基因工程-基因克隆載體（動物生物技術(shù)）

動物生物技術(shù)基因工程載體構(gòu)建基因工程載體構(gòu)建基因工程載體構(gòu)建基因受體細(xì)胞進(jìn)不去在基因工程操作過程中，為什么需要載體?基因受體細(xì)胞即使進(jìn)入不能穩(wěn)定維持載體一、載體的定義：

通過不同途徑能將承載的外源DNA片段（基因）帶入受體細(xì)胞，并在其中得以穩(wěn)定維持的DNA分子稱為載體（vectors）。

基因工程載體構(gòu)建二、載體的功能：

1、運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞2、為外源基因提供復(fù)制能力和整合能力3、為外源基因的擴(kuò)增和表達(dá)提供必要條件三、作為基因克隆載體必須具備的條件：基因工程載體構(gòu)建（1）必須有供外源DNA片段插入的克隆位點(diǎn)（2）能攜帶外源DNA片段（基因）進(jìn)入受體細(xì)胞，進(jìn)行自我復(fù)制（3）具有用于選擇克隆子的標(biāo)記基因（4）必須是安全的（5）載體DNA分子應(yīng)盡可能小（6）載體中應(yīng)該含有能促進(jìn)外源DNA表達(dá)的調(diào)控區(qū)抗藥性基因（apr、cmr、smr、kanr、tcr）β-半乳糖苷酶基因（lacZ’）報(bào)告基因（gus）綠色熒光蛋白（gfp）四、載體的發(fā)展階段基因工程載體構(gòu)建

構(gòu)建載體的主要材料：最早質(zhì)粒DNA、病毒或噬菌體DNA，現(xiàn)在染色體DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA數(shù)量：上千種（1973年科恩構(gòu)建的第一個質(zhì)粒載體pSC101）第一階段：以質(zhì)粒、λ噬菌體、柯斯質(zhì)粒（黏粒）載體為主，特點(diǎn)在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定遺傳，易分離，轉(zhuǎn)化效率高，但克隆容量有限，＜45kb第二階段：載體容量擴(kuò)大，100kb～幾個Mb，YAC、BAC、PAC、HAC/MAC第三階段：BIBAC、TAC（可轉(zhuǎn)化人工染色體），較大的克隆容量，具有轉(zhuǎn)化植物的功能載體的種類和特征基因工程載體構(gòu)建載體名稱受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例質(zhì)粒*E.coli環(huán)狀〈8kbpUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，Λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli環(huán)狀100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細(xì)胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細(xì)胞線性染色體〉1000kb病毒載體動物細(xì)胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細(xì)胞和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒5.載體的分類依據(jù)載體的生物來源分為：DNA重組含義

病毒載體非病毒載體按照導(dǎo)入的受體生物分為：

大腸桿菌載體、酵母載體、植物載體‘動物載體根據(jù)載體的用途分為：克隆載體克隆載體表達(dá)載體基因工程載體構(gòu)建（一）質(zhì)粒載體是一種存在于宿主細(xì)胞染色體之外的裸露DNA分子。多存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。1、質(zhì)粒（plasmid）基因工程載體構(gòu)建（1）質(zhì)粒的基本特性1)自主復(fù)制性2)保持相對獨(dú)立的拷貝數(shù)3)分子小4)可轉(zhuǎn)移性5)攜帶遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：抗生素、抗抗生素、抗重金屬、產(chǎn)生細(xì)菌毒素等。對DNA重組分子的篩選具有重要意義。

resistancetransferfactor

（RTF耐藥性傳遞因子)—編碼性菌毛。質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移和復(fù)制基因工程載體構(gòu)建（2）質(zhì)粒載體的構(gòu)建①天然質(zhì)粒的局限性分子量大，拷貝數(shù)低第一個用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子大小9.1kb。有多個限制性酶切位點(diǎn)充當(dāng)克隆位點(diǎn)，Tetr作為篩選標(biāo)志。基因工程載體構(gòu)建（2）質(zhì)粒載體的構(gòu)建篩選標(biāo)志不理想ColE1質(zhì)粒的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素E1（colicinE1）。

