急性白血病患者SHP

急性白血病患者SHP【摘要】為了探討造血細胞磷酸酶基因和原癌基因c-kit在急性白血病患者中的表達及其與AL的發(fā)生及預后的關系，應用半定量逆轉錄-聚合酶鏈反應方法檢測60例急性白血病患者及33名正常對照者單個核細胞的SHP-1、c-kitmRNA的表達。結果顯示：SHP-1在AML細胞中表達陽性率由高至低依次為緩解組、初治組、復發(fā)組，c-kit表達陽性率則相反，各組與正常對照組相比有顯著性差異，SHP-1在AML細胞中表達陽性率比ALL細胞高，有顯著性差異，c-kit在AML細胞中表達陽性率比ALL細胞中高，有顯著性差異；SHP-1與c-kit表達成負相關；30例初治AML患者SHP-1＋與SHP-1-的完全緩解率均有顯著性差異，c-kit＋與c-kit-的完全緩解率均有顯著性差異。結論：SHP-1可能是一個潛在的抑癌基因，它負性調節(jié)c-kit基因而抑制腫瘤的發(fā)生，同時監(jiān)測二者的表達可作為判斷AL治療轉歸的預測指標。

【關鍵詞】急性白血病；SHP-1；c-kit；聚合酶鏈反應

ExpressionandClinicalValueofSHP-1andc-kitinAcuteLeukemia

AbstractTheaimofstudyistoinvestigatetheexpressionofhematopoieticcellphosphatase(SHP-1)geneandc-kitpro-oncogeneinacuteleukemia(AL)anditsimpactonprognosisinAL.Semi-quantityreversetranscriptase-polymerasechainreaction(RT-PCR)wasusedtodetecttheexpressionofSHP-1mRNAandc-kitmRNAin60ALpatientsand33normalcontrols(NC).TheresultsshowedthatthepositiveratesofSHP-1expressionfromhightolowlevelwerefoundorderlyincompleteremissiongroup,newlydiagnosedgroupandrelapsedgroup,therewassignificancedifferencebetweeneachgroupandNCgroup.Thepositiveratesofc-kitexpressionwereoppositeorderineachgroupsascomparedwithSHP-1.therewasalsosignificancedifferencebetweeneachgroupandNCgroup.ThepositiverateofSHP-1andc-kitexpressionsinAMLwashigherthanthatinALL,therewasnagativecorrelationbetweenexpressionsofSHP-1andc-kit;ThedifferencebetweenthecompleteremissionrateinSHP-1positiveandinSHP-1negativepatientsfrom30newlydiagnosedAMLpatientswassignificant(P005),thesameresultwasfoundbetweenc-kit+completeremissionandc-kit-completeremission.ItisconcludedthatSHP-1geneisapotentiallyanti-oncogeneandinhibitsthegrowingoftumorbynegativelymodulatingc-kitgene.SimultaneousdetectionofSHP-1andc-kitgenemayactasafactorforpredictingprognosisinAL.

Keywordsacuteleukemia；SHP-1；c-kit；polymerasechainreaction

SHP-1為含SH2域(srchomology-2domain)的酪氨酸磷酸酶-1，主要表達于造血細胞，因此又稱為造血細胞磷酸酶。SHP-1在造血細胞生成中的作用已經由SHP-1突變的motheaten小鼠所證實，在此模型中由于剪切突變從而影響SHP-1基因的SH2或PTP結構域，進而導致SHP-1的磷酸酶活性部分或全部缺失，在motheaten小鼠和viablemotheaten小鼠引起包括骨髓粒-單核細胞的過度增殖與積聚的多種造血功能異常，強烈提示motheaten小鼠是由于喪失了SHP-1功能所致。c-kit原癌基因是酪氨酸激酶受體家族Ⅲ類的一個重要成員［1］。c-kit與其配體干細胞生長因子相結合對造血干細胞及祖細胞起支持作用，隨著細胞的分化成熟，逐漸從細胞表面消失。

c-kit與SCF結合后和SHP-1偶聯發(fā)生去磷酸化的細胞內反應，從而失去SHP-1的負性調控作用。為了評價SHP-1和c-kit基因在急性白血病發(fā)病中的作用，我們采用RT-PCR的方法檢測了60例AL患者和33例健康人骨髓標本中SHP-1和c-kit基因的表達情況。

材料和方法

研究對象

60例AL系我院2004年3月至2005年1月住院治療患者，均經細胞形態(tài)學、組織化學和免疫表型檢測確診。在60例中急性髓細胞白血病52例，急性淋巴細胞白血病8例。60例中男33例，女27例，中位年齡34歲(14-70歲)。33名健康志愿者作為正常對照。初治AML患者采用標準DA方案誘導緩解。復發(fā)AML患者采用IA化療方案。M3患者采用全反式維甲酸或ATRA與三氧化二砷合用或以ATRA為主聯合應用小劑量HA方案治療。對于ALL患者采用VITP方案治療。

