,玻璃等）應(yīng)

置于耐扎銳器盒內(nèi)，在去污染或最終處置前應(yīng)存放在指定的安全地方，

經(jīng)過高壓滅菌或其他無害化處理后再安全運(yùn)出實(shí)驗(yàn)室；有害氣體,氣溶

膠,污水,廢液等均需經(jīng)無害化處理后排放;動(dòng)物尸體,組織的處置和焚

化應(yīng)符合國家相關(guān)要求.處理危險(xiǎn)廢棄物的人員需經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)I,并使

用適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)設(shè)備.

第一章微生物學(xué)檢驗(yàn)基本技術(shù)

實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及顯微鏡油鏡的使用

【目的和要求】

1.熟悉微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)則并自覺遵守.

2.掌握細(xì)菌基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)的觀察方法.

3.掌握光學(xué)顯微鏡油鏡的使用和維護(hù)方法,了解熒光顯微鏡和暗視野顯

微鏡的構(gòu)造和使用方法.

【試劑與器材】

1.示教片:各種球菌,桿菌,弧菌,莢膜,鞭毛,芽胞的示教片.

2.器材及其他:光學(xué)顯微鏡,載玻片,擦鏡紙,香柏油,脫油劑等.

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

一,細(xì)菌基本形態(tài)和特殊構(gòu)造的觀察

1.細(xì)菌的基本形態(tài)（各種球菌,桿菌,弧菌等）

觀察要點(diǎn):注意細(xì)菌的染色性,相對大小,形狀及排列方式.

2.特殊結(jié)構(gòu)的觀察（莢膜,芽胞,鞭毛）

觀察要點(diǎn):注意這些特殊結(jié)構(gòu)的大小,形狀及其在菌體中的位置,均有助

于細(xì)菌的鑒定.

二,光學(xué)顯微鏡油鏡的使用

1.光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造

光學(xué)顯微鏡是觀察細(xì)菌形態(tài)最常用的一種儀器,其構(gòu)造分為機(jī)械部分和

光學(xué)部分,機(jī)械部分包括:鏡座,鏡臂,載物臺(tái),鏡筒,鏡頭轉(zhuǎn)換器,調(diào)焦裝

置等;光學(xué)部分包括:接物鏡,接目鏡,反光鏡,聚光器,光圈等（見圖1T）.

圖光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造

顯微鏡的接物鏡有低倍鏡,高倍鏡,油鏡三種,放大倍數(shù)依次增高,其識(shí)

別方法為：

（1）低倍鏡:鏡頭標(biāo)志為10X或10/0.25,鏡頭最短,其上?？逃悬S色環(huán)圈.

（2）高倍鏡:鏡頭標(biāo)志為40X或40/0.65,鏡頭較長,其上常刻有藍(lán)色環(huán)圈.

⑶油鏡:鏡頭標(biāo)志為100X或100/1.30,鏡頭最長，其上常刻有白色環(huán)

圈，或"oil”字樣.

2.油鏡的使用原理

圖1-2顯微鏡油鏡的使用原理

油鏡的放大倍數(shù)高而透鏡很小，自標(biāo)本片透過的光線，因玻片和空氣的

折光率不同（玻璃n=L52,空氣n=L0）,部分光線經(jīng)載玻片進(jìn)入空氣后發(fā)

生折射,不能進(jìn)入接物鏡,致使射入光線較少,物象不清晰.在油鏡和載

玻片之間滴加和玻璃折光率相近的香柏油（n=l.515）,則使進(jìn)入油鏡的

光線增多，視野光亮度增強(qiáng),物象清晰（見圖1-2）.

3.使用方法

⑴采光:使用顯微鏡時(shí)必須端坐,將顯微鏡放在胸前適當(dāng)位置.將低倍

鏡轉(zhuǎn)到中央并對準(zhǔn)下面的聚光器,打開光圈,轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡,使光線集中于

聚光器（以燈光為光源時(shí),使用凹面反光鏡,以自然光為光源時(shí)用平面反

光鏡）.根據(jù)所觀察的標(biāo)本,通過升降聚光器和縮放光圈以獲得最佳光度.

當(dāng)用低倍鏡或高倍鏡觀察時(shí),應(yīng)適當(dāng)縮小光圈,下降聚光器；當(dāng)用油鏡觀

察時(shí),光線宜強(qiáng),應(yīng)把光圈完全打開,并將聚光器上升到最高位置.

⑵低倍鏡調(diào)焦:將欲觀察的標(biāo)本置載物臺(tái)上,用彈簧夾和推進(jìn)器固定，

將待檢部位移至視野正中央，上升載物臺(tái)至不能升高為止.用左眼觀察

接目鏡,緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)器,使載物臺(tái)下降,待看到模糊的圖像時(shí)，再調(diào)

節(jié)細(xì)調(diào)節(jié)器,直至看到清晰的圖像為止.

(3)油鏡的使用：低倍鏡找到物象并調(diào)至清晰之后，轉(zhuǎn)開物鏡頭,在玻片

的標(biāo)本上滴加1滴香柏油，將油鏡頭轉(zhuǎn)換至中央,緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)器，使

鏡頭浸入油中，當(dāng)油鏡頭幾乎接觸玻片時(shí)停止轉(zhuǎn)動(dòng)(從側(cè)面觀察)，邊觀

察接目鏡邊輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器(此時(shí)只能上升鏡頭,不能下降，防止壓壞

玻片及損壞物鏡)，待看到模糊物象時(shí)改調(diào)細(xì)調(diào)節(jié)器,直至找到清晰物象.

鏡檢時(shí)應(yīng)將標(biāo)本按一定方向呈〃弓〃形移動(dòng)，直至整個(gè)標(biāo)本觀察完畢，以

防漏檢.觀察時(shí)應(yīng)將兩只限睛同時(shí)睜開,左眼觀察,右眼用于繪圖或記錄.

標(biāo)本觀察完畢后,先將物鏡頭移開,再轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器使載物臺(tái)下降,取下

載玻片,立即用擦鏡紙將鏡頭上的香柏油擦凈.

4.注意事項(xiàng)

⑴顯微鏡是精密光學(xué)儀器,在搬放時(shí)應(yīng)右手緊握鏡臂,左手穩(wěn)托鏡座，

平端在胸前,輕拿輕放.

(2)顯微鏡放到實(shí)驗(yàn)臺(tái)上時(shí),先放鏡座的一端,再將鏡座全部放穩(wěn),切不

可使鏡座全面同時(shí)與臺(tái)面接觸,這樣震動(dòng)過大,透鏡和微調(diào)節(jié)器的裝置

易損壞.

⑶避免強(qiáng)酸,強(qiáng)堿,氯仿，乙醛,酒精等化學(xué)藥品與顯微鏡接觸,避免日

光直射,顯微鏡須經(jīng)常保持清潔,勿使油污和灰塵附著.

(4)接目鏡和接物鏡不要隨便卸下,必須抽取接目鏡時(shí),須將鏡筒上口用

布遮蓋，避免灰塵落入鏡筒內(nèi).更換接物鏡時(shí),卸下后應(yīng)倒置在清潔的臺(tái)

面上,并隨即裝入木箱的置放接物鏡的管內(nèi).

(5)細(xì)調(diào)節(jié)器是顯微鏡最精細(xì)而脆弱的部分，不要向一個(gè)方向連續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)

數(shù)周,應(yīng)輕微地來回旋轉(zhuǎn).

(6)鏡頭必須保持清潔,油鏡使用完后應(yīng)立即用擦鏡紙拭去香柏油.若油

鏡鏡頭上的油跡未擦干凈,應(yīng)先將1：1醇酸混合液或二甲苯滴在擦鏡紙

上擦拭鏡頭,再用干凈擦鏡紙將鏡頭上殘留的醇酸混合液或二甲苯擦凈.

(7)顯微鏡擦凈后,取下標(biāo)本片,下降聚光器,再將物鏡轉(zhuǎn)成〃品〃字形,送

至顯微鏡室放入鏡箱內(nèi).

三,暗視野顯微鏡

1.構(gòu)造與原理:在顯微鏡上安裝一個(gè)特制的聚光器一暗視野聚光器.此

聚光器中央為一黑板所遮,光線不能直接通向鏡筒，使視野背景黑暗.這

樣，從聚光器周邊斜射到載玻片上細(xì)菌等微粒上的光線,就因散射作用

而發(fā)出亮光,反射到鏡簡內(nèi).故在強(qiáng)光照射下，可在黑色的背景中看到發(fā)

亮的菌體.正如我們在暗室內(nèi)，能看到從隙縫漏入的陽光內(nèi)，有無數(shù)顆塵

埃微粒跳躍飛舞一樣.

2.使用方法：

(1)將顯微鏡聚光器御下,裝上暗視野聚光器,置暗室,使用人工光源.

(2)先用低倍物鏡觀察,調(diào)節(jié)光環(huán)置中央后,在暗視野聚光器表面滴上香

柏油(或水)，再將標(biāo)本夾在移動(dòng)尺上.

(3)調(diào)節(jié)暗視野聚光器，使之油滴(或水滴)與鏡臺(tái)上的載玻片底面接觸，

(4)其余操作同光學(xué)顯微鏡.

四，熒光顯微鏡

1.構(gòu)造：

(1)熒光顯微鏡光源：能發(fā)射豐富的紫外線光和紫蘭光,常用150~200瓦

高壓汞燈.