可以通過插入失活篩選。但細(xì)菌群體容易自發(fā)突變出抗colicinE1的細(xì)胞。colicinE1能殺死不含ColE1質(zhì)粒的菌，形成“噬菌斑”。

唯一的克隆位點(diǎn)EcoRI正好位于這個基因的內(nèi)部。具有復(fù)制起點(diǎn)（ORI）具有抗菌素抗性基因：是篩選的標(biāo)志。理想的載體應(yīng)該有兩種抗菌素抗性基因。若干限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)：用來插入外源DNA片斷，且插入后不影響復(fù)制功能。具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。基因工程載體構(gòu)建（2）質(zhì)粒載體的構(gòu)建基因工程載體構(gòu)建（3）構(gòu)建質(zhì)粒載體的指導(dǎo)思想刪除不必要的DNA區(qū)域。減少限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。加入易于檢出的選擇性標(biāo)記，便于檢測含有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞。關(guān)于質(zhì)粒安全性能的改造。改造或增加基因表達(dá)的調(diào)控序列?；蚬こ梯d體構(gòu)建2、經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體（1）pSC101第一個成功地用于克隆實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。類型天然質(zhì)粒，屬低拷貝型。長度9.09kb。選擇標(biāo)記四環(huán)素抗性Tetr基因工程載體構(gòu)建克隆位點(diǎn)6個克隆位點(diǎn)：EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI主要使用EcoRI。（其中HindIII、BamHI、SalI3個位于選擇標(biāo)記Tetr的內(nèi)部）（2）pBR322：

F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工構(gòu)建載體?；蚬こ梯d體構(gòu)建①元件來源pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因復(fù)制起點(diǎn)oripMB1系列（來源于ColE1）的高拷貝型復(fù)制起點(diǎn)Ampr基因Tetr基因pSC101的Tetr基因基因工程載體構(gòu)建②長度③選擇標(biāo)記基因④克隆位點(diǎn)4363bp氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。其中9個會導(dǎo)致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3個會導(dǎo)致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24個克隆位點(diǎn)?；蚬こ梯d體構(gòu)建克隆位點(diǎn)基因工程載體構(gòu)建pBR322的優(yōu)點(diǎn)雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記插入失活，分兩次先后選擇：沒有獲得載體的寄主細(xì)胞在Amp或Tet中都死亡。獲得載體的寄主細(xì)胞在Amp或Tet其中之一中死亡。基因工程載體構(gòu)建pBR322的優(yōu)點(diǎn)外源基因BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因PstITet中存活但在Amp中死亡分子小，克隆能力大

載體越小越好。>10kb的DNA在純化過程中容易斷裂?；蚬こ梯d體構(gòu)建自然界的DNA重組

高拷貝數(shù)安全

失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過接合轉(zhuǎn)移?；蚬こ梯d體構(gòu)建（3）pUC系列

UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19基因工程載體構(gòu)建元件來源復(fù)制起點(diǎn)pBR322的ori但其上失去了克隆位點(diǎn)。Ampr基因lacZ的啟動子大腸桿菌lacZ’基因大腸桿菌lacZ的-肽鏈序列，是LacZ的氨基端片斷。pBR322的Ampr基因基因工程載體構(gòu)建②長度約2.7kb③克隆位點(diǎn)10個連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于lacZ’基因的5’端?；蚬こ梯d體構(gòu)建克隆位點(diǎn)基因工程載體構(gòu)建克隆位點(diǎn)pUC18/19多克隆位點(diǎn)方向相反，便于一個DNA片段以正反兩個方向組入載體，保證DNA片段中基因的信息與質(zhì)粒載體信息鏈連接，進(jìn)行有效表達(dá)。基因工程載體構(gòu)建克隆位點(diǎn)基因工程載體構(gòu)建選擇標(biāo)記Ampicillin抗性和lacZ的肽互補(bǔ)（藍(lán)白斑）相結(jié)合。藍(lán)白斑選擇原理：X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）基因工程載體構(gòu)建半乳糖苷酶X-gal顯色反應(yīng)-半乳糖苷酶能把無色的化合物X-gal分解成半乳糖和一個深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-氯靛藍(lán)。X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛藍(lán)-半乳糖苷酶基因工程載體構(gòu)建lacZ的α肽互補(bǔ)-半乳糖苷酶能把無色的化合物X-gal分解成半乳糖和一個深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-氯靛藍(lán)。C端大部分C端大部分C端大部分C端大部分-肽（lacZ’

