淺論Tim4基因定量檢測方法的建立及在消化道腫瘤中的初步應用

淺論Tim4基因定量檢測方法的建立及在消化道腫瘤中的初步應用【摘要】目的：建立T細胞免疫球蛋白及黏蛋白域分子4(Tcellsimmunoglobulinandmucindomaincontainingmolecule4，Tim4)基因表達的實時熒光定量PCR(實時RTPCR)的檢測方法，探討Tim4基因在消化道腫瘤中的表達差異。方法：構(gòu)建包含Tim4基因片段的標準質(zhì)粒，通過RTPCR，實時RTPCR等檢測并比較Tim4基因在37例胃癌組織、19例結(jié)直腸癌組織與對應癌旁組織中的表達水平。結(jié)果：建立的Tim4基因定量檢測方法準確可靠；在37例胃癌組織中，26例癌旁組織Tim4基因表達量高于對應癌組織(26/37)，且在26例癌旁組織高表達的樣本中，18例胃癌癌旁組織與癌組織表達比率大于2；在19例結(jié)直腸癌中12例癌旁組織表達高于對應的癌組織(12/19)，其中癌旁組織高表達率為%(9/12)。結(jié)論：成功建立了檢測Tim4基因的實時RTPCR方法，Tim4基因在結(jié)直腸癌和胃癌的癌組織中表達呈低趨勢，這為深入探討Tim4基因與腫瘤的關(guān)系提供了實驗基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】T細胞免疫球蛋白及黏蛋白域分子4；實時熒光定量RTPCR；胃癌；結(jié)直腸癌

［Abstract］Objective:ToestablishamethodofrealtimeRTPCRforTcellsimmunoglobulinandmucindomaincontainingmolecule4(Tim4)andinvestigateitsexpressionincolorectalcancerandgastric：ThestandardplasmidofTim4genewasfirstlylevelsofexpressionofTim4inthetumortissuesof37patientswithgastriccancerand19patientswithcolorectalcancerweredetectedbyRTPCRandrealtimePCR.Results：ThestandardquantitativecurveofTim4genewasgenerated(correlationcoefficientr=).TherealtimeRTPCRforTim4wasaccurateandexpressionofTim4geneinthegastriccancertissues(26/37)waslowerthanthatinthematchingadjacentnoncanceroustissues.TherateofhigherexpressionofTim4gene(2)inadjacentnoncanceroustissues/gastriccancertissueswas%(18/26).Likewise,12samplesexpressionofTim4geneinthecolorectalcancertissuesof19patientswerelowerthanthatinthematchingadjacentnoncanceroustissues,therateofhigherexpressionofTim4gene(2)inadjacentnoncanceroustissueswas%(9/12).Conclusion：AstablerealtimeRTPCRhasbeensuccessfullyestablishedfordetectionofTim4geneofTim4geneisloweringastriccancerandcolorectalcancertissues,andprovideaplatformforTim4andcancerstudies.

［Keywords］Tcellsimmunoglobulinandmucindomaincontainingmolecule4；realtimeRTPCR；gastriccancer；colorectalcancer

T細胞免疫球蛋白及黏蛋白域分子4也稱為Timd4，是有調(diào)節(jié)細胞免疫應答作用的Tim基因家族的成員［1］，主要表達于抗原遞呈細胞,特別是成熟的樹突狀淋巴細胞，能與Tim1特異性結(jié)合而調(diào)節(jié)T細胞增殖［2］。近年研究顯示，Tim4是磷脂酰絲氨酸的受體，能通過磷脂酰絲氨酸與細胞結(jié)合而促進凋亡細胞的吞噬作用［3］。由于Tim4與凋亡關(guān)系密切，這使我們關(guān)注其與干細胞及腫瘤的相關(guān)性，為此本研究在建立定量RTPCR檢測Tim4基因表達的基礎(chǔ)上，初步探討該基因在結(jié)直腸癌和胃癌組織中的表達水平，為深入探討Tim4與腫瘤的相關(guān)性提供實驗數(shù)據(jù)。

1材料和方法

細胞與患者標本

人臍帶來源的間質(zhì)干細胞，人胃癌細胞株；胃癌標本37例，其中男23例，女14例，年齡44～75歲,中位年齡61歲。結(jié)直腸癌標本19例，其中男12例，女7例，年齡37～84歲,中位年齡63歲。所有病例取自2008年1月至2009年5月江蘇大學附屬人民醫(yī)院和江蘇大學附屬醫(yī)院外科收治并經(jīng)病理組織學確診的手術(shù)切除標本，術(shù)前均未接受化療及放療，所取患者標本皆為成對的癌組織和癌旁組織(距癌變部位邊界5cm以外且經(jīng)病理證實無癌變的組織)。