(2)濾光片:

1)激發(fā)濾光片裝于光源與聚光器之問，可選擇性使紫外光及紫蘭光通過,

激發(fā)熒光素發(fā)出熒光；

2)吸收濾光片裝于物鏡與目鏡之間，可吸收紫外光及紫蘭光，僅讓熒光

通過,以便觀察標(biāo)本和保護(hù)眼睛.

2.熒光顯微鏡的使用方法：

⑴將熒光顯微鏡置暗室，開啟光源，待光源穩(wěn)定并達(dá)到一定亮度(約

5~10min)后,對準(zhǔn)光軸.

⑵裝好配對的激發(fā)濾光片和吸收濾光片后再作觀察.操作同光學(xué)顯微

鏡.

3.注意事項(xiàng)

(1)熒光顯微鏡如用高壓汞燈作光源,使用時(shí)一經(jīng)開啟不宜中斷,斷電后

需待汞燈冷卻后(約15min)方能再啟用.

⑵使用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本時(shí)間不宜太長.因標(biāo)本在高壓汞燈下照射

超過3min,即有熒光減弱現(xiàn)象.

【結(jié)果記錄和報(bào)告】

實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查

【目的和要求】

1.熟悉細(xì)菌染色的常用染料和一般程序.

2.掌握革蘭染色的方法,原理,結(jié)果觀察及意義.

3.熟悉不染色標(biāo)本檢查法(壓滴法和懸滴法)的方法與結(jié)果觀察.

4.熟悉細(xì)菌的特殊染色法.

【試劑與器材】

1.菌種:葡萄球菌,大腸埃希菌.

2.試劑:革蘭染色液,細(xì)胞壁染色液,芽胞染色液,鞭毛染色液,生理鹽水

寺.

3.其他:載玻片,接種環(huán),酒精燈,顯微鏡,香柏油,蠟筆,擦鏡紙,脫油劑

等.

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

一,細(xì)菌染色的一般程序

細(xì)菌染色法分單染法和復(fù)染法.單染法是用一種染料去染,所有細(xì)菌都

染成一種顏色;復(fù)染法是用多種染料對細(xì)菌進(jìn)行染色，不同細(xì)菌可染成

不同的顏色.

大部分細(xì)菌染色的基本程序相同，即:涂片一干燥一固定一染色,根據(jù)實(shí)

驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的染色方法，在實(shí)際工作中，應(yīng)用最廣泛的是革蘭染色

法.

二,革蘭染色

1.染色原理

(1)等電點(diǎn)學(xué)說:革蘭陽性菌的等電點(diǎn)(PI2?3)比革蘭陰性菌(pI4?5)

低,在同一pH條件下革蘭陽性菌帶負(fù)電荷比革蘭陰性菌要多，與帶正電

荷的堿性染料(結(jié)晶紫)結(jié)合性牢固，不易脫色.

(2)化學(xué)學(xué)說:革蘭陽性菌含有大量的核糖核酸鎂鹽,與進(jìn)入胞漿內(nèi)的結(jié)

晶紫和碘牢固結(jié)合成大分子復(fù)合物，不易被95%酒精脫色;而革蘭陰性菌

含此種物質(zhì)少,故易被乙醇脫色.

⑶通透性學(xué)說：革蘭陽性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較致密,肽聚糖層較厚,含脂質(zhì)

少，脫色時(shí)一，乙醇不易進(jìn)入,而且95%乙醇可使細(xì)胞壁脫水,細(xì)胞壁間隙縮

小,通透性降低，阻礙結(jié)晶紫和碘復(fù)合物滲出.而革蘭陰性菌細(xì)胞壁結(jié)

構(gòu)疏松,肽聚糖層較薄,含脂質(zhì)多，易被乙醇溶解,致使細(xì)胞壁通透性增

高,細(xì)胞內(nèi)的結(jié)晶紫與碘復(fù)合物易被溶出而脫色.

2.方法

(1)涂片:取清潔無油跡的載玻片1張,用蠟筆劃線將其分成左右兩格.用

接種環(huán)先挑取生理鹽水廠2環(huán)于載玻片每格中央,再分別挑取大腸桿菌

和葡萄球菌少許菌落與生理鹽水研勻,涂成直徑約1.5cm的菌膜.

⑵干燥:讓涂片自然干燥,也可在酒精燈火焰較遠(yuǎn)處微微加熱烘干，但

切勿靠近火焰.

(3)固定:干燥后的標(biāo)本片在酒精燈火焰上來回通過3次(以鐘擺的速度),

冷卻后染色.固定的目的在于殺死細(xì)菌,并使菌膜與玻片牢固粘附,避免

染色過程中被水沖洗掉,通過固定還可凝固細(xì)胞質(zhì),改變細(xì)菌對染料的

通透性,使細(xì)菌易與染料結(jié)合而著色.

(4)染色:分以下四步：

Imin,水洗Imin,水洗約0.5min,水洗0.5min,水洗

結(jié)晶紫盧戈碘液95%乙醇稀釋石炭酸復(fù)紅待干，鏡檢

(初染)(媒染)(脫色)(復(fù)染)

3.結(jié)果:革蘭陽性菌染成紫色;革蘭陰性菌染成紅色.

4.注意事項(xiàng)：

(1)涂片厚薄要適宜，以菌膜剛好能透過字跡為宜(半透明).如果涂片太

厚有可能將革蘭陰性菌染成紫色，涂片太薄則可能將革蘭陽性菌染成紅

色.

(2)脫色時(shí)間長短要適宜,如果涂片較厚應(yīng)相應(yīng)的延長脫色時(shí)間,如涂片

較薄則相應(yīng)的縮短脫色時(shí)間，脫色時(shí)應(yīng)不斷旋轉(zhuǎn)玻片搖勻，使其充分脫

色,通常脫到乙醇中沒有紫色流下即可.

(3)水洗時(shí),水流不能過大，防止水流直接對準(zhǔn)菌膜沖洗.

⑷所有染液應(yīng)防止因蒸發(fā)而改變濃度，特別是盧戈碘液久存或受光作

用后失去媒染作用;涂片上積水過多會(huì)降低染液濃度,影響染色效果.

(5)因細(xì)菌的菌齡不同染色結(jié)果也有差異,一般以18~24h培養(yǎng)物染色結(jié)

果最好.

5.醫(yī)學(xué)意義:通過革蘭染色有助于細(xì)菌的初步鑒別，并可作為選擇藥物

的參考，了解細(xì)菌的致病性.

三,特殊染色法

細(xì)菌的細(xì)胞壁,核質(zhì),胞漿顆粒和細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)如芽胞，莢膜,鞭毛等,

必須用相應(yīng)的特殊染色法才能染上顏色.

1.細(xì)胞壁染色法

(1)涂片，干燥:同革蘭染色法.

（2）固定:滴加lOOg/L糅酸固定標(biāo)本15min,水洗.

（3）滴加5g/L龍膽紫染色3~5nlin,水洗,待干,鏡檢.

結(jié)果:有細(xì)胞壁的細(xì)菌僅菌體周邊染成紫色,菌體內(nèi)部無色;無細(xì)胞壁的

細(xì)菌（如L型細(xì)菌）整個(gè)菌體都染成紫色.

2.鞭毛染色法（改良Ryu法）

鞭毛染色可從平板上直接挑取菌落,也可從斜面培養(yǎng)基上刮取菌苔涂片,

必須注意動(dòng)作盡量輕，以免鞭毛脫落.培養(yǎng)基應(yīng)為營養(yǎng)較好的瓊脂平板

（如血平板，營養(yǎng)瓊脂），不可用含抑制劑的選擇培養(yǎng)基（如SS,中國

藍(lán),MAC等）.

（1）玻片的處理:要求用新的載玻片,用前在95%乙醇中浸泡24h以上，用

時(shí)從酒精中取此用干凈的紗布擦干使用.若水滴向周圍流散而不形成

水珠表示玻片處理良好.

⑵在玻片上加蒸儲(chǔ)水1滴,用接種針蘸取菌落少許，將細(xì)菌點(diǎn)在蒸儲(chǔ)水

滴的頂部（一般只需點(diǎn)一下,僅允許極少量細(xì)菌進(jìn)入水滴），使其自然流

散成薄膜,不可攪動(dòng)，以免鞭毛脫落.

（3）室溫自然干燥,不可在火焰上烘干.

⑷滴加染液（配方見附錄二），染色約l（ri5min后,將玻片微傾斜,用蒸

儲(chǔ)水緩慢滴加在玻片頂端無菌膜處洗去染液,注意洗凈染液表面的金屬

光澤液膜.

（5）玻片自然干燥后鏡檢.觀察時(shí)應(yīng)從細(xì)菌較少的地方尋找鞭毛.

結(jié)果:鞭毛染成紅色.

3.芽胞染色法

（1）涂片,干燥,固定:同革蘭染色法.

（2）染色:分為以下三步.

1）初染：在菌膜上加石炭酸復(fù)紅染液,用微火加熱使染液冒蒸氣5min,注

意不能煮沸或燒干,加熱過程中應(yīng)隨時(shí)添加染液,冷卻后水洗.

2）脫色:用95%乙醇脫色1?2min,水洗.

3）復(fù)染:用堿性美藍(lán)染Imin,水洗,待干,鏡檢.

結(jié)果:菌體呈藍(lán)色,芽胞染成紅色.