）：-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片斷（11-41氨基酸）。lacZ只有在4聚體的狀態(tài)下才有功能.N端的11-41aaN端的11-41aaN端的11-41aaN端的11-41aa4聚體基因工程載體構(gòu)建受體菌lacZ突變（lacZ?M15）

受體菌基因組的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚體的活性酶，不能分解X-gal

受體菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a基因工程載體構(gòu)建載體lacZ’與α互補(bǔ)pUC質(zhì)粒載體上的lacZ’

編碼肽與這個缺失突變的-半乳糖苷酶“互補(bǔ)”，使它能形成4聚體。又能分解X-gal。產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。C端大部分N端的11-41aapUClacZ’受體菌lacZ?基因工程載體構(gòu)建α互補(bǔ)的插入失活

pUC載體上LacZ’的5’端有一段多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)，本身雖不干擾LacZ’的合成，但插入外源基因就會阻止LacZ’的合成。不能互補(bǔ)。

lacZ’5’3’肽移碼突變lacZ’5’3’肽不互補(bǔ)互補(bǔ)MCS外源DNA基因工程載體構(gòu)建IPTG的誘導(dǎo)作用IPTG（異丙基--D-硫代半乳糖苷）是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)lac操縱子的啟動轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的lacZ的C端部分和載體的lacZ’肽都表達(dá)。從而互補(bǔ)。但載體MCS上插入外源DNA后，不能產(chǎn)生肽！基因工程載體構(gòu)建IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果MCS無插入時，MCS有插入時，?通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入?；蚬こ梯d體構(gòu)建IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果無質(zhì)粒的受體菌-半乳糖苷酶部分缺失，不能分解Xgal；無抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)無菌斑生長質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌-半乳糖苷酶的缺失被載體產(chǎn)物互補(bǔ)，能分解Xgal。且有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有藍(lán)色菌斑生長帶外源DNA插入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌載體產(chǎn)物失活，不能互補(bǔ)-半乳糖苷酶的缺失。不能分解Xgal，但有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有白色菌斑生長基因工程載體構(gòu)建IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果基因工程載體構(gòu)建pUC系列載體的優(yōu)點(diǎn)更小的分子量：如pUC18為2682bp，pUC8為2750bp。選擇方便X-gal顯色、抗菌素雙重直接選擇?？寺”憷哂卸嗫寺∥稽c(diǎn)（MCS），使有兩個不同粘性末端的外源DNA方便地插入。測序方便基因工程載體構(gòu)建3.穿梭質(zhì)粒載體（1）穿梭質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的宿主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。（shuttleplasmidvectors）基因工程載體構(gòu)建（2）常用的穿梭質(zhì)粒載體大腸桿菌枯草桿菌穿梭載體大腸桿菌釀酒酵母穿梭載體大腸桿菌動物細(xì)胞穿梭載體E.coli選擇標(biāo)記Yeast復(fù)制起點(diǎn)E.coli復(fù)制起點(diǎn)Yeast選擇標(biāo)記MCS基因工程載體構(gòu)建（3）穿梭載體的優(yōu)點(diǎn)②也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿菌、哺乳動物細(xì)胞等）進(jìn)行基因表達(dá)。③可以自如地在兩種不同宿主細(xì)胞之間來回轉(zhuǎn)移基因?？寺?、構(gòu)建表達(dá)E.coliAnimalcell①利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆、表達(dá)基因工程載體構(gòu)建4、農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體——植物的克隆載體致癌農(nóng)桿菌含有的一種內(nèi)源質(zhì)粒，當(dāng)農(nóng)桿菌同植物接觸時，該質(zhì)粒會引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤（冠癭瘤），故稱此質(zhì)粒為Ti質(zhì)粒（tumorinducingplasmid）

