基因工程-目的基因的獲?。▌游锷锛夹g(shù)）

動物生物技術(shù)目的基因的獲取目的基因的獲取

在基因工程設計和操作中，被用于基因重組、改變受體細胞性狀和獲得預期表達產(chǎn)物的基因，稱為目的基因。目的基因一般是結(jié)構(gòu)基因，也就是能夠轉(zhuǎn)錄和翻譯出蛋白質(zhì)的基因。選用怎樣的目的基因是基因工程設計必須優(yōu)先考慮的問題，如何分離獲得目的基因是基因工程操作的重要技術(shù)之一。1、目的已基因的來源目的基因的獲取

目的基因來源非常廣泛，主要來源于各種生物。它們?nèi)旧w基因組中蘊藏著大量的基因。生物種類基因數(shù)目（萬個）人3~4

擬南芥2.55

果蠅1.36

水稻5

蠕蟲1.78

流感病毒0.178

單個基因在基因組中所占比例極其微小，加上復雜的基因間序列，所以，對單個目的基因分離如同大海撈針。2、分離目的基因的途徑目的基因的獲取獲取目的基因的途徑有四種主要方法酶切直接分離法化學合成法基因組文庫或cDNA文庫法PCR擴增法2、分離目的基因的途徑目的基因的獲取（1）限制性內(nèi)切核酸酶的定義、分類①定義：

是一類以環(huán)形或線形雙鏈DNA為底物，能識別DNA中特定核苷酸序列，并在合適反應條件下使每條鏈的一個磷酸二酯鍵斷開，產(chǎn)生具有3’－OH和5’－P基團DNA片段的內(nèi)脫氧核苷酸酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+2、分離目的基因的途徑目的基因的獲取提到的限制性內(nèi)切酶都是指II型酶目前發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切核酸酶有3000多種，可分為：I型限制性內(nèi)切酶：兼有限制性內(nèi)切酶和修飾酶活性的多個亞基的蛋白復合體，它可以在識別位點很遠的地方任意切割DNA鏈。II型限制性內(nèi)切酶：在其識別位點之中或臨近的確定位點特異地切開DNA鏈，產(chǎn)生確定的限制片段，是三類限制性內(nèi)切酶中唯一用于基因工程操作的酶。III型限制性內(nèi)切酶：在識別位點之外切開DNA鏈，并且要求識別位點是反向重復序列，它們很少能產(chǎn)生完全切割的片段。②分類2、分離目的基因的途徑目的基因的獲取（2）限制性內(nèi)切核酸酶的作用機制識別序列

左右互補對稱，稱為回文序列

每種限制性內(nèi)切核酸酶都有相應的識別序列（4-8bp）

EcoRⅠ的識別序列為：GAATTCHindIII的識別序列為：AAGCTT CTTAAGTTCGAABamHI的識別序列為：GGATCCSau3A的識別序列為：GATCCCTAGGCTAG

MaeIII的識別序列為：GTNACDraⅡ的識別序列為：PuGGNCCPyCANTGPyCCNGGPu

識別序列可以以5’-3’走向的單鏈DNA表示。如HindIII的識別序列可以寫為：AAGCTT2、分離目的基因的途徑目的基因的獲取（2）限制性內(nèi)切核酸酶的作用機制識別序列

左右互補對稱，稱為回文序列

有的限制性內(nèi)切核酸酶可識別兩種以上的核苷酸序列AccⅠ即可識別GTATAC，又可識別GTCGAC；DdecⅠ識別的序列：CTAAG，CTTAG，CTGAG，CTCAG

2、分離目的基因的途徑目的基因的獲取（2）限制性內(nèi)切核酸酶的作用機制（b）酶切位點DNA在限制性內(nèi)切核酸酶的作用下，多聚核甘酸鏈上磷酸二酯鍵斷開的位置被稱為酶切位點，可用↓表示，有平端切口和粘斷切口之分。GTCCAGGCCTAGGATCCG+GACCTG+平端切口粘端切口BamHⅠGGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTG2、分離目的基因的途徑目的基因的獲?。?）同功異源酶（同裂酶）來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶，也稱同裂酶。BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ2、分離目的基因的途徑目的基因的獲?。?）同尾酶：