4.莢膜染色法

（1）黑斯氏法

1）涂片，自然干燥，加熱固定.

2）滴加結(jié)晶紫染液，在火焰上微微加熱至染液冒蒸氣為止.

3）用硫酸銅溶液將玻片上的染液洗去（注:切勿水洗），用吸水紙吸干后

鏡檢.

結(jié)果:菌體及背景均染成紫色,莢膜染成淡紫色或無色.

（2）密爾氏法

1）涂片:提前數(shù)日于小鼠腹腔注射肺炎鏈球菌0.2ml,小鼠死亡后取腹腔

液印片，自然干燥，加熱固定.

2）滴加石炭酸復(fù)紅染液,微火加熱染色lmin,水洗.

3）加媒染劑染0.5min,水洗.

4）加堿性美藍(lán)染色I(xiàn)min,水洗,待干,鏡檢.

結(jié)果:菌體染成鮮紅色，莢膜染成藍(lán)色.

5.異染顆粒染色

細(xì)菌經(jīng)涂片，干燥，固定，加甲液（見附錄二）染色3?5min,水洗后加乙液

染色I(xiàn)min,水洗,待干,鏡檢.

結(jié)果:菌體染成藍(lán)綠色,異染顆粒染成藍(lán)黑色.

四，不染色標(biāo)本檢查法

細(xì)菌未經(jīng)過染色呈無色透明，在顯微鏡下為有折光性的小點(diǎn),不能判斷

細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征.因此,不染色標(biāo)本檢查法主要用于觀察細(xì)菌的

動(dòng)力，常用的方法有以下幾種.

1.壓滴法

用接種環(huán)分別取菌液2?3環(huán),置于潔凈載玻片中央.用小鑲子挾一蓋玻

片，先使蓋玻片一邊接觸菌液,然后緩緩放下,覆蓋于菌液上,避免菌液

中產(chǎn)生氣泡.先用低倍鏡找到觀察部位,再換高倍鏡觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng).

2.懸滴法

取一潔凈凹玻片,在凹窩四周涂少許凡士林.取一環(huán)菌液于蓋玻片中央,

將凹玻片凹窩對準(zhǔn)蓋玻片上的菌液,迅速翻轉(zhuǎn)載玻片，用小鎰子輕壓蓋

玻片，使之與凹玻片粘緊封閉（見圖2-1）,置顯微鏡下觀察.

圖2-1懸滴法

3.暗視野顯微鏡觀察

將上述經(jīng)壓滴法制成的標(biāo)本片，置于暗視野顯微鏡下觀察,有鞭毛的細(xì)

菌運(yùn)動(dòng)活潑,在黑色的背景下閃閃發(fā)亮,有明顯的位置移動(dòng).

觀察要點(diǎn):有鞭毛的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)活潑，可向不同方向迅速運(yùn)動(dòng)，位置移動(dòng)明

顯.無鞭毛細(xì)菌不能做真正的運(yùn)動(dòng)，但受水分子的撞擊而呈分子運(yùn)動(dòng)（布

朗運(yùn)動(dòng)），即在一定范圍內(nèi)作來回顫動(dòng)，位置移動(dòng)不大,注意與細(xì)菌的鞭

毛運(yùn)動(dòng)相鑒別.

【結(jié)果記錄和報(bào)告】

實(shí)驗(yàn)三滅菌前的準(zhǔn)備與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備

【目的和要求】

1.熟悉常用玻璃器皿的清洗,滅菌前的包裝準(zhǔn)備.

2.熟悉培養(yǎng)基的種類，主要成分及用途.

3.掌握基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備程序,方法和注意事項(xiàng).

【試劑與器材】

1.試劑:牛肉膏,蛋白陳,氯化鈉,瓊脂粉,lmol/LNaOH,lmol/LHC1等.

2.器材:試管,吸管,平皿,錐形瓶,量筒,吸管,精密PII試紙,天平,濾紙等.

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

一,常用玻璃器材的洗滌和準(zhǔn)備

1.玻璃器材的洗滌

玻璃器材若不清潔,?？捎绊憣?shí)驗(yàn)結(jié)果,如影響培養(yǎng)基的pH值,甚至由于

某些化學(xué)物質(zhì)的存在可抑制微生物的生長;試管不清潔也可影響血清學(xué)

反應(yīng)的結(jié)果，如在pII16mm為敏感.

3)意義:本試驗(yàn)用于鑒別表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌,前者敏感(S),

后者耐藥(R).

四，注意事項(xiàng)

1.觸酶試驗(yàn)不宜用血瓊脂平板上的菌落，因紅細(xì)胞內(nèi)含有觸酶,會(huì)出現(xiàn)

假陽性反應(yīng);此外,陳舊培養(yǎng)物可丟失觸酶活性，而出現(xiàn)假陰性反應(yīng).因

此每次做觸酶試驗(yàn)一定要用陽性菌株和陰性菌株作對照.陽性對照可用

金黃色葡萄球菌,陰性對照可用鏈球菌.

2.在臨床檢驗(yàn)中，常遇到血漿凝固酶陰性的葡萄球菌,不能輕率作出非

致病性葡萄球菌或污染菌的結(jié)論.因血漿凝固酶陰性的葡萄球菌也可引

起菌血癥,尿路感染和心內(nèi)膜炎等.

【鑒定依據(jù)】

金黃色葡萄球菌的鑒定依據(jù):①鏡下形態(tài)特點(diǎn):G+球菌,葡萄狀排列;②

菌落特點(diǎn):血平板上為中等大小,圓形突起,光滑濕潤,有透明的B-溶血

環(huán),金黃色菌落;③生化反應(yīng)（血漿凝固酶試驗(yàn)+,發(fā)酵甘露醇，耐熱核酸

酶試驗(yàn)+）.符合以上特征可報(bào)告“檢出金黃色葡萄球菌

【臨床意義】

葡萄球菌屬中的金黃色葡萄球菌致病性強(qiáng),常引起局部化膿性感染,膿

毒血癥,敗血癥,食物中毒等.表皮葡萄球菌為條件致病菌,可引起尿路

感染等各種機(jī)會(huì)感染.腐生葡萄球菌一般不致病.

【結(jié)果記錄和報(bào)告】

實(shí)驗(yàn)十二鏈球菌屬檢驗(yàn)

【目的和要求】

1.熟悉鏈球菌的生長現(xiàn)象和鏡下形態(tài)特點(diǎn).

2.掌握鏈球菌屬的檢驗(yàn)方法.

3.掌握抗試驗(yàn)的原理和方法.

【試劑與器材】

1.菌種：甲，乙,丙型鏈球菌,肺炎鏈球菌.

2.培養(yǎng)基:兔血瓊脂培養(yǎng)基，血清肉湯培養(yǎng)基，馬尿酸鈉培養(yǎng)基,菊糖發(fā)

酵管等.

3.試劑:革蘭染色液,苯丙氨酸脫胺酶試劑,100g/L去氧膽酸鈉溶液,鏈

球菌分群乳膠試劑,溶血素〃0〃及還原劑,ASO乳膠試劑,美蘭溶液.

4.其他:桿菌肽紙片,Optochin紙片,無菌生理鹽水,人血清,2%兔紅細(xì)胞,

乳膠反應(yīng)板,家兔，小白鼠等.

【實(shí)驗(yàn)方法】

一,標(biāo)本采集

根據(jù)病情采集不同標(biāo)本,如膿液,鼻咽拭子,血液等.風(fēng)濕熱患者可取病

人血清進(jìn)行抗鏈球菌溶血素試驗(yàn).

二,檢驗(yàn)程序

痰液,膿汁,咽拭子腦脊液血液

涂片染色鏡檢莢膜腫脹試驗(yàn)分離培養(yǎng)增菌培養(yǎng)（葡萄糖肉湯等）

（血平板）

初步報(bào)告

純培養(yǎng)

可疑菌落（性狀,溶血）

鑒定試驗(yàn)

桿菌肽敏Optochin敏膽鹽溶血清學(xué)莢膜腫脹其他鑒定藥敏試驗(yàn)

感試驗(yàn)感試驗(yàn)菌試驗(yàn)鑒定試驗(yàn)試驗(yàn)

報(bào)告

圖12-1鏈球菌和肺炎鏈球菌的檢驗(yàn)程序

三,檢驗(yàn)方法

1.培養(yǎng)物觀察

（1）血平板:將各種鏈球菌菌種接種于血平板,35c培養(yǎng)24h后,菌落呈圓

形,細(xì)小，灰白色,光滑濕潤，凸起,邊緣整齊,不同菌種出現(xiàn)不同溶血現(xiàn)

象.肺炎鏈球菌菌落與甲型溶血性鏈球菌菌落相似,但培養(yǎng)2?3天后，因

菌體發(fā)生自溶,菌落中心凹陷呈〃臍狀〃.

⑵血清肉湯：甲，乙,丙型鏈球菌呈絮狀或顆粒狀沉淀，肺炎鏈球菌呈混

濁生長.

2.形態(tài)學(xué)檢查：

挑取各種鏈球菌菌落分別涂片革蘭染色,鏡下觀察各種細(xì)菌鏡下形態(tài).

3.生化反應(yīng)

（1）觸酶試驗(yàn)：鏈球菌屬均為陰性.（葡萄球菌屬為陽性）

（2）桿菌肽敏感試驗(yàn)：

1）試驗(yàn)原理:A群鏈球菌對桿菌肽兒乎都敏感,而其他鏈球菌對桿菌肽通

常耐藥.因而此試驗(yàn)可對A群鏈球菌進(jìn)行鑒別.

