醫(yī)學(xué)專題-單細(xì)胞測序技術(shù)-

單細(xì)胞測序技術(shù)(jìshù)小組(xiǎozǔ)成員：

王小江吳貫召陳璇閆立娜第一頁，共十八頁。編輯課件過去二十幾年里，隨著基因測序技術(shù)水平的提高以及千人基因組計(jì)劃、癌癥基因組計(jì)劃等重大國際合作項(xiàng)目的相繼開展，基因組研究日漸被推向高潮。我們能夠得到全基因組序列信息，但是對其進(jìn)行研究得到的結(jié)果只是一群細(xì)胞中信號(hào)的平均值，或者只代表其中占優(yōu)勢數(shù)量的細(xì)胞信息，單個(gè)細(xì)胞獨(dú)有的特性被忽視。另外有些樣品稀少無法在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)(péiyǎng)，樣品量不足以進(jìn)行全基因組分析，因此全基因組測序遇到難題。

背景(bèijǐng)第二頁，共十八頁。編輯課件單細(xì)胞測序主要涉及單細(xì)胞基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測序兩方面，分別(fēnbié)針對單個(gè)細(xì)胞的DNA和RNA進(jìn)行序列分析和比較，進(jìn)而揭示基因組和轉(zhuǎn)錄組的變化。

單細(xì)胞全基因組測序是對選定的目的細(xì)胞的全部基因組序列進(jìn)行非選擇性、均勻擴(kuò)增，隨后利用外顯子捕獲技術(shù)進(jìn)而高通量測序。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序是利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行cDNA測序，從而獲取特定器官或組織(zǔzhī)在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本單細(xì)胞測序技術(shù)是指在單個(gè)細(xì)胞(xìbāo)水平上對基因組進(jìn)行擴(kuò)增與測序的一項(xiàng)新技術(shù)。第三頁，共十八頁。編輯課件

優(yōu)勢：1.測量基因表達(dá)水平更加精確；2.能檢測到微量的基因表達(dá)子或罕見非編碼RNA需要克服的難題：

1.如何實(shí)現(xiàn)(shíxiàn)均勻擴(kuò)增；

2.全基因組覆蓋問題；

3.較高的擴(kuò)增效率。單細(xì)胞測序技術(shù)(jìshù)的優(yōu)勢與技術(shù)(jìshù)難題用傳統(tǒng)的隨機(jī)引物PCR的方法來擴(kuò)增，那么不同的擴(kuò)增片段的擴(kuò)增效率多少會(huì)有一些差異，這些擴(kuò)增效率的差異會(huì)隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加呈現(xiàn)出指數(shù)放大的效果，其結(jié)果就是(jiùshì)會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的覆蓋不均一，極少數(shù)區(qū)段的DNA被大量擴(kuò)增，測序后它深度非常深，但在大多數(shù)區(qū)段只有很低的覆蓋，甚至沒有覆蓋，那么我們就無法有效地判斷那些低擴(kuò)增效率區(qū)段的基因序列的情況；

常規(guī)的、用大量的DNA建庫的方法，因?yàn)榇驍唷⒀a(bǔ)平、加A、加接頭等一長串的操作，每一步都會(huì)有DNA片段的損失，結(jié)果就是初始DNA中很大一部分會(huì)被浪費(fèi)掉，而沒有形成有效的文庫分子，在單細(xì)胞測序中，丟失大部分的起始DNA是不可接受的。單細(xì)胞測序要求幾乎所有的原始基因組片段都得到擴(kuò)增，并且在后續(xù)的測序過程中被測序測到。這就要求幾乎所有的片段都會(huì)被得到擴(kuò)增，而不只是少