Ti質(zhì)粒是一種雙鏈環(huán)狀DNA分子，大小約200kb，但是能進(jìn)入植物細(xì)胞的只有約25kb，稱為T-DNA（transferDNA）。

T-DNA左右兩邊界（LB,RB）各有一個25bp長的正向重復(fù)序列（LTS和RTS），是轉(zhuǎn)移和整合不可缺少的序列，并且已證實(shí)T-DNA只要保留兩端邊界序列，中間的序列不同程度被任何一個外源DNA片段所替換，仍可轉(zhuǎn)移整合到植物基因組中?；蚬こ梯d體構(gòu)建4、農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體——植物的克隆載體完整的Ti質(zhì)粒必須具有五個主要功能區(qū)域：（1）T-DNA：LB與RB間序列，整合到植物基因組（2）質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)(PT)：調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌間轉(zhuǎn)移（3）冠癭堿代謝區(qū)(opine)（4）復(fù)制原點(diǎn)（ori）（5）毒性區(qū)（Vir）：激活T-DNA轉(zhuǎn)移基因工程載體構(gòu)建5、酵母2μm質(zhì)粒載體酵母的特點(diǎn)：（1）最簡單的單細(xì)胞異養(yǎng)真核生物，可像細(xì)菌一樣進(jìn)行基因操作（2）能夠在廉價(jià)的培養(yǎng)基上生長（3）可進(jìn)行高密度發(fā)酵（4）具有對外源基因翻譯后進(jìn)行蛋白質(zhì)加工和修飾的功能（5）都存在一種質(zhì)粒，即2μm質(zhì)粒

一般也構(gòu)建成穿梭質(zhì)粒載體，即含有2μm質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)和大腸桿菌源質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)。動物生物技術(shù)基因工程載體（二）基因工程載體構(gòu)建基因工程載體構(gòu)建

2.3基因克隆載體（二）基因克隆載體（二）基因工程載體構(gòu)建（二）病毒（噬菌體）克隆載體病毒：主要由DNA（或RNA）和外殼蛋白組成，經(jīng)包裝后成為病毒顆粒。通過感染，病毒顆粒進(jìn)入宿主細(xì)胞，利用宿主細(xì)胞的合成系統(tǒng)進(jìn)行DNA（或RNA）復(fù)制和殼蛋白的合成，實(shí)現(xiàn)病毒顆粒的增殖。

根據(jù)這些性質(zhì)構(gòu)建了一系列分別適用于不同生物的病毒克隆載體，把感染細(xì)菌的病毒專門稱為噬菌體，由此構(gòu)建的載體則稱為噬菌體載體?；蚬こ梯d體構(gòu)建基因工程載體構(gòu)建（1）λ噬菌體克隆載體基因工程載體構(gòu)建

①λDNA構(gòu)建克隆載體的依據(jù)：A、λ噬菌體由DNA（λDNA）和外殼蛋白組成，對大腸桿菌具有很高的感染能力。B、λDNA在噬菌體中以線狀雙鏈DNA分子存在，全長48502bp。其左右兩端各有12個核苷酸組成的5’凸出粘性末端，而且兩者的核苷酸序列互補(bǔ)，進(jìn)入宿主細(xì)胞后，粘性末端連接成為環(huán)狀DNA分子，此末端稱為cos位點(diǎn)。基因工程載體構(gòu)建基因工程載體構(gòu)建基因工程載體構(gòu)建