2）方法：先挑取被檢的菌落密集涂布于血平板上，再將桿菌肽紙片

（0.04U/片）貼于培養(yǎng)基上,35℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果.

3）結(jié)果判斷:桿菌肽周圍如出現(xiàn)明顯抑菌環(huán)（直徑為敏感可推斷

待測菌為A群鏈球菌.

4）注意事項(xiàng)：涂布待測菌接種量要大，防止出現(xiàn)假陽性.另外少數(shù)的B

群,C群和G群鏈球菌對桿菌肽也敏感.應(yīng)結(jié)合其他生化反應(yīng)鑒別.

（3）CAMP試驗(yàn)

1）試驗(yàn)原理:B群溶血性鏈球菌（無乳鏈球菌）能產(chǎn)生"CAMP”因子,可促進(jìn)

金黃色葡萄球菌B-溶血素的活性，故在血平板上B群溶血性鏈球菌和

金黃色葡萄球菌的菌落交界處溶血能力增強(qiáng)，出現(xiàn)箭頭狀透明溶血區(qū).

2）方法:挑取金黃色葡萄球菌在血平板上劃種一條橫線,再將待測鏈球

菌在距金黃色葡萄球菌接種線3?5mm處呈直角接種一短線（兩線不能相

交），35C培養(yǎng)18~24h觀察結(jié)果.同時(shí)設(shè)陽性對照（B群鏈球菌）和陰性對

照（A群或D群鏈球菌）.

3）結(jié)果判斷:接種的兩菌交界處溶血能力如增強(qiáng)，出現(xiàn)箭頭狀透明溶血

區(qū)則為陽性,否則為陰性.此試驗(yàn)通常用于鑒別B群溶血性鏈球菌和其他

鏈球菌.

（4）馬尿酸鈉水解試驗(yàn)：

1）試驗(yàn)原理:B群鏈球菌有馬尿酸水解酶,可水解馬尿酸為苯甲酸和甘氨

酸.產(chǎn)生的苯甲酸可與FeC13結(jié)合,形成苯甲酸鐵沉淀.

2）方法:取待測菌接終于馬尿酸鈉培養(yǎng)基,35c培養(yǎng)48h,3000r/min離心

30min后吸取上清液0.8ml加入含F(xiàn)eC130.2ml的試管混勻.15min后觀察

結(jié)果.

3）結(jié)果判斷：出現(xiàn)穩(wěn)定沉淀物為陽性.如果有沉淀物，但輕搖后消失為陰

性.此試驗(yàn)用于鑒別B群鏈球菌（+）和其他鏈球菌（-）.

（5）Optochin敏感試驗(yàn)

1）試驗(yàn)原理：Optochin（乙基氫化羥基奎寧，ethylhydrocupreine）能干

擾肺炎鏈球菌葉酸合成，抑制肺炎鏈球菌生長.故肺炎鏈球菌對

Optochin敏感,而其他鏈球菌不敏感.

2）方法:先挑取被檢的菌落密集涂布于血瓊脂平板上,再將Optochin紙

片（5g/片）貼于培養(yǎng)基上,35c培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果.

3）結(jié)果判斷:抑菌圈直徑214mm為敏感,可判斷為肺炎鏈球菌;其他鏈球

菌耐藥,直徑＜14mm.

4）注意事項(xiàng):近年來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對Optochin耐藥的肺炎鏈球菌,如抑菌圈

直徑較小應(yīng)再做膽汁溶菌試驗(yàn)以確認(rèn).

（6）膽汁溶菌試驗(yàn)

1）試驗(yàn)原理:膽汁或膽鹽能活化肺炎鏈球菌的自溶酶，使肺炎鏈球菌細(xì)

胞破損而溶解.

2）方法：

①平板法:在血瓊脂平板上找到呈草綠色溶血環(huán)的菌落,然后在此菌落

上加1滴100g/L去氧膽酸鈉溶液,35℃孵育15~30111S后觀察結(jié)果.

結(jié)果判斷:若菌落消失則為陽性,不消失為陰性.

②試管法:取2支試管,一支加入甲型鏈球菌血清肉湯培養(yǎng)液1ml,另一

支加含肺炎鏈球菌血清肉湯培養(yǎng)液1ml.再于2管中分別加入100g/L去氧

膽酸鈉溶液0.1ml,混勻后37c水浴30min后觀察結(jié)果.

結(jié)果判斷:液體變透明為陽性，依然混濁為陰性.

3）意義:此試驗(yàn)通常用于鑒別肺炎鏈球菌與甲型鏈球菌.

4.血清學(xué)試驗(yàn)（鏈球菌快速分群乳膠凝集試驗(yàn)）

（1）試驗(yàn)原理:對人類致病的鏈球菌90%屬于A群,少數(shù)屬于B,C,D,F,G群.

用這6群抗原的兔免疫血清分別致敏的乳膠顆粒與鏈球菌進(jìn)行間接乳膠

凝集反應(yīng)，可快速對鏈球菌做出分群鑒定.

(2)方法:挑取2~3個(gè)待檢菌落轉(zhuǎn)種于含有0.4ml提取酶的試管中,使其變

為乳化均勻的菌懸液,置37℃水浴10~15min后備用.在卡片的相應(yīng)區(qū)域

各加1滴A,B,C,D,F,G致敏膠乳,再加入菌懸液各1滴分別與6種膠乳輕搖

混勻觀察結(jié)果.

⑶結(jié)果判斷:發(fā)生乳膠凝集為陽性，與6群中哪種乳膠顆粒凝集則待測

菌可鑒定為相應(yīng)群.

5.抗鏈球菌溶血素"0"抗體(antistreptolysin0,ASO)的測定(抗"0”試

驗(yàn))——乳膠法

鏈球菌溶血素〃0〃抗原性強(qiáng),在感染2?3周后可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗鏈球菌溶

血素〃?！贵w,測定該抗體含量可用于鏈球菌近期感染或風(fēng)濕熱的輔助

診斷.其檢測方法分溶血法和乳膠法,后者方法簡便，快速，應(yīng)用廣泛.

(1)原理:ASO高滴度的病人血清被適量的溶血素中和后，抗體量減少,

多余的抗抗體與ASO乳膠試劑反應(yīng)則會(huì)出現(xiàn)凝集顆粒.

(2)方法:先將病人血清56℃30min滅活,然后用生理鹽水1:15稀釋,在反

應(yīng)板各孔中分別滴加稀釋血清,陽性和陰性對照血清1滴,再往各孔中滴

加1滴溶血素〃0〃溶液,振蕩混勻后,往各孔再滴加1滴ASO乳膠試劑.輕搖

3min后觀察結(jié)果.

⑶結(jié)果判斷：出現(xiàn)凝集為陽性,不凝集為陰性(AS0W250U/ml).

(4)注意事項(xiàng)：當(dāng)加入ASO乳膠后，輕搖至3min時(shí)應(yīng)該立即記錄結(jié)果，超

過3min出現(xiàn)的凝集不作為陽性.另外標(biāo)本發(fā)生溶血,高脂,高膽紅素,高

膽固醇,類風(fēng)濕因子或標(biāo)本被污染都會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果.若室溫低于10℃,

應(yīng)該由延長反應(yīng)時(shí)間Imin,室溫每升高10C應(yīng)縮短反應(yīng)時(shí)間Imin.

【鑒定依據(jù)】

1.初步鑒定:根據(jù)菌落特點(diǎn),溶血,菌體形態(tài)染色性,觸酶試驗(yàn)作出初步

鑒定.

2.最終鑒定：根據(jù)桿菌肽敏感試驗(yàn),Optochin敏感試驗(yàn)，膽汁溶菌試

驗(yàn),CAMP試驗(yàn),血清學(xué)試驗(yàn)等進(jìn)行進(jìn)一步鑒定.

【臨床意義】

鏈球菌是一類常見的化膿性球菌,廣泛分布于自然界,也是人體的正常

菌群.大多數(shù)鏈球菌不致病，對人致病的鏈球菌90%以上屬于A群,引起的

疾病主要有各種化膿性炎癥，猩紅熱,新生兒敗血癥，細(xì)菌性心內(nèi)膜炎,

風(fēng)濕熱，腎小球腎炎等.

【結(jié)果記錄和報(bào)告】

1.記錄各種鏈球菌的鏡下形態(tài)和菌落特點(diǎn).

2.記錄各種鏈球菌生化反應(yīng)的結(jié)果.

實(shí)驗(yàn)十三奈瑟菌屬和布蘭漢菌屬檢驗(yàn)

【目的和要求】

1.掌握腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌的形態(tài)和培養(yǎng)特性.

2.掌握腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌的鑒別要點(diǎn).

3.熟悉卡他布蘭漢菌的形態(tài)和培養(yǎng)特性.

【試劑與器材】

1.腦膜炎奈瑟菌,淋病奈瑟菌及卡他布蘭漢菌菌種和染色示教片.

2.培養(yǎng)基:巧克力色血平板，血平板,葡萄糖，麥芽糖,蔗糖發(fā)酵管,硝酸

鹽培養(yǎng)基,DNA瓊脂培養(yǎng)基等.

3.試劑:革蘭染色液,氧化酶試劑,硝酸鹽還原試劑，lmol/L鹽酸.

