差別顯示技術詳解

差別顯示技術詳解演示文稿當前第1頁\共有20頁\編于星期三\3點優(yōu)選差別顯示技術當前第2頁\共有20頁\編于星期三\3點

高等生物大約有3~5萬個不同的基因，在每一個正常的體細胞中都含有相同的基因組拷貝，但在不同的組織細胞中僅有10%~20%的少部分基因被選擇性表達，這種選擇性表達是在發(fā)育過程中細胞分化的根本原因，是調(diào)控細胞生命活動過程的核心機制。因此，比較不同組織之間，或相同組織在不同生理條件下，或胚胎在不同的發(fā)育階段的基因表達差異，可分離并克隆出這些特異性表達的基因。近年來，該領域的研究取得了很大進展，扣除雜交（subtractivehybridization,SH）、基因芯片技術（DNAchiptechnique）、基因表達的系統(tǒng)分析(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)、噬菌體全套抗體庫技術(phagedisplayantibodyrepertoirelibrarytechnique)和雙向電泳技術(two-dimensionalgelelectrophoresis)先后成功地建立。一.概述當前第3頁\共有20頁\編于星期三\3點基因表達調(diào)控的一種方式。指在對信號或誘導物做出應答時，選擇表達不同的基因，或使基因的表達水平有所不同?；虿町惐磉_當前第4頁\共有20頁\編于星期三\3點DD的發(fā)明及其基礎由Liang于1992年創(chuàng)立是分離差異表達基因強有力的工具在隨后幾年里，Liang等在技術方面做了大量改進，使技術更適用、更簡便基于RT-PCR理論，依賴于3種技術1）RT-PCR技術2）以特定引物進行的PCR技術3）DNA電泳技術

當前第5頁\共有20頁\編于星期三\3點二.基本概念

mRNA差別顯示技術也稱為差示反轉錄PCR（DifferentialDisplayofreverseTranscriptionalPCR）簡稱為ddRT-PCR。它是將mRNA反轉錄技術與PCR技術二者相互結合發(fā)展起來的一種RNA指紋圖譜技術。目前已廣泛應用于分離鑒定組織特異性表達的基因。當前第6頁\共有20頁\編于星期三\3點

反轉錄PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR）又稱為逆轉錄PCR。其原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術主要用于：分析基因的轉錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統(tǒng)。RT-PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）即逆轉錄PCR，是將RNA的逆轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增反應（PCR）相結合的技術。RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞/組織中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。反轉錄PCR當前第7頁\共有20頁\編于星期三\3點RNA指紋

RNA首先在逆轉錄酶的作用下使RNA逆轉錄為DNA，之后以其DNA為模板，通過以DNA指紋技術建立指紋圖譜進行分析。DNA指紋

某些DNA序列的差異可通過限制性酶切片段長度的改變反映出來，此即限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)。其主要原因是由于DNA序列個別堿基的突變而引起某個限制性內(nèi)切酶識別位點的獲得或丟失，表現(xiàn)為不同長度的酶切片段．當前第8頁\共有20頁\編于星期三\3點水稻品種DNA指紋當前第9頁\共有20頁\編于星期三\3點基本原理

利用所有真核基因的mRNA的3’端都有一段多聚腺苷酸poly(A)尾結構的特點，將不同來源的總mRNA反轉錄合成cDNA,此cDNA合成是采用oligo(dT)12MN為引物，其中M為A,C,G中的任意一種，N為A,C,G或T中的任意一種，共有12種oligo(dT)12MN引物，其中M為錨定堿基可增大引物的Tm值，N稱為分類堿基，對反轉錄進行分類。用這12種引物分別對同一總mRNA樣品進行cDNA合成，即進行12次不同的反轉錄反應，得到12種類型的cDNA，從而也將總mRNA分為12個亞群。在此基礎上對每一類cDNA進行隨機引物和相應的反轉錄引物PCR擴增，由于擴增的cDNA片段被放射性同位素標記，因而利用放射自顯影技術通過對不同組織樣品的同一類cDNA的PCR選擇性擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，從而反映出不同樣品間基因的時間和空間上的組織特異性的表達。當前第10頁\共有20頁\編于星期三\3點