有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)BamHⅠBgIⅡ

GGATCCCCTAGG

AGATCTTCTAGAGCCTAG

GATCCG++ATCTAG

GATCTA2、分離目的基因的途徑目的基因的獲取（4）同尾酶：

有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)BamHⅠBgIⅡ

GGATCCCCTAGG

AGATCTTCTAGAGCCTAG

GATCCG++ATCTAG

GATCTA目的基因的獲取2、分離目的基因的途徑反應底物：環(huán)狀或線狀的雙鏈DNA分子或片段內(nèi)切酶：根據(jù)分離目的基因序列選擇合適內(nèi)切酶反應緩沖液：通常含MgCl2、NaCl、Tris.Cl、巰基乙醇，由廠家提供最適反應溫度：大多為37℃。反應時間：因酶切目的而定。（5）限制性內(nèi)切核酸酶的反應體系：

目的基因的獲取2、分離目的基因的途徑用MspI限制性內(nèi)切酶進行單酶切，10μL酶切反應體系如下：PCR產(chǎn)物4μL10×Buffer1μL0.1％BSA1μLMspI0.5μL(5.0U)ddH2O3.5μL

Totalvolume10μL將樣品混勻后離心，在56℃恒溫箱溫育酶切4~6h，2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照，以便分析統(tǒng)計基因型和片段大小。AGAAAGAAAAGGAAAAGGMaker

251bp154bp97bp250bp100bp①單酶切：是用一種限制性內(nèi)切核酸酶酶切DNA樣品②雙酶切：用兩種不同的限制性內(nèi)切核酸酶酶切同一種DNA分子。③部分酶切指選用的限制性內(nèi)切核酸酶對其在DNA分子上的全部識別序列進行不完全的酶切。目的基因的獲取2、分離目的基因的途徑（6）限制性內(nèi)切核酸酶酶切DNA的方法

導致部分酶切的原因有：底物DNA純度低，識別序列甲基化，酶用量不足，反應時間不夠以及反應緩沖液和溫度不適宜等。

根據(jù)需要創(chuàng)造部分酶切條件，以獲得需要的DNA片段。目的基因的獲取2、分離目的基因的途徑目的基因的獲取2、利用PCR直接擴增目的基因（1）PCR法定向擴增目的基因的基本原理由穆里斯等人于1988年發(fā)明，并于1993年獲得若貝爾化學獎。目的基因的獲取2、利用PCR直接擴增目的基因①以DNA片段作模板，在90℃高溫下，分開成為單鏈DNA。

②以DNA

小段寡聚核苷酸做引物，在50℃的溫度下，找到可以配對的正鏈和負鏈，形成互補結(jié)合③在70℃高溫下，合成一條與模板

DNA單鏈（正鏈或負鏈）互補結(jié)合的DNA新鏈。

④以上三個步驟周而復始，即反應體系的溫度從90oC-50oC-75oC，目的基因的量不斷增加反應體系中經(jīng)歷：變性——復性——延伸——循環(huán)。結(jié)果：目的基因的量成指數(shù)形式擴增（2n)高溫的作用是？引物是怎樣獲得的？四種脫氧核苷三磷酸（4XdNTP)酶

高溫DNA聚合酶（Taq酶、原料（2）PCR的過程目的基因的獲取2、利用PCR直接擴增目的基因目的基因的獲取2、利用PCR直接擴增目的基因（3）耐高溫的DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶(TaqDNApolyase)

是一種耐高熱聚合酶，可耐95℃高溫，作用溫度72℃。從極度嗜熱棲熱水生菌（Thermusaquaticus）中提取。主要用于PCR擴增。此外，還有Pwo、TthDNA聚合酶利用PCR直接擴增目的基因(4)PCR引物目的基因的獲取

引物是PCR過程中與模板DNA部分序列互補，并能引導與模板DNA互補DNA鏈的合成的一種脫氧核苷酸寡聚體。其3’末端具有游離的—OH。(5)PCR擴增反應體系（見下表）目的基因的獲取2、利用PCR直接擴增目的基因PCR反應混合液成分加入體積（μl）最終濃度雙蒸餾水53.510×反應緩沖液10.0[1×]Mg2+1.5mmol/LK+50mmol/L4×dNTPs(各1.25mmol/L)16.0各200μmol/Lλ-DNA模板（全長48.5kD）10.01ng/次引物1,2（各25bp,20μmol/L）5.01.0μmol/L（100pmol）Taq聚合酶儲存液0.52U/100μl總體積（pH8.3）100.0