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

一,標(biāo)本采集

1.腦膜炎奈瑟菌:根據(jù)病情和病程采集不同標(biāo)本.菌血癥期采血液,有出

血點(diǎn)取瘀斑滲出液,有腦膜炎癥狀者取腦脊液,上呼吸道感染和帶菌者

采鼻咽拭子和分泌物等.

2.淋病奈瑟菌：男性患者用無菌棉簽取膿性分泌物,非急性期病人可將

棉簽插入尿道2~4cm,轉(zhuǎn)動(dòng)拭子后取出；女性患者取宮頸分泌物;新生兒

眼結(jié)膜炎患者取結(jié)膜分泌物.

3.卡他布蘭漢菌:根據(jù)感染部位采集血液，腦脊液,穿刺液等.

二,檢驗(yàn)程序

腦脊液瘀血點(diǎn)穿刺液,鼻咽分泌物，咽喉拭子血液

離心

上清液沉淀分離培養(yǎng)增菌培養(yǎng)

（血平板或巧克力平板,5%C02）（葡萄糖肉湯等,5%C02）

直接凝集涂片染色

挑取可疑菌落

初報(bào)

涂片染色氧化酶試驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn)血清凝集試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)

報(bào)告

圖13T腦膜炎奈瑟菌的檢驗(yàn)程序

注:淋病奈瑟菌的檢驗(yàn)程序可參照腦膜炎奈瑟菌.

三,檢驗(yàn)方法

1.菌落觀察

將腦膜炎奈瑟菌，淋病奈瑟菌及卡他布蘭漢菌的菌種分別接種在血平板

和巧克力色血平板上,35℃,5隊(duì)02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察菌落.

(1)腦膜炎奈瑟菌:在巧克力平板上菌落為圓形,光滑濕潤,扁平,半透明,

邊緣整齊,大小約廣2nim;在血平板上不溶血.

⑵淋病奈瑟菌:菌落呈圓形，凸起,光滑濕潤,大小約0.51mm，灰白色.

在血平板上不溶血.

⑶卡他布蘭漢菌:菌落呈淺紅棕色,不透明,干燥,大小約「3mm.

2.形態(tài)觀察將腦膜炎奈瑟菌，淋病奈瑟菌及卡他布蘭漢菌經(jīng)革蘭染色

后觀察鏡下形態(tài).

3.生化反應(yīng)

(1)氧化酶試驗(yàn):奈瑟菌屬氧化酶試驗(yàn)陽性.(原理,方法見實(shí)驗(yàn)五)

(2)三糖(葡萄糖,麥芽糖,蔗糖)發(fā)酵試驗(yàn)

1)試驗(yàn)原理:腦膜炎奈瑟菌可分解葡萄糖和麥芽糖,淋病奈瑟菌只分解

葡萄糖，卡他布蘭漢卡菌不分解任何糖類.分解糖后會(huì)使發(fā)酵管內(nèi)Ph值

下降,使發(fā)酵管內(nèi)的指示劑變黃色.

2)方法:將腦膜炎奈瑟菌,淋病奈瑟菌及卡他布蘭漢菌分別接種葡萄糖，

麥芽糖,蔗糖發(fā)酵管,35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果.

3）結(jié)果判斷:培養(yǎng)基變黃為陽性,不變色（紫色）為陰性.

⑶硝酸鹽還原試驗(yàn):奈瑟菌多為陰性而卡他布蘭漢菌為陽性，可用于該

菌屬間的鑒別.（原理,方法見附錄3）

（4）DNA酶試驗(yàn):卡他布蘭漢菌為陽性,奈瑟菌屬均為陰性.（原理,方法見

附錄3）

表13-1奈瑟菌和卡他布蘭漢菌的主要生化反應(yīng)

菌種氧化酶葡萄糖麥芽糖蔗糖硝酸鹽還原DNA酶

腦膜炎奈瑟菌+++--------

淋病奈瑟菌++-----------

卡他布蘭漢菌+--------++

四，注意事項(xiàng)

1.腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌對外界抵抗力弱,采集標(biāo)本后應(yīng)立即送檢,

并注意保溫,最好床邊接種.

2.淋病奈瑟菌和腦膜炎奈瑟菌在24h后均可出現(xiàn)自溶,應(yīng)該及時(shí)觀察結(jié)

果并及時(shí)轉(zhuǎn)種.

【鑒定依據(jù)】

1.初步鑒定:腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌鏡下形態(tài)均為G-球菌,腎形或

豆形,成雙排列,位于細(xì)胞內(nèi)外，臨床標(biāo)本直接涂片染色鏡檢有助于初步

診斷.

2.最終鑒定:根據(jù)菌落特點(diǎn)，氧化酶試驗(yàn)，糖發(fā)酵試驗(yàn)，硝酸鹽還原試

驗(yàn),DNA酶試驗(yàn)等生化反應(yīng)作進(jìn)一步鑒定.

【臨床意義】

腦膜炎奈瑟菌的傳染源是病人或帶菌者,正常情況下可寄居于人體鼻咽

部.經(jīng)呼吸道感染,感染者以5歲以下兒童為主,引起流行性腦脊髓膜炎.

淋病奈瑟菌傳染源是病人,經(jīng)性接觸或垂直傳播,引起淋病或新生兒淋

菌性限結(jié)膜炎.卡他布蘭漢菌是條件致病菌，當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)可引

起粘膜卡他性炎癥,急性咽喉炎,支氣管炎，肺炎，心內(nèi)膜炎,敗血癥或腦

膜炎等,是醫(yī)院內(nèi)感染的常見病原菌.

【結(jié)果記錄和報(bào)告】

1.記錄三種細(xì)菌的鏡下形態(tài)特點(diǎn).

2.描述三種細(xì)菌的菌落形態(tài).

實(shí)驗(yàn)十四大腸埃希菌檢驗(yàn)

【目的和要求】

1.掌握大腸埃希菌的形態(tài),染色特點(diǎn)，培養(yǎng)特性,生化反應(yīng),常見類型及

鑒定依據(jù).

2.熟悉大腸埃希菌的血清學(xué)及動(dòng)物試驗(yàn).

【試劑與器材】

1.菌種:大腸埃希菌,EPEC,ETEC,EIEC,EHEC.

2.培養(yǎng)基:克氏雙糖鐵(KIA),MIU培養(yǎng)基,葡萄糖蛋白陳水,枸檬酸鹽瓊

脂斜面,硝酸鹽培養(yǎng)基,SS瓊脂培養(yǎng)基,EMB培養(yǎng)基,SMAC瓊脂培養(yǎng)基.

3.試劑:EPEC3組多價(jià)診斷血清和12種單價(jià)診斷血清,EIECOKI,II兩

組多價(jià)診斷血清和8種單價(jià)診斷血清,氧化酶試劑，甲基紅試劑,40%K0H

溶液,3%H202溶液,革蘭染色液.

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

一,標(biāo)本采集

根據(jù)不同疾病,采集不同部位標(biāo)本,如：中段尿,膿汁,痰液,血液,膽汁,

腦脊液,糞便,直腸拭子等.

二,檢驗(yàn)程序

膿液,痰液，膽汁,血液,腦脊液糞便,直腸拭子

分泌物，尿（定量培養(yǎng)）

革蘭染色分離培養(yǎng)增菌培養(yǎng)分離培養(yǎng)

鏡檢（血平板,MAC）（MAC,EMB）

可疑菌落

腸外感染腸道感染

菌落特征系統(tǒng)生化反應(yīng)ETECEPEC,EIEC,EHEC

革蘭染色

KIA,MIU生化反應(yīng)腸毒素測定0K多價(jià)生化反應(yīng)血清學(xué)分型

血清凝集

結(jié)果報(bào)告

結(jié)果報(bào)告

圖14T大腸埃希菌的檢驗(yàn)程序

三,實(shí)驗(yàn)方法

1.形態(tài)觀察:涂片革蘭染色后鏡檢.

2.菌落觀察

取普通大腸埃希菌及EPEC,ETEC,EIEC,EHEC分別接種在SS平板,EMB

培養(yǎng)基上,35℃24h觀察結(jié)果.

SS平板:菌落較小,紅色,圓形,光滑,凸起,邊緣整齊.

EMB培養(yǎng)基:紫黑色,有金屬光澤,較大,圓形,凸起,不透明.

SMAC培養(yǎng)基:大腸埃希菌0157菌落呈無色，中等大小，圓形,光滑凸起.

3.生化反應(yīng)

⑴氧化酶試驗(yàn):取氧化酶紙片，用紙片刮取待測菌落,觀察紙片的顏色

變化.變?yōu)樗{(lán)紫色為陽性,不變色為陰性.大腸埃希菌為陰性.

(2)其他生化反應(yīng):將大腸埃希菌分別接種在克氏雙糖鐵(KIA),MIU培養(yǎng)

基,葡萄糖蛋白陳水,枸檬酸鹽瓊脂斜面,硝酸鹽培養(yǎng)基管中，35℃培養(yǎng)

18?24h后觀察結(jié)果,并進(jìn)一步做觸酶試驗(yàn).