數(shù)片段得到有效擴(kuò)增；建好的文庫在測序儀上機(jī)的時(shí)候，大約每上機(jī)2萬個(gè)文庫分子，只有1個(gè)文庫分子，是能夠在測序的Floecell表面生成簇，并且被測序測到的，剩下的大多數(shù)文庫分子，在上機(jī)的時(shí)候是被水沖走的，所以單細(xì)胞基因組擴(kuò)增的方法還要有較高的擴(kuò)增效率，至少要有上萬倍到幾十萬倍的擴(kuò)增效率，才能保證在全基因組測序的時(shí)候，大部分的片段都被測序測到。第四頁，共十八頁。編輯課件MALBAC技術(shù)，首先需要進(jìn)行5輪MDA預(yù)擴(kuò)增，然后就可以(kěyǐ)使新獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物形成閉合的環(huán)狀分子。由于這些環(huán)狀分子不能夠被進(jìn)一步擴(kuò)增，所以整個(gè)擴(kuò)增過程就變成了線性擴(kuò)增。然后再進(jìn)行常規(guī)的PCR擴(kuò)增，由于此時(shí)采用的模板更加均一，所以在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)就不易造成較大的差異。兩種擴(kuò)增技術(shù)(jìshù)：MALBAC方法和MDA方法MDA方法是使用隨機(jī)引物，讓這些引物與基因組廣泛結(jié)合，同時(shí)使用一種特定的聚合酶，這種聚合酶能夠置換與它自身附著在同一模板上的DNA鏈片段，形成一種反復(fù)分支結(jié)構(gòu)(jiégòu)，擴(kuò)增出大段的DNA。第五頁，共十八頁。編輯課件基因組模板DNA擴(kuò)增引物Phi29DNA聚合酶MALBAC法擴(kuò)增第六頁，共十八頁。編輯課件5’端有通用擴(kuò)增序列(xùliè)的DNA片段第一個(gè)循環(huán)(xúnhuán)下來，得到的是一批5’端有通用擴(kuò)增序列的DNA片段第七頁，共十八頁。編輯課件5’端有通用序列(xùliè)，3’端有與通用序列互補(bǔ)的序列的DNA片段在第二個(gè)循環(huán)(xúnhuán)完成后，所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物中大部分是5’端有通用序列，而3’端有與通用序列互補(bǔ)的序列的這些片段共循環(huán)(xúnhuán)5次第八頁，共十八頁。編輯課件58℃退火(tuìhuǒ)MALBAC的巧妙之處，就是在每個(gè)循環(huán)的最后，加了一步58度退火，這一退火過程，他讓完整擴(kuò)增的產(chǎn)物的兩端(liǎnɡduān)發(fā)生鏈內(nèi)雜交第九頁，共十八頁。編輯課件58℃退火(tuìhuǒ)鏈內(nèi)雜交完整擴(kuò)增產(chǎn)物，自我鎖定，無法擴(kuò)增這樣(zhèyàng)3’端的序列就不能與新的、游離的引物發(fā)生雜交，也就不會(huì)引發(fā)新的、發(fā)始于3’端的擴(kuò)增，這樣就避免了完整擴(kuò)增產(chǎn)物的指數(shù)擴(kuò)增第十頁，共十八頁。編輯課件隨機(jī)引物隨機(jī)擴(kuò)增現(xiàn)在，還是8個(gè)隨機(jī)序列(xùliè)的引物在模板上隨機(jī)地找結(jié)合位置，所有的位點(diǎn)都有一樣的機(jī)會(huì)被擴(kuò)增。這樣得到的產(chǎn)物分三種線性擴(kuò)增第十一頁，共十八頁。編輯課件第二個(gè)要解決的難題，這里是利用Phi29聚合酶能一次在模板上聚合出多個(gè)新鏈的功能來達(dá)到這個(gè)目的。在5輪的擴(kuò)增之后，每個(gè)模板都會(huì)有5*n2個(gè)擴(kuò)增片段，這樣就可以保證(bǎozhèng)建庫時(shí)大多數(shù)的基因組區(qū)域可以被建成文庫，最后可以被測序測到。第三個(gè)要解決的問題，高效率擴(kuò)增，還是(háishi)利用了Phi29聚合酶的一次得到多個(gè)擴(kuò)增片段的效果來達(dá)成的。第十二頁，共十八頁。編輯課件MDA方法的技術(shù)核心是用Phi29DNA聚合酶來進(jìn)行直接的擴(kuò)增，Phi29DNA聚合酶可以把雙鏈DNA進(jìn)行解鏈，然后(ránhòu)在常溫條件下就把原始模板進(jìn)行大量擴(kuò)增MDA擴(kuò)增圖第十三頁，共十八頁。編輯課件MDA的特點(diǎn)：

擴(kuò)增效率更高，實(shí)驗(yàn)方法簡單(jiǎndān)MALBAC的特點(diǎn)：

擴(kuò)增均一性更好；

得到的擴(kuò)增DNA的量相對較少，或者說他的擴(kuò)增效率相對較低兩種方法(fāngfǎ)比較第十四頁，共十八頁。編輯課件應(yīng)用(yìngyòng)（1）在胚胎植入前進(jìn)行基因拷貝數(shù)變異檢測；（2）進(jìn)行腫瘤(zhǒngliú)的染色體變異研究目前(mùqián)最主要的2個(gè)應(yīng)用：第十五頁，共十八頁。編輯課件在有習(xí)慣性流產(chǎn)的夫婦當(dāng)中，最常見(chánɡjiàn)的病因就是染色體的平衡易位，所謂染色體平衡易位也就是A染色體的一段移到了B染色體上要把這個(gè)正常的受精卵挑出來，目前最有效的解決手段是做受精卵植入前檢測，那么具體的操作方法是先做人工授精，在受精卵發(fā)育到8個(gè)細(xì)胞的時(shí)候，通過顯微操作抓一個(gè)細(xì)胞出來測序，在這個(gè)測序過程當(dāng)中就要用到MDA方法(fāngfǎ)或MALBAC方法進(jìn)行擴(kuò)增、建庫、測序，挑出那個(gè)好的受精卵，植回到母親的子宮中去，長成一個(gè)正常的新生兒，這個(gè)就是受精卵植入前基因檢測，如果夫妻一方有染色體易位，那么這對夫婦的受精卵中，每4個(gè)受精卵可能只有一個(gè)是正常的胚胎植入前進(jìn)行基因拷貝數(shù)變異(biànyì)檢測第十六頁，共十八頁。編輯課件請大家(dàjiā)批評指正！謝謝！第十七頁，共十八頁。編輯課件內(nèi)