C、λ噬菌體能包裝原λDNA長度的75%－105%，約36.4－51.5kb。并且λDNA上約有20kb的區(qū)域?qū)Ζ耸删w的生長不是絕對需要的，可以缺失或者被外源DNA片段取代。基因工程載體構(gòu)建

②構(gòu)建λ噬菌體克隆載體的策略是：A、用合適的限制性內(nèi)切核酸酶切去λDNA上的部分或全部非必需區(qū)，相應(yīng)保留這種酶的1個或2個識別位點(diǎn)作為克隆位點(diǎn)，并用點(diǎn)突變或甲基化酶處理等方法使必需區(qū)內(nèi)的這種酶的識別序列失效，避免外源DNA片段插人必需區(qū)B、在非必需區(qū)組入選擇標(biāo)記基因C、構(gòu)建的λDNA載體不應(yīng)小于36.4kb基因工程載體構(gòu)建

③用λDNA作載體比用質(zhì)粒作載體的優(yōu)點(diǎn)：A、可容納較大的外源DNA片段（15－23kb，質(zhì)粒一般<10kb）B、λDNA進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞容易，不象質(zhì)粒載體那樣需要采用化學(xué)介導(dǎo)法才能進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞C、由于λ噬菌體能裂解宿主細(xì)胞，因而不管是提取λ載體DNA或重組λDNA，或是提取重組λDNA中外源基因產(chǎn)物都比較容易D、用λ載體組建的DNA或cDNA文庫易于長期保存基因工程載體構(gòu)建

（2）柯斯質(zhì)粒cosmid（粘性質(zhì)粒）λ噬菌體載體的局限：A、本身必須大于36.4kb，限制了允許克隆的外源DNA片段B、構(gòu)建的λ噬菌體載體，只要保留λDNA兩端不少于280bp，并含有cos位點(diǎn)以及與包裝相關(guān)的核苷酸序列，當(dāng)插入外源DNA片段后總長大于36.4kb，小于51kb，這樣的重組λDNA分子就能進(jìn)行有效包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞?；蚬こ梯d體構(gòu)建

能否將λ噬菌體載體的上述部分同質(zhì)粒載體的復(fù)制起始位點(diǎn)、克隆位點(diǎn)和選擇標(biāo)記基因等一起構(gòu)建形成載體？Cosmid載體

由帶cos位點(diǎn)的λDNA片段與質(zhì)粒的復(fù)制序列、標(biāo)志基因、多克隆位點(diǎn)等構(gòu)建而成載體。Cosmid質(zhì)粒載體可插入45kb長的外源DNA，主要用于DNA文庫的構(gòu)建基因工程載體構(gòu)建

Cosmid載體示意圖已用于構(gòu)建植物載體的病毒有：雙鏈DNA病毒：花椰菜花葉病毒(CaMV)，單鏈DNA病毒蕃茄金黃花葉病毒（TGMV）、非洲木薯花葉病毒（ACMV）、玉米線條病毒（MSV）、小麥矮縮病毒（WDV）RNA病毒：雀麥草花葉病毒（BMV）、大麥條紋花葉病毒（BSMV）、蕃茄叢矮病毒（TBSV）、馬鈴薯X病毒（PVX）、煙草花葉病毒（TMV）、煙草蝕刻病毒（TEV）、李痘病毒（PPV）等基因工程載體構(gòu)建2、植物病毒克隆載體基因工程載體構(gòu)建2、植物病毒克隆載體構(gòu)建植物病毒克隆載體的基本策略是：對病毒DNA（包括RNA反轉(zhuǎn)錄的DNA）進(jìn)行加工，消除其對植物的致病性，保留其通過轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染能進(jìn)入植物細(xì)胞的特性，使攜帶的目的基因?qū)胫参锛?xì)胞。目前應(yīng)用最多的植物病毒克隆載體是：利用CaMV（花椰菜花葉病毒）構(gòu)建的含35S啟動子的一系列高效表達(dá)載體，這些載體能啟動目的基因在植物細(xì)胞（或藍(lán)藻細(xì)胞）中進(jìn)行高效表達(dá)?；蚬こ梯d體構(gòu)建2、植物病毒克隆載體