基本原理是，幾乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都帶有一個多聚的腺苷酸結構，即通常所說的poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA為模板，以oligo(dT)為引物合成出cDNA拷貝。根據(jù)mRNA分子3’-末端序列末端結構的分析可以看到，在這段poly(A)序列起點堿基之前的一個堿基，除了為A的情況之外，只能有C、G、T三種可能。根據(jù)這種序列結構特征，P.Peng等人設計合成三種不同的下游引物，它由11個或12個連續(xù)的脫氧核苷酸加上一個3’-末端錨定脫氧核苷酸組成，用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示，這樣每一種此類人工合成的寡核苷酸引物都將能夠把總mRNA群體的1/3分子反轉錄成mRNA-cDNA雜交分子。于是，采用這三種引物，可以將整個mRNA群體在cDNA水平上分成三個亞群體。然后用一個上游的隨機引物和與反轉錄時相同的oligo(dT)引物對這個ｃＤＮＡ亞群體進行ＰＣＲ擴增，因為這個上游的引物將隨機結合在cDNA上,因此來自不同ｍＲＮＡ的擴增產(chǎn)物的大小是不同的，可以在測序膠上明顯分辨開來，從而篩選出不同樣品間基因差異表達的DNA片段。當前第11頁\共有20頁\編于星期三\3點當前第12頁\共有20頁\編于星期三\3點5’

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly(A)RNA5’T12MN3’錨定引物逆轉錄5’

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’變性5’

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’退火5‘T12MN3’錨定引物寡核苷酸隨機引物3‘MNTTTTTTTTTTTT5’延長dNTP、Taq聚合酶3‘MNTTTTTTTTTTTT5’5’M’N’AAAAAAAAAAA3’變性、退火、延伸電泳顯示T12MN(M為A、G、C，N為A、T、G、C)

啟動cDNA第一鏈合成不同長度的PCR產(chǎn)物回收差異條帶，再擴增，克隆測序，同源比對隨機結合到cDNA鏈上當前第13頁\共有20頁\編于星期三\3點(1)提取總RNA，在這個步驟中注意不能有DNA污染，一般用無RNA酶的DNA酶在37℃下處理30min；(2)在逆轉錄酶作用下，以OligoT11MN為引物(M為G、A、C中的任一種，N為A、C、G、T任一種)，進行逆轉錄；(3)PCR反應，擴增cDNA的第一條鏈；(4)擴增后的cDNA進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，使差異表達的cDNA片段在6%測序膠上分開；(5)找出不同處理間差異顯示的條帶，從膠上切割下來，并回收，再進行第二次擴增；(6)克隆差異片段，差異片段可作為探針；(7)Northern雜交，驗證目的片段，去掉假陽性片段；(8)對目的片段進行測序；(9)以克隆的目的片段為探針，從基因組文庫中篩選出相應的全長基因。技術一般步驟當前第14頁\共有20頁\編于星期三\3點mRNA差異顯示技術簡略流程圖當前第15頁\共有20頁\編于星期三\3點當前第16頁\共有20頁\編于星期三\3點放射性自顯影技術放射性自顯影法與普通照相的曝光、顯影、定影原理相似，此法是利用放射性同位素所放出之射線使照相乳膠“感光”，再經(jīng)顯影和定影處理，將乳膠中因受輻照而致敏的鹵化銀顆粒還原成金屬銀，洗去未“感光”的鹵化銀后則圖像自然顯示出來。圖像中任何區(qū)域的黑度取決于留存的金屬銀的量，它反映了射線在這個區(qū)域所沉積的能量。記錄、檢查和測量整體和組織、細胞和亞細胞水平中放射性示蹤物的分布、進行定性和半定量測定，稱為放射自顯影法。

當前第17頁\共有20頁\編于星期三\3點DD的優(yōu)點以RT-PCR和DNA凝膠電泳為基礎靈敏度高，僅需0.2μg的總RNA因為從兩種或更多的特定組織樣品來源的擴增產(chǎn)物在同一塊膠上鑒定，因此能用于鑒定特定組織或細胞來源樣品之間轉錄水平的mRNA的定性和定量變化可以同時檢測到“上調(diào)”及“下調(diào)”的基因時間短，實驗過程中可步步驗證比較可進行多基因家族的表達分析

當前第18頁\共有20頁\編于星期三\3點DD的缺點

每種技術的誕生都不可能是完美的，mRNA差異顯示技術雖然從創(chuàng)立時起就很受歡迎，但是許多研究者發(fā)現(xiàn)該技術存在一定缺陷，其中三點較為突出：第一，操作步驟多，外源DNA污染嚴重而導致假陽性率高，即差異片斷用Northern雜交時無陽性信號，重復穩(wěn)定性較差。據(jù)研究，這種假陽性率可高達70％第二，獲得的差異條帶短小，多為300bp左右，并且多為3’端非編碼區(qū)序列（UTR），難以直接判斷其功能和意義。第三，必須采用放射性同位素標記反應，使得實驗周期長、成本高、易造成同位素污染，且不好回收差異片斷。當前第19頁\