細胞分離及總RNA的提取

取骨髓2ml，肝素抗凝，生理鹽水稀釋3-4倍，Ficoll淋巴細胞分離液4ml，2500×g離心16分鐘，分離出單個核細胞，然后用TRI-REAGENT提取細胞總RNA。

逆轉錄酶-聚合酶鏈反應(RT-PCR)

用隨機六聚引物合成cDNA。1μg總RNA，在20μl反應體積中，37℃60分鐘反轉錄，95℃5分鐘終止反應。PCR反應體積25μl，含cDNA1μl，MgCl2mmol/L，200μl的4種dNTP，μmol/L的引物，U的Taq酶。SHP-1寡核苷酸引物由日本基因研究實驗室提供，序列資料獲自GenBank(獲取號M27273)，c-kit引物由美國Cybersyn公司合成。SHP-1正義引物：5′-GGGCAGGCAGAGACGCT-3′；反義引物；5′-CTTCTTGAAATGCTCCACCA-3′。c-kit正義引物：5′-GTGGTTAAAGGAAACGCTCG-3′；反義引物：5′-CATACATTTCAGCAGGTGCG-3′；GADPH正義引物：5′-CGGGAAGCTTGTCATCAATGG-3′；反義引物：5′-GGCAGTGATGGCATGGACTG-3′。SHP-1擴增片段長度為238bp,c-kit擴增片段長度為232bp，GADPH擴增片段長度為358bp。擴增條件為：SHP-1：94℃變性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸60秒，35個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘；c-kit：95℃變性45秒，50℃退火45秒，72℃延伸60秒，35個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘；GADPH：94℃變性60秒，60℃退火55秒，72℃延伸60秒，22個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。產物分析：取10μl擴增產物，1g/100ml瓊脂糖凝膠電泳(90Ｖ，40分鐘),溴化乙錠染色，紫外透射儀上觀察結果并照相。

統(tǒng)計學分析

應用Excel建庫，所有數據均應用SPSS軟件處理，兩樣本均數的比較采用兩個獨立樣本非參數秩和檢驗，組間率比較行四格表卡方檢驗。P≤為有統(tǒng)計學意義。

結果

正常對照、AML患者、ALL患者(其中包括初治組、復發(fā)組)SHP-1、c-kit基因表達水平和陽性率，以相應標本中三磷酸甘油醛脫氫酶作陽性對照，將SHP-1/GADPH≥定為SHP-1基因表達陽性，將c-kit/GADPH≥定為c-kit基因表達陽性。

SHP-1表達

SHP-1在33例健康人標本中全部表達陽性，SHP-1mRNA表達水平為(，)。30例初治AML患者SHP-1的陽性率為%，其表達水平為0(0，)，表達水平與正常對照組比較差別具有顯著性；4例復發(fā)AML患者SHP-1全部表達陰性，與正常對照組比較差別有顯著性，與初治AML組相比表達水平低，有統(tǒng)計學意義；18例緩解AML患者表達陽性率為%，表達水平為，與初治AML組比較無統(tǒng)計學意義。8例ALL患者SHP-1的表達均為陰性，因例數較少缺乏分型比較意義。52例AML患者SHP-1的表達陽性率為%，表達水平為0；8例ALL患者均無SHP-1的陽性表達，兩者的表達水平比較結果有顯著性差異。Table1.ExpressionofSHP-1inALpatientsandnormalcontrols

c-kit表達

c-kitmRNA在33例正常人中表達陽性率為%，表達水平為0。初治AML組c-kitmRNA的陽性率為%，表達水平為，與正常對照組比較有顯著性差異。復發(fā)的4例AML患者中c-kitmRNA表達陽性者為4例，表達水平為，與初治AML組比較無統(tǒng)計學意義。18例緩解患者c-kitmRNA的陽性表達率為%和表達水平為0，與初治AML組比較有統(tǒng)計學意義。ALL患者因例數較少缺乏分型比較意義。在AML中，c-kitmRNA的陽性率為%，其表達水平為，ALL中的表達陽性率為%和表達水平為0，有統(tǒng)計學差異。Table2.Expressionofc-kitmRNAinALpatientsandnormalcontrolsTable3.ExpressionofSHP-1、c-kitmRNAinAMLandALLpatients

SHP-1、c-kitmRNA表達與AL相關性分析

AL患者SHP-1、c-kitmRNA表達水平的相關分析發(fā)現兩者的mRNA水平成負相關。

初治AL患者SHP-1、c-kit表達與療效的關系

根據電泳的結果，將30例初治的AML患者分為SHP-1＋/SHP-1-、c-kit＋/c-kit-組。SHP-1＋組緩解率高于SHP-1-組緩解率，χ2檢驗差別有顯著性。c-kit＋組的緩解率低于c-kit-的緩解率，χ2檢驗差別有顯著性。在5例SHP-1＋c-kit＋雙陽性組的緩解率為40%，SHP-1-c-kit＋組的緩解率為%,兩組之間的緩解率無統(tǒng)計學差異。Table4.CRrateofSHP-1、c-kitinpositiveandnegativepatientsofAML