表14T大腸埃希菌的初步生化反應(yīng)

KIAMIU甲基紅VP枸椽酸鹽觸氧化酶硝酸鹽

乳糖葡萄糖產(chǎn)氣H2S動(dòng)力U引跺胭酶試驗(yàn)試驗(yàn)利用試驗(yàn)酶試

驗(yàn)還原

+++/-----+/—+—+------+—+

—+----++—+------+—+

—+--------+—+------+—+

—++—+/—+—+----+—+

4.血清學(xué)反應(yīng)

(DEPEC的鑒定:凡生化反應(yīng)符合大腸埃希菌特征，懷疑為EPEC感染者,

取KIA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物分別與EPEC的0K多價(jià)I,II,HI組診斷血

清作玻片凝集試驗(yàn).如與其中某一組多價(jià)血清凝集則繼續(xù)與該組單價(jià)分

型血清作玻片凝集試驗(yàn),若發(fā)生凝集,表示細(xì)菌具有某型EPEC的K抗原,

需進(jìn)一步鑒定其0抗原型別.先將菌液加熱100C,lh,再與該分型血清進(jìn)

行玻片凝集試驗(yàn)，以確定?？乖蛣e.根據(jù)0,K抗原鑒定結(jié)果可判斷EPEC

的血清型.

(2)EIEC的鑒定:血清學(xué)鑒定方法與EPEC相同,血清學(xué)分型為0152和

0124.因與志賀菌的抗血清有交叉反應(yīng),且生化反應(yīng)與臨床表現(xiàn)相似,需

注意鑒別，主要鑒別試驗(yàn)為：醋酸鹽,葡萄糖錢利用試驗(yàn),粘質(zhì)酸鹽產(chǎn)酸

試驗(yàn),EIEC均為(+),志賀菌為(―).

(3)EHEC(0157:H7)鑒定:篩選SMAC上的無色,中等大小菌落，且生化反應(yīng)

符合標(biāo)準(zhǔn)大腸埃希菌生化反應(yīng),用0157抗血清做乳膠凝集試驗(yàn)檢測其

0157抗原.

(4)ETEC的鑒定:通過分離培養(yǎng),生化反應(yīng),血清學(xué)分型和腸毒素測定作

出鑒定.

【臨床意義】

大腸埃希菌是腸道桿菌的重要成員，是一種常見的條件致病菌,常引起

多種腸外感染，如泌尿系統(tǒng)感染,膽囊炎,手術(shù)傷口感染,腹膜炎等.致病

性的大腸桿菌引起各種腸道感染.

因大腸埃希菌從糞便排出故常用作水源或食品被糞便污染的檢測指標(biāo).

【結(jié)果記錄和報(bào)告】

1.記錄大腸埃希菌的鏡下形態(tài)特點(diǎn).

2.記錄大腸埃希菌的菌落特點(diǎn).

實(shí)驗(yàn)十五沙門菌屬檢驗(yàn)

【目的和要求】

1.掌握沙門菌屬的檢驗(yàn)程序和檢驗(yàn)方法.

2.熟悉沙門菌屬檢驗(yàn)的報(bào)告方法.

3.掌握肥達(dá)反應(yīng)的原理,方法,結(jié)果判讀及報(bào)告方法.

【試劑與器材】

1.菌種:傷寒沙門菌，甲，乙，丙副傷寒沙門菌.

2.培養(yǎng)基:SS培養(yǎng)基,EMB培養(yǎng)基或MAC培養(yǎng)基,KIA培養(yǎng)基,MIU培養(yǎng)基,

葡萄糖0/F培養(yǎng)基，蛋白陳水,葡萄糖蛋白月東水,枸椽酸鹽培養(yǎng)基,硝酸鹽

培養(yǎng)基等.

3.試劑:靛基質(zhì)試劑，甲基紅試劑,V-P試劑,3%H202,革蘭染液,氧化酶

試劑,沙門菌屬診斷血清,肥達(dá)反應(yīng)試劑等.

4.其它:顯微鏡,載玻片,接種環(huán),酒精燈,生理鹽水,試管，吸管等.

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

一,病原學(xué)檢查

1.標(biāo)本采集

腸熱癥第一周取血,第二,三周取大便,尿標(biāo)本,整個(gè)病程均可取骨髓.食

物中毒:取嘔吐物,腹泄物或殘余食物.敗血癥取血液.從病程第二周開

始可取病人血清做肥達(dá)反應(yīng)協(xié)助診斷腸熱癥.

2.檢驗(yàn)程序

糞便血液，骨髓

增菌培養(yǎng)分離培養(yǎng)增菌培養(yǎng)

（亞硒酸鹽增菌液）（SS,EMB,血平板）（膽鹽葡萄糖肉湯）

35℃18-24h

可疑菌落菌落特點(diǎn)

GS鏡檢

初步鑒定0/F,KIA,MIU

生化反應(yīng)：IMViC

最終鑒定A-F多價(jià)血清凝集

腸桿菌系統(tǒng)生化反應(yīng)單價(jià)因子血清定血清型藥敏試驗(yàn)

報(bào)告

3.檢驗(yàn)方法

（1）培養(yǎng)物觀察

將沙門菌屬細(xì)菌分別接種在SS,EMB等腸道選擇培養(yǎng)基上35℃培養(yǎng)

18-24h觀察結(jié)果.由于本菌不發(fā)酵乳糖,故在SS,EMB平板上為無色半透

明光滑型小菌落,產(chǎn)生H2S的細(xì)菌可在SS平板上形成中心帶黑褐色的小

菌落.

（2）形態(tài)學(xué)觀察

取沙門菌屬細(xì)菌培養(yǎng)物涂片GS鏡檢，為G-無芽胞桿菌，鞭毛染色標(biāo)本,

鏡下可見周鞭毛.

G）生化反應(yīng)

從SS平板上挑取單個(gè)菌落分別接種于0/F,KIA,MIU及硝酸鹽培養(yǎng)基等

35℃培養(yǎng)18-24h觀察結(jié)果，同時(shí)做氧化酶試驗(yàn),觸酶試驗(yàn),靛基質(zhì)，甲基

紅及V-P試驗(yàn),觀察并記錄結(jié)果,最終鑒定需做全面生化反應(yīng)及血清學(xué)鑒

定.

（4）血清學(xué)鑒定

用沙門菌診斷血清與待測菌做玻片凝集試驗(yàn)：

1）先用A-F多價(jià)0血清與待測菌做玻片凝集試驗(yàn),如凝集,則分別用群特

異性0血清（02,4,7,9……）與待測菌做玻片凝集試驗(yàn),確定并記錄0抗

原型別以定群.

2）用該群內(nèi)II第1相抗血清與待測菌做玻片凝集試驗(yàn),確定凝集后記錄H

抗原的第1相抗原型別以定型（種）.

3）根據(jù)記錄的0,H抗原型別,查沙門菌屬抗原組成表,以確定待測菌的血

清型和菌名.

4）如果沙門菌屬的抗原組成表有2種以上的血清型抗原與本次實(shí)驗(yàn)的分

離株相同,則需凝集第2相H抗凰確定凝集,記錄結(jié)果，查沙門菌屬抗原

組成表，以確定待測菌的血清型和菌名.

5）如果仍有2種以上的血清型抗原組成相同，則需參照抗原組成表中推

薦的補(bǔ)充生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定.

6）若生化反應(yīng)典型，但與A-F多價(jià)0血清不凝集,則待測菌可能有表面

抗原存在,需刮取菌苔用生理鹽水配成濃菌液,100℃水浴加熱30min,再

重復(fù)①?⑤步驟，以確定菌株的血清型和菌名，如果仍然與A-F群多價(jià)血

清不凝集,則可能為非A-F群沙門菌.

4.注意事項(xiàng)

⑴臨床菌落觀察需仔細(xì)，不要漏檢靠近發(fā)酵乳糖型菌落周邊的可疑菌

落.

(2)生化反應(yīng)典型而不與A-F多價(jià)血清凝集者,要考慮Vi-Ag的存在.

⑶如血清學(xué)鑒定能定群，但又不能用因子血清定型者,要想到鞭毛變異

的可能性.

(4)嚴(yán)格無菌操作,注意生物安全.

二，肥達(dá)反應(yīng)(試管法)

1.原理:用已知的傷寒沙門菌0和H抗原，甲，乙型副傷寒桿菌的II抗原

(PA,PB)與腸熱癥患者的血清做定量凝集試驗(yàn),測定患者血清中相應(yīng)抗

體的含量,以協(xié)助診斷腸熱癥.

2.方法：

(1)取28支試管分4排,每排7管排于試管架上,并編號(hào).

(2)每管各加生理鹽水0.5ml.

⑶每排第1管各加1:10待檢血清0.5ml,并做對倍稀釋，即從每排的第1

管開始輕輕混勻,然后吸取0.5ml置于第2管,如此類推,直至第6管混勻

棄去0.5ml,第7管不加血清作為陰性對照.此時(shí)第1飛管的血清稀釋度分

別為1:20,1:40,1:80,1:160,1:320,1:640.

(4)每排的第r7管加相應(yīng)診斷菌液(TO,TH,PA,PB)各0.5ml,至此第1飛

管血清最終稀釋度分別為1:40?1:1280.(表15T)

表15T肥達(dá)試驗(yàn)試管法

試管號(hào)1234567

生理鹽水(ml)0.50.50.50.50.50.50.5

1:10稀釋血清(ml)0.50.50.50.50.50.5棄0.5一

血清稀釋度1:201:401:801:1601:3201:640—

診斷菌液(ml)0.50.50.50.50.50.50.5

(每排分別加四種菌液)

血清最終稀釋度1:401:801:1601:3201:6401:1280一

(5)混勻置室溫或35℃溫箱24h后觀察結(jié)果.

