醫(yī)學專題-單細胞測序技術-

單細胞測序技術(jìshù)小組(xiǎozǔ)成員：

王小江吳貫召陳璇閆立娜第一頁，共十八頁。編輯課件過去二十幾年里，隨著基因測序技術水平的提高以及千人基因組計劃、癌癥基因組計劃等重大國際合作項目的相繼開展，基因組研究日漸被推向高潮。我們能夠得到全基因組序列信息，但是對其進行研究得到的結果只是一群細胞中信號的平均值，或者只代表其中占優(yōu)勢數(shù)量的細胞信息，單個細胞獨有的特性被忽視。另外有些樣品稀少無法在實驗室培養(yǎng)(péiyǎng)，樣品量不足以進行全基因組分析，因此全基因組測序遇到難題。

背景(bèijǐng)第二頁，共十八頁。編輯課件單細胞測序主要涉及單細胞基因組測序和轉錄組測序兩方面，分別(fēnbié)針對單個細胞的DNA和RNA進行序列分析和比較，進而揭示基因組和轉錄組的變化。

單細胞全基因組測序是對選定的目的細胞的全部基因組序列進行非選擇性、均勻擴增，隨后利用外顯子捕獲技術進而高通量測序。

單細胞轉錄組測序是利用高通量測序技術進行cDNA測序，從而獲取特定器官或組織(zǔzhī)在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉錄本單細胞測序技術是指在單個細胞(xìbāo)水平上對基因組進行擴增與測序的一項新技術。第三頁，共十八頁。編輯課件

優(yōu)勢：1.測量基因表達水平更加精確；2.能檢測到微量的基因表達子或罕見非編碼RNA需要克服的難題：

1.如何實現(xiàn)(shíxiàn)均勻擴增；

2.全基因組覆蓋問題；

3.較高的擴增效率。單細胞測序技術(jìshù)的優(yōu)勢與技術(jìshù)難題用傳統(tǒng)的隨機引物PCR的方法來擴增，那么不同的擴增片段的擴增效率多少會有一些差異，這些擴增效率的差異會隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加呈現(xiàn)出指數(shù)放大的效果，其結果就是(jiùshì)會發(fā)生嚴重的覆蓋不均一，極少數(shù)區(qū)段的DNA被大量擴增，測序后它深度非常深，但在大多數(shù)區(qū)段只有很低的覆蓋，甚至沒有覆蓋，那么我們就無法有效地判斷那些低擴增效率區(qū)段的基因序列的情況；

常規(guī)的、用大量的DNA建庫的方法，因為打斷、補平、加A、加接頭等一長串的操作，每一步都會有DNA片段的損失，結果就是初始DNA中很大一部分會被浪費掉，而沒有形成有效的文庫分子，在單細胞測序中，丟失大部分的起始DNA是不可接受的。單細胞測序要求幾乎所有的原始基因組片段都得到擴增，并且在后續(xù)的測序過程中被測序測到。這就要求幾乎所有的片段都會被得到擴增，而不只是少