討論

SHP-1是一個68kD的胞漿蛋白，在造血細胞發(fā)育［2］、增殖和受體介導的促有絲分裂信號轉導過程中表達［3］，在一系列促生長受體介導的信號轉導中起重要的負調節(jié)作用，這些受體包括酪氨酸激酶受體如c-kit、CSF-1、TrkA和EGF受體，細胞因子受體如IL-3、IFN-α/β和EPO受體以及免疫細胞受體如CD22和FcγRⅡB［4］。SHP-1對受體酪氨酸激酶的抑制作用是通過直接作用于受體而使其脫磷酸化完成的，而對細胞因子受體的抑制作用則是通過與受體的非催化亞單位結合使相關的Janus家族酪氨酸激酶脫磷酸化實現的。人類SHP-1基因定位于12p13，白血病細胞蛋白酪氨酸磷酸酶能特異地對細胞內磷酸化的酪氨酸殘基去磷酸化，與細胞的增殖分化密切相關，而增殖分化障礙正是腫瘤細胞的特征之一［5］。SHP-1與造血細胞的發(fā)生發(fā)展、增殖以及受體介導的有絲分裂信號轉導通路密切相關，在信號轉導中主要起負調控作用，抑制細胞增殖，與腫瘤的形成及生長呈負相關［6，7］。本研究結果顯示，正常對照組和緩解組SHP-1表達陽性率和表達水平顯著高于初治組和復發(fā)組，后兩者與正常對照組比較有統(tǒng)計學差異，表明SHP-1的低表達或不表達與AL的發(fā)病密切相關，說明SHP-1作為一個抑癌基因在AL中發(fā)揮著重要作用。Oka等［6］應用RT-PCR方法檢測NK/T細胞淋巴瘤時發(fā)現SHP-1基因的表達顯著減少，這一結果強烈提示SHP-1作為一個抑癌基因在白血病、NK/T細胞淋巴瘤及其他惡性淋巴瘤中發(fā)揮著重要作用。此外，AML患者SHP-1的表達陽性率和表達水平高于ALL患者，推測SHP-1在髓細胞白血病較易于表達，SHP-1的不表達與臨床上成人ALL完全緩解率低且復發(fā)率高有關，但本實驗ALL例數較少，需要進一步增加例數證實。對30例初治AML患者SHP-1mRNA的表達情況研究發(fā)現，SHP-1表達陽性者經治療后完全緩解率高，與SHP-1陰性表達者的完全緩解率有統(tǒng)計學差異。由此初步得出結論：SHP-1在初治AML中的表達可能是其預后良好的指標，從而證實SHP-1作為一個抑癌基因在AML中發(fā)揮著重要作用。c-kit原癌基因是酪氨酸激酶受體家族Ⅲ類的一個重要成員。SHP-1與c-kit間有一定關系。SHP-1通過它的SH2功能集團與c-kit受體結合，通過直接脫磷酸化而起到對c-kit的負性調節(jié)作用［8］，c-kit基因是促使細胞增殖的重要調節(jié)因子，大量研究表明c-kit是一腫瘤基因。不論是SHP-1基因SH2功能集團的突變還是c-kit基因上與SHP-1基因的結合位點發(fā)生突變，都可導致SHP-1基因對c-kit基因的負性調節(jié)作用喪失，而表現出c-kit基因促使細胞有絲分裂增加等腫瘤基因特性。同時，丟失了SHP-1的作用還可增加c-kit的信號而導致細胞生存期的延長。運用非參數相關分析，發(fā)現SHP-1與c-kit的mRNA水平成負相關，且SHP-1+/c-kit+患者緩解率高于SHP-1-/c-kit+患者，這可能與機體內同時存在SHP-1的不表達，丟失了SHP-1的負調控作用，從而增加了c-kit的信號而導致細胞生存期的延長有關。研究證實了SHP-1可負性調節(jié)c-kit基因而抑制腫瘤的發(fā)生，今后將增加試驗例數以進一步檢驗該結論。此外，Bene等［9］檢測1937例AML中的表達率為63%-69%；陳驊等［10］檢測58例AML中的表達率為%，且提示c-kit在粒細胞系白血病更易于表達。本研究結果顯示，AML患者c-kitmRNA表達陽性率和表達水平顯著高于ALL患者，差別有顯著性，與文獻報道相符。此外，對30例初治AML患者c-kit表達水平研究發(fā)現c-kit表達陽性者CR率低于陰性者，說明監(jiān)測AML患者c-kit的表達可作為又一個判斷預后的獨立的因素，支持c-kit和SHP-1一樣可作為AL治療轉歸的預測指標。

【參考文獻】

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