構(gòu)建植物病毒克隆載體的基本策略是：對病毒DNA（包括RNA反轉(zhuǎn)錄的DNA）進(jìn)行加工，消除其對植物的致病性，保留其通過轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染能進(jìn)入植物細(xì)胞的特性，使攜帶的目的基因?qū)胫参锛?xì)胞。

目前應(yīng)用最多的植物病毒克隆載體是：利用CaMV（花椰菜花葉病毒）構(gòu)建的含35S啟動子的一系列高效表達(dá)載體，這些載體能啟動目的基因在植物細(xì)胞（或藍(lán)藻細(xì)胞）中進(jìn)行高效表達(dá)?；蚬こ梯d體構(gòu)建基因工程載體構(gòu)建3、動物病毒克隆載體

目前用于構(gòu)建克隆載體的動物病毒主要有：痘苗病毒、腺病毒、桿狀病毒、猿猴空泡病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒等由痘苗病毒構(gòu)建的克隆載體：痘苗病毒基因組：線形雙鏈DNA分子，長度因毒株不同而異，在180－200kb之間,兩端為10kb左右的倒置重復(fù)序列，與病毒毒力和宿主范圍有關(guān)，其中70bp是痘苗病毒復(fù)制所必需的，尤其是20bp（ATTTAGTGTCTAGAAAAAAT）特別重要。痘苗病毒能感染人、豬、牛、鼠、兔、猴、羊等脊椎動物基因工程載體構(gòu)建3、動物病毒克隆載體

在外源目的基因和報(bào)告基因兩端組裝痘苗病毒的TK或HA基因，作為同源重組的DNA片段。特點(diǎn)：表達(dá)產(chǎn)物的天然性較好的免疫原性插入量大宿主細(xì)胞廣泛可進(jìn)行翻譯后修飾利用痘苗病毒載體系統(tǒng)表達(dá)的外源基因在動物中可提供保護(hù)性免疫反應(yīng)基因工程載體構(gòu)建（四）人工染色體克隆載體背景：其他載體承載片段小，限制了對具有龐大和復(fù)雜的人和高等動植物基因組研究，適應(yīng)結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)、基因組計(jì)劃研究需要。概念：人工染色體指能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制，并準(zhǔn)確傳遞給子細(xì)胞的人工構(gòu)建的染色體，能承載100kb以上的DNA大片段，因此又稱為大DNA片段克隆載體。類型：線性和環(huán)形人工染色體載體特點(diǎn)：能容納長達(dá)1000kb，甚至3000kb的外源DNA片段，主要用于構(gòu)建基因組文庫，也可用于基因治療和基因功能鑒定。人工染色體載體的用途：構(gòu)建高等生物基因組文庫的有效載體系統(tǒng)；克隆和轉(zhuǎn)移包括多種元件在內(nèi)的完整基因或基因簇；作為研究基因表達(dá)調(diào)控和染色體功能的重要工具；是建立HAC動物模型的重要手段；人類基因治療方面發(fā)揮重要作用。

基因工程載體構(gòu)建載體名稱受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷TAC（TrasformatincompetentArtificialChromosome）E.coli環(huán)狀100-2000kbBIBAC（binbaryBacterialArtificialChromosome）E.coli環(huán)狀100-2000kbBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli環(huán)狀100-2000kbYAC(YeastArtificialchromosome)酵母細(xì)胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細(xì)胞線性染色體〉1000kbHAC(HumanArtificialChromosome)動物細(xì)胞線性染色體〉1000kb目前常用的人工染色體載體包括：1、酵母人工染色體（YAC）2、細(xì)菌人工染色體