石蠟油50～100.0

擴增條件：94℃60s，37～60℃60s，72℃120s，共25～30個循環(huán)。引物1序列：7131～7155（5’）-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-(3’)引物2序列：7606～7630（5’）-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-(3’)目的基因的獲取PCR擴增反應體系總體積為15μL，各成分需要量見表3-3。表3-3PCR反應體系優(yōu)化結(jié)果Table3-3TheReactionMixofPCRReaction

ComponentsVolume(μL)DNA50ng/μL1theupstreamprimer（10μM）0.3thedownstreamprimer（10μM）0.3GoldenDNAPolymerase（2.5U/μL）0.152×ReactionMix7.35ddH2O5.9Total153.PCR反應條件95℃預變性5min94℃變性30sX℃退火30s×30-35C72℃延伸30s~50s72℃延伸10min4℃保存注：X℃-退火溫度因引物不同而不同，延伸時間按擴增片斷的大小和酶的活性而定，一般以1000Kb/min為標準。4.擴增結(jié)果檢測取2μLPCR產(chǎn)物加0.5μL6′溴酚藍上樣緩沖液，上樣于1.5%瓊脂糖凝膠（含0.05%EB），5V/cm電壓電泳1h，在凝膠成像儀上觀察擴增結(jié)果，并拍照。2、利用PCR直接擴增目的基因目的基因的獲取2、利用PCR直接擴增目的基因（5）PCR擴增結(jié)果檢測PCR擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物片段大小為438bp，與預期大小一致。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測針對PRKAA1基因exon7序列設計A12引物，用該引物進行DNA擴增，凝膠電泳檢測，產(chǎn)物片段大小為342bp，長度符合預期大小，條帶質(zhì)量完好

PRKAA1基因exon7PCR擴增檢測結(jié)果

牛PRKAA2exon9PCR擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果目的基因的獲取3、通過建基因組文庫或cDNA文庫分離目的基因（1）基因文庫某一生物部分基因的集合叫該生物的亞基因組文庫。某一生物全部基因的集合叫該生物的基因文庫。目的基因的獲取3、通過建基因組文庫或cDNA文庫分離目的基因基因文庫（genelibrary)：某個生物的基因組DNA或cDNA片段與適當?shù)妮d體在體外重組后，轉(zhuǎn)化宿主細胞，并通過一定的選擇機制篩選后得到大量的陽性菌落（或噬菌體），所有菌落或噬菌體的集合即為該生物的基因文庫。外源DNA片斷、載體、宿主目的基因的獲取3、通過建基因組文庫或cDNA文庫分離目的基因限制酶切位點限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫目的基因的獲取3、通過建基因組文庫或cDNA文庫分離目的基因基因組DNA文庫的類型：質(zhì)粒文庫，（﹤10kb）噬菌體文庫，（0-23kb）粘粒文庫，（~45kb）人工染色體文庫，（又稱大片段基因組DNA文庫，100kb—1Mb）目的基因的獲取3、通過建基因組文庫或cDNA文庫分離目的基因（2）cDNA文庫的構(gòu)建

某種生物的基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段分別與克隆載體重組，貯存在受體菌克隆子群體中，這樣的群體稱為cDNA文庫。如果此群體中只貯存該基因組部分cDNA，則稱為部分cDNA文庫。①由于較高等生物在特定發(fā)育階段或特定器官得以表達的基因有所不同，所以用特定發(fā)育階段或特定器官的材料構(gòu)建的cDNA文庫通常是部分cDNA文庫。②cDNA文庫的一個克隆子包含一個基因的全部編碼序列，不含內(nèi)含子、轉(zhuǎn)錄啟動子、終止子等元件。③cDNA文庫中貯存某種基因概率的大小，同總mRNA中這種基因的mRNA的拷貝數(shù)（豐度）相關(guān)。高豐度mRNA：5000多個拷貝，占總mRNA的22%中等豐度mRNA：200-300個拷貝，占總mRNA的49%低豐度mRNA：1-15個拷貝，占總mRNA的29%目的基因的獲取3、通過建基因組文庫或cDNA文庫分離目的基因目的基因的獲取3、通過建基因組文庫或cDNA文庫分離目的基因cDNA文庫的構(gòu)建：第一，細胞總RNA的提取和mRNA分離；

第二，第一鏈cD