數(shù)片段得到有效擴增；建好的文庫在測序儀上機的時候，大約每上機2萬個文庫分子，只有1個文庫分子，是能夠在測序的Floecell表面生成簇，并且被測序測到的，剩下的大多數(shù)文庫分子，在上機的時候是被水沖走的，所以單細胞基因組擴增的方法還要有較高的擴增效率，至少要有上萬倍到幾十萬倍的擴增效率，才能保證在全基因組測序的時候，大部分的片段都被測序測到。第四頁，共十八頁。編輯課件MALBAC技術，首先需要進行5輪MDA預擴增，然后就可以(kěyǐ)使新獲得的擴增產(chǎn)物形成閉合的環(huán)狀分子。由于這些環(huán)狀分子不能夠被進一步擴增，所以整個擴增過程就變成了線性擴增。然后再進行常規(guī)的PCR擴增，由于此時采用的模板更加均一，所以在進行PCR擴增時就不易造成較大的差異。兩種擴增技術(jìshù)：MALBAC方法和MDA方法MDA方法是使用隨機引物，讓這些引物與基因組廣泛結合，同時使用一種特定的聚合酶，這種聚合酶能夠置換與它自身附著在同一模板上的DNA鏈片段，形成一種反復分支結構(jiégòu)，擴增出大段的DNA。第五頁，共十八頁。編輯課件基因組模板DNA擴增引物Phi29DNA聚合酶MALBAC法擴增第六頁，共十八頁。編輯課件5’端有通用擴增序列(xùliè)的DNA片段第一個循環(huán)(xúnhuán)下來，得到的是一批5’端有通用擴增序列的DNA片段第七頁，共十八頁。編輯課件5’端有通用序列(xùliè)，3’端有與通用序列互補的序列的DNA片段在第二個循環(huán)(xúnhuán)完成后，所產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物中大部分是5’端有通用序列，而3’端有與通用序列互補的序列的這些片段共循環(huán)(xúnhuán)5次第八頁，共十八頁。編輯課件58℃退火(tuìhuǒ)MALBAC的巧妙之處，就是在每個循環(huán)的最后，加了一步58度退火，這一退火過程，他讓完整擴增的產(chǎn)物的兩端(liǎnɡduān)發(fā)生鏈內(nèi)雜交第九頁，共十八頁。編輯課件58℃退火(tuìhuǒ)鏈內(nèi)雜交完整擴增產(chǎn)物，自我鎖定，無法擴增這樣(zhèyàng)3’端的序列就不能與新的、游離的引物發(fā)生雜交，也就不會引發(fā)新的、發(fā)始于3’端的擴增，這樣就避免了完整擴增產(chǎn)物的指數(shù)擴增第十頁，共十八頁。編輯課件隨機引物隨機擴增現(xiàn)在，還是8個隨機序列(xùliè)的引物在模板上隨機地找結合位置，所有的位點都有一樣的機會被擴增。這樣得到的產(chǎn)物分三種線性擴增第十一頁，共十八頁。編輯課件第二個要解決的難題，這里是利用Phi29聚合酶能一次在模板上聚合出多個新鏈的功能來達到這個目的。在5輪的擴增之后，每個模板都會有5*n2個擴增片段，這樣就可以保證(bǎozhèng)建庫時大多數(shù)的基因組區(qū)域可以被建成文庫，最后可以被測序測到。第三個要解決的問題，高效率擴增，還是(háishi)利用了Phi29聚合酶的一次得到多個擴增片段的效果來達成的。第十二頁，共十八頁。編輯課件MDA方法的技術核心是用Phi29DNA聚合酶來進行直接的擴增，Phi29DNA聚合酶可以把雙鏈DNA進行解鏈，然后(ránhòu)在常溫條件下就把原始模板進行大量擴增MDA擴增圖第十三頁，共十八頁。編輯課件MDA的特點：

擴增效率更高，實驗方法簡單(jiǎndān)MALBAC的特點：

擴增均一性更好；

得到的擴增DNA的量相對較少，或者說他的擴增效率相對較低兩種方法(fāngfǎ)比較第十四頁，共十八頁。編輯課件應用(yìngyòng)（1）在胚胎植入前進行基因拷貝數(shù)變異檢測；（2）進行腫瘤(zhǒngliú)的染色體變異研究目前(mùqián)最主要的2個應用：第十五頁，共十八頁。編輯課件在有習慣性流產(chǎn)的夫婦當中，最常見(chánɡjiàn)的病因就是染色體的平衡易位，所謂染色體平衡易位也就是A染色體的一段移到了B染色體上要把這個正常的受精卵挑出來，目前最有效的解決手段是做受精卵植入前檢測，那么具體的操作方法是先做人工授精，在受精卵發(fā)育到8個細胞的時候，通過顯微操作抓一個細胞出來測序，在這個測序過程當中就要用到MDA方法(fāngfǎ)或MALBAC方法進行擴增、建庫、測序，挑出那個好的受精卵，植回到母親的子宮中去，長成一個正常的新生兒，這個就是受精卵植入前基因檢測，如果夫妻一方有染色體易位，那么這對夫婦的受精卵中，每4個受精卵可能只有一個是正常的胚胎植入前進行基因拷貝數(shù)變異(biànyì)檢測第十六頁，共十八頁。編輯課件請大家(dàjiā)批評指正！謝謝！第十七頁，共十八頁。編輯課件內(nèi)