3.結(jié)果判斷及報(bào)告

(1)結(jié)果判斷

先觀察對照管,液體均勻混濁無凝集，但管底可有呈同心圓狀的點(diǎn)狀沉

淀物,輕搖則消失,再分別與對照管比較觀察各管的凝集情況.根據(jù)液體

透明度和凝集塊多少，以++++,+++,++,+,-等符號(hào)記錄各管結(jié)果.以出現(xiàn)

〃++”凝集的最高血清稀釋度為抗體效價(jià).

++++細(xì)菌100%凝集,管內(nèi)液體清亮,可見管底有大片邊緣不整的白色凝

集物,輕搖時(shí)可見有明顯的顆粒,薄片或絮狀.

+++細(xì)菌75%的凝集,液體輕度混濁,管底有邊緣不整的白色凝集物,輕

搖時(shí)也可見明顯的顆粒,薄片或絮狀.

++細(xì)菌50%的凝集,液體較混濁,管底有明顯可見的少量凝集物呈顆粒

狀.

+細(xì)菌25%的凝集,液體混濁,管底凝集呈顆粒狀,細(xì)小不易觀察.

-不凝集,液體混濁度及管底沉淀物與對照管相似.

(2)報(bào)告方式

根據(jù)凝集效價(jià)判定方法，報(bào)告待檢血清對TO,TH,PA,PB的凝集效價(jià).如果

第1管仍無凝集現(xiàn)象,應(yīng)報(bào)告"：1280〃.

4.注意事項(xiàng)

(1)抗原抗體反應(yīng)在比例適當(dāng)時(shí)，才能出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng).如果抗體濃

度高,則無凝集物形成，此為前帶現(xiàn)象,需要在判定結(jié)果時(shí)加以鑒別.

(2)判定結(jié)果時(shí),應(yīng)在暗背景下透過強(qiáng)光檢查.

⑶結(jié)果觀察時(shí)不要搖動(dòng)試管,先觀察.必要時(shí)再輕搖試管，使凝集塊從

管底升起,然后按液體的清濁,凝集塊的大小進(jìn)行記錄.

(4)〃H〃凝集呈絮狀，以疏松的棉絮狀大團(tuán)鋪于管底,輕搖試管即能蕩起,

且極易散開.凝集呈顆粒狀，以堅(jiān)實(shí)凝片沉于管底,輕搖試管不易蕩

起,且不易散開.

(5)注意吸液,移液的量,及溫度,PH,電解質(zhì)等對本試驗(yàn)結(jié)果的影響.

【鑒定依據(jù)】

1.初步鑒定

根據(jù)菌落特點(diǎn)，菌落涂片，GS鏡檢,0/F為發(fā)酵型,KIA及MIU的特

點(diǎn)，IMViC及A-F多價(jià)抗血清凝集試驗(yàn)作出初步鑒定.

2.最終鑒定

需做全面的生化反應(yīng)及血清學(xué)鑒定.

3.報(bào)告方式

⑴陰性報(bào)告:分離培養(yǎng)未發(fā)現(xiàn)可疑菌落或經(jīng)鑒定不符合沙門菌屬細(xì)菌

鑒定依據(jù)者可報(bào)告〃未分離出沙門菌

⑵初步報(bào)告:生化反應(yīng)符合沙門菌,A-F多價(jià)血清,玻片凝集試驗(yàn)陽性,

可初步報(bào)告〃分離出XX沙門菌〃或“X群沙門菌〃.

(3)最終報(bào)告:進(jìn)一步做多種生化反應(yīng)及因子血清分型后，可報(bào)告〃分離

出XX沙門菌〃.

【臨床意義】

1.沙門菌是引起消化道感染的常見病原菌，可致傷寒,副傷寒,敗血癥,

食物中毒.病原學(xué)檢驗(yàn)是確診的〃金標(biāo)準(zhǔn)〃.

2.肥達(dá)反應(yīng)常用于腸熱癥的輔助診斷.分析結(jié)果時(shí)，如取雙份血清進(jìn)行

肥達(dá)反應(yīng),第2次比第1次血清抗體效價(jià)高4倍以上,則具有重要的診斷意

義.如僅做一次肥達(dá)反應(yīng),則需結(jié)合當(dāng)?shù)鼐用竦恼？贵w水平,病程，以

及0抗體,II抗體效價(jià)等進(jìn)行綜合分析.

【結(jié)果記錄和報(bào)告】

1.記錄沙門菌的生化反應(yīng)結(jié)果.

2.描述沙門菌在SS,EMB平板上的菌落特點(diǎn).

3.報(bào)告本次鑒定結(jié)果.

實(shí)驗(yàn)十六志賀菌屬檢驗(yàn)

【目的和要求】

1.掌握志賀菌屬的檢驗(yàn)程序和檢驗(yàn)方法.

2.熟悉志賀菌屬檢驗(yàn)的報(bào)告方法.

【試劑與器材】

L菌種:志賀菌屬各群(A,B,C,D群).

2.培養(yǎng)基:SS培養(yǎng)基,EMB培養(yǎng)基或MAC培養(yǎng)基,KIA培養(yǎng)基,MIU培養(yǎng)

基,0/F培養(yǎng)基，蛋白陳水,葡萄糖蛋白陳水,枸椽酸鹽培養(yǎng)基,硝酸鹽培

養(yǎng)基等.

3.試劑:靛基質(zhì)試劑，甲基紅試劑,V-P試劑，革蘭染液,氧化酶試劑,3%

H202,志賀菌診斷血清等.

4.其它:顯微鏡,載玻片,接種環(huán),酒精燈,生理鹽水等.

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

1.標(biāo)本米集

糞便或肛門拭子（亦可肛門指檢取標(biāo)本）.

2.檢驗(yàn)程序

糞便或肛門拭子

增菌培養(yǎng)分離培養(yǎng)

（GN肉湯）（SS,EMB,MAC）

可疑菌落菌落特點(diǎn)

GS鏡檢

初步鑒定0/F,KIA,MIU

初步生化反應(yīng)

最終鑒定志賀菌多價(jià)血清凝集

腸桿菌系統(tǒng)生化反應(yīng)血清學(xué)鑒定毒力試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)

（因子血清凝集）（必要時(shí)一）

報(bào)告

3.檢驗(yàn)方法

（1）培養(yǎng)物觀察

將志賀菌屬細(xì)菌分別接種在SS,EMB或MAC等腸道選擇培養(yǎng)基上35℃培

養(yǎng)18-24h觀察結(jié)果，由于志賀菌不分解乳糖,形成中等大小,無色,半透

明,S型菌落.宋內(nèi)氏志賀菌遲緩分解乳糖，培養(yǎng)48h后轉(zhuǎn)為分解乳糖型有

色菌落.

(2)形態(tài)學(xué)觀察

取志賀菌屬細(xì)菌培養(yǎng)物涂片,GS鏡檢為G-無芽胞桿菌.

(3)生化反應(yīng)

從選擇培養(yǎng)基上挑選可疑菌落分別接種于0/F,KIA,MIU,硝酸鹽,蛋白豚

水,葡萄糖蛋白陳水等培養(yǎng)基及甘露醇,枸椽酸鹽培養(yǎng)基管,經(jīng)35℃培養(yǎng)

18-24h后觀察，記錄結(jié)果.KIA培養(yǎng)物48h后再觀察一次,是否發(fā)生變化.

同時(shí)做氧化酶,觸酶,靛基質(zhì)，甲基紅,V-P等試驗(yàn)觀察記錄結(jié)果.

(4)血清學(xué)鑒定

凡生化反應(yīng)符合志賀菌屬者需做血清學(xué)鑒定.

1)血清學(xué)鑒定原則

①待測菌與志賀菌四群多價(jià)血清做玻片凝集，確定凝集則為志賀菌屬細(xì)

菌.

②待測菌分別與各群多價(jià)血清做玻片凝集，確定凝集，以定群，由于B群

最常見故先從B群做起.

③待測菌+該群內(nèi)各型因子血清做玻片凝集,確定凝集以定型.

2)根據(jù)生化反應(yīng)選做血清學(xué)鑒定:為了簡化鑒定方法,可參考生化反應(yīng)

選做血清學(xué)鑒定,其方法如下：

甘露醇發(fā)酵(-)靛基質(zhì)試驗(yàn)(-)選用A群I型診斷血清

甘露醇發(fā)酵(-)靛基質(zhì)試驗(yàn)(+)選用A群II型診斷血清

甘露醇發(fā)酵(+)乳糖(-)選用B群多價(jià)診斷血清

甘露醇發(fā)酵(+)乳糖遲緩(+)選用D群診斷血清

甘露醇發(fā)酵(+)B群及D群診斷血清不凝集,再選用C群診斷，仍不凝集,

應(yīng)考慮K抗原的存在,取菌苔經(jīng)100℃水浴30min破壞K抗原,再做血清學(xué)

鑒定.

4.注意事項(xiàng)

⑴臨床上菌落觀察需仔細(xì)，不要漏檢靠近發(fā)酵乳糖型菌落周邊的可疑

菌落.

(2)生化反應(yīng)典型而又不與志賀菌四群多價(jià)血清凝集者,要考慮K抗原的

存在.

(3)非典型菌株,可用傳代法恢復(fù)典型性狀,然后鑒定.

⑷中毒性痢疾應(yīng)盡量快速診斷.

(5)嚴(yán)格無菌操作,注意生物安全.

【鑒定依據(jù)】

1.初步鑒定

根據(jù)菌落特點(diǎn),菌落涂片GS鏡檢,0/F為發(fā)酵型,KIA及MIU,甘露醇,靛基

質(zhì)等生化反應(yīng)的特點(diǎn)，與志賀菌四群多價(jià)血清凝集,可做出初步鑒定.

2.最終鑒定

需做全面的生化反應(yīng)及血清學(xué)鑒定，必要時(shí)尚需做毒力試驗(yàn).

3.報(bào)告方式

(1)陰性報(bào)告:分離培養(yǎng)未見可疑菌落,或經(jīng)鑒定不符合志賀菌屬鑒定依

據(jù)者,可報(bào)告“未分離出志賀菌屬細(xì)菌

(2)初步報(bào)告:生化反應(yīng)符合志賀菌,志賀菌四群多價(jià)血清玻片凝集試驗(yàn)

陽性,可報(bào)告〃分離出志賀菌〃或〃義群志賀菌〃.

(3)最終報(bào)告:進(jìn)一步生化反應(yīng)及因子血清分型后，可報(bào)告〃分離出X群

志賀菌X型〃.

【臨床意義】

志賀菌屬是引起細(xì)菌性痢疾的病原菌.臨床上引起痢疾樣癥狀的病原生

物除志賀菌外，尚有痢疾阿米巴,某些致病性大腸桿菌等,故病原學(xué)檢測

時(shí)需與這些病原生物相鑒別.

【結(jié)果記錄和報(bào)告】

1.記錄志賀菌各群的生化反應(yīng)結(jié)果.

2.描述志賀菌在SS,EMB平板上的菌落特點(diǎn).

3.報(bào)告本次鑒定結(jié)果.

實(shí)驗(yàn)十七其它腸桿菌檢驗(yàn)

【目的和要求】

1.熟悉變形桿菌屬，克雷伯菌屬,腸桿菌屬的生物學(xué)特性及其培養(yǎng)鑒定

法.

2.熟悉變形桿菌屬，克雷伯菌屬，腸桿菌屬檢驗(yàn)的報(bào)告方法.

【試劑與器材】

1.示教片:變形桿菌鞭毛染色片,肺炎克雷伯菌莢膜染色片，鼠疫耶爾森

氏菌革蘭染色片.

2.菌種:變形桿菌,肺炎克雷伯菌，產(chǎn)氣桿菌.

3.培養(yǎng)基:普通平板,SS平板,EMB平板,KIA及MIU培養(yǎng)基,蛋白陳水,葡

萄糖蛋白陳水,枸椽酸鹽,尿素培養(yǎng)基等.

4.試劑:革蘭染液,靛基質(zhì)試劑，甲基紅試劑,V-P試劑,生理鹽水.

5.其它:載玻片,接種環(huán),酒精燈,顯微鏡等.

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

1.標(biāo)本米集

根據(jù)不同病變可采集痰,尿,糞,滲出物及血標(biāo)本等.

2.檢驗(yàn)程序

標(biāo)本

痰,滲出物,尿糞便血

（硫酸鎂肉湯增菌）

直接涂片血平板,SS及SS,EMB及

染色鏡檢普通平板普通平板

初報(bào)

可疑菌落

菌落特點(diǎn)

初步鑒定GS鏡檢

KIA,MIU

最終鑒定生化反應(yīng)

（腸桿菌系統(tǒng)生化反應(yīng)）

3.檢驗(yàn)方法

（1）培養(yǎng)物觀察

將變形桿菌，產(chǎn)氣桿菌，肺炎克雷伯菌分別接種于EMB,SS,血平板,普通

平板,35℃培養(yǎng)18-24h.注意觀察菌落的大小，形狀,顏色,粘度等特征,

并注意變形桿菌的遷徙生長現(xiàn)象.

(2)形態(tài)學(xué)觀察

1)示教片：變形桿菌鞭毛染色玻片示周鞭毛.肺炎克雷伯菌莢膜染色玻

片示莢膜.鼠疫耶爾森氏菌革蘭染色玻片示G-桿菌.

2)培養(yǎng)物菌落涂片革蘭染色鏡檢,注意它們的形態(tài),排列,染色性.

(3)生化反應(yīng)

1)觀察變形桿菌，肺炎克雷伯菌,產(chǎn)氣桿菌在KIA及MIU培養(yǎng)基上的生長

情況.

2)觀察產(chǎn)氣桿菌和肺炎克雷伯菌的IMViC試驗(yàn)結(jié)果，注意與大腸埃希菌

區(qū)別.

【鑒定依據(jù)】

1.根據(jù)菌落特征,形態(tài)特點(diǎn),生化反應(yīng)做出初步鑒定,最終鑒定需做全面

的生化反應(yīng).

2.報(bào)告方式

(1)初步報(bào)告:痰,分泌物,滲出物等標(biāo)本直接涂片革蘭染色鏡檢,找到G-

桿菌,可初步報(bào)告“某標(biāo)本直接鏡檢找到G-桿菌

(2)陰性報(bào)告:分離培養(yǎng)未發(fā)現(xiàn)可疑菌落或經(jīng)鑒定不符合變形桿菌,克雷

伯菌等可報(bào)告為〃未分離出肺炎克雷伯菌〃等.

(3)陽性報(bào)告:分離出的菌落經(jīng)鑒定符合某菌則報(bào)告〃分離出X義細(xì)菌〃.

【臨床意義】

1.變形桿菌屬，克雷伯菌屬是條件致病菌,好發(fā)于免疫力低下的人群,在

臨床上可致多部位,多臟器的感染,故檢測的標(biāo)本有多種,各菌的鑒定方

法各異.

2.其他腸桿菌種類多，一般不致病或?yàn)闂l件致病菌，引起臨床感染的類

型多種多樣.如檢出菌一時(shí)難以鑒定時(shí)一,要想到其它少見腸桿菌之可能,

可保留菌種送上一級(jí)微生物實(shí)驗(yàn)室鑒定.

【結(jié)果記錄和報(bào)告】

1.繪出變形桿菌，肺炎克雷伯菌,產(chǎn)氣桿菌革蘭染色鏡下圖.

2.記錄變形桿菌,產(chǎn)氣桿菌，肺炎克雷伯菌在SS,EMB,血平板,普通平板

的菌落特征及生化反應(yīng).

3.報(bào)告本次鑒定結(jié)果.

實(shí)驗(yàn)十八弧菌屬與彎曲屬檢驗(yàn)

【目的和要求】

1.熟悉霍亂弧菌,副溶血性弧菌,空腸彎曲菌，幽門螺桿菌的生物學(xué)特性

及其培養(yǎng)鑒定.

2.熟悉霍亂弧菌的血清學(xué)鑒定.

3.掌握上述細(xì)菌檢驗(yàn)的報(bào)告方式.

【試劑與器材】

1.菌種:水弧菌,副溶血性弧菌,空腸彎曲菌,幽門螺桿菌.

2.培養(yǎng)基：堿性蛋白陳水，堿性瓊脂平板,TCBS瓊脂平板，血瓊脂平

板,3.5%NaCl普通瓊脂平板,KIA,MIU,Skirrow彎曲菌培養(yǎng)基，快速尿酶

培養(yǎng)基等.

3.試劑：氧化酶試劑,0.5%去氧膽酸鈉，0/129紙片（10mg/片及150mg/

片），3%H202,乙酸鉛試紙條，1%馬尿酸水溶液,尿素酶試劑,生理鹽水等.

4.其它:顯微鏡,接種環(huán),載玻片,酒精燈,培養(yǎng)箱等.

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

1.標(biāo)本米集

弧菌檢驗(yàn)可取嘔吐物,腹瀉物,殘余的食物或肛拭子.

彎曲菌檢驗(yàn)可取大便，血液,腦脊液.

幽門螺桿菌檢驗(yàn)可取胃粘膜活組織.

2.檢驗(yàn)程序

（1）霍亂弧菌檢驗(yàn)程序

糞便,嘔吐物

增菌培養(yǎng)（堿性蛋白陳水）快速診斷直接涂片，染色，動(dòng)力及制動(dòng)試驗(yàn)

分離培養(yǎng)（堿性瓊脂平板）

血清學(xué)鑒定初步報(bào)告

生化鑒定,分型終報(bào)告

⑵幽門螺桿菌檢驗(yàn)程序

胃粘膜活檢標(biāo)本

直接涂片染色鏡檢分離培養(yǎng)（改良Skirrow）快速診斷

疑似幽門螺桿菌可疑菌落尿素酶試驗(yàn)

初報(bào)告生化反應(yīng)

終報(bào)告

（3）彎曲菌檢驗(yàn)程序

血液,腦脊液糞便或肛拭子

增菌（布氏肉湯）卡布運(yùn)送培養(yǎng)基

25℃37℃

分離培養(yǎng)革蘭染色鏡檢動(dòng)力試驗(yàn)

7天不生長生長（改良彎曲菌血平板）

陰性報(bào)告

可疑菌落

革蘭染色鏡檢動(dòng)力試驗(yàn)生化反應(yīng)

3.檢驗(yàn)方法

（1）培養(yǎng)物觀察

1）水弧菌接種