方法

總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄

培養(yǎng)的細胞取107個，組織標本取50mg研碎，各加Trizol試劑(Invitrogen公司)提取總RNA。提取的總RNA經(jīng)鑒定后取完整性好的樣品，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(MBI)以O(shè)ligo(dT)為引物，合成cDNA。

引物設(shè)計

參照基因庫提供的人Tim4mRNA的完整序列設(shè)計引物。Tim4,β肌動蛋白基因的引物皆跨外顯子設(shè)計，引物序列和PCR擴增產(chǎn)物長度見表1。

RTPCR

反應體系為10×緩沖液(含Mg2+)μl，10mmol/LdNTPμl，10pmol/μl的上下游引物各μl，5U/μlTaq酶μl，模板cDNA1μl，加ddH2O補足至25μl。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預變性5min；94℃變性30s，Tim4(58℃)，β肌動蛋白(56℃)退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)；72℃10min。瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。表1Tim4,β肌動蛋白基因引物序列

Tim4標準質(zhì)粒制備

從ucMSC細胞中經(jīng)RTPCR擴增出Tim4的cDNA片段和β肌動蛋白的cDNA片段，使用TA克隆試劑盒，將純化的PCR產(chǎn)物連接入pMD18T載體，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)菌，篩選陽性克隆，擴菌后純化提取質(zhì)粒，倍比稀釋質(zhì)粒以繪制標準曲線。

定量RTPCR

反應體系：2×SYBRGreenRealtimePCRMasterMix10μl，μlcDNA模板，引物各μl(10pmol/μl),用ddH2O補足至20μl。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預變性5min，使用4步法擴增，具體為94℃30s,58℃(Tim4)/56℃(β肌動蛋白)30s,72℃30s,85℃(Tim4)/88℃(β肌動蛋白)8s后檢測熒光，35個循環(huán)。

統(tǒng)計分析

采用SPSS系統(tǒng)軟件進行統(tǒng)計分析，配對資料比較采用Wilcoxon′ssignedranktests。

2結(jié)果

實時定量PCR擴增Tim4

以107～102拷貝/μl的標準質(zhì)粒為模板擴增Tim4基因，標準曲線相關(guān)系數(shù)為；經(jīng)融解曲線分析顯示，在85℃檢測熒光，可排除引物二聚體等的干擾，標準質(zhì)粒擴增特異。以β肌動蛋白為內(nèi)參照，同樣繪制標準曲線，標準質(zhì)粒拷貝數(shù)為109～104拷貝/μl，相關(guān)系數(shù)為，88℃檢測熒光同樣可排除非特異擴增的干擾。

RTPCR檢測Tim4基因的表達

采用RTPCR方法擴增了細胞和組織標本，結(jié)果顯示人臍帶間質(zhì)干細胞與人胃癌細胞皆有Tim4mRNA的表達，但SGC7901細胞中表達極弱。在37例胃癌成對標本中，癌旁組織和配對胃癌組織皆有擴增，但擴增條帶有強弱之分。19例結(jié)直腸癌與配對癌旁組織研究與胃癌中的結(jié)果類似。

實時定量PCR分析Tim4在胃癌和結(jié)直腸癌組織中的表達

在構(gòu)建的Tim4標準質(zhì)粒繪制標準曲線基礎(chǔ)上，以β肌動蛋白的表達量為內(nèi)參照，通過兩者的比值分析Tim4基因在癌組織和癌旁組織中的表達差異，結(jié)果顯示在37例胃癌成對標本中，26例癌旁組織中的Tim4表達高于癌組織，且在26例癌旁組織高表達的樣本中，18例胃癌癌旁組織與癌組織表達比率大于2，但差異無統(tǒng)計學意義。19例結(jié)直腸癌和配對癌旁組織標本中，12例標本癌旁組織的Tim4表達高于癌組織(12/19)，在19例結(jié)直腸癌中12例癌旁組織表達高于對應的癌旁組織，其中癌旁組織表達高于癌組織2倍的有9例,差異同樣無統(tǒng)計學意義。

3討論

Tim基因家族是2003年新發(fā)現(xiàn)的具有調(diào)節(jié)Th1，Th2細胞介導免疫應答作用的基因家族［1］。人類Tim基因家族由3個成員組成，即Tim1，Tim3，Tim4，位于染色體。Tim4是Tim1的配體，主要表達于抗原遞呈細胞,特別是成熟的樹突狀淋巴細胞，涉及Th1Th2細胞的平衡。Khademi等［4］研究發(fā)現(xiàn)，Tim蛋白可能涉及Th1和Th2細胞介導的疾病，如多發(fā)性硬化癥等，現(xiàn)主要研究多集中在對Tim多態(tài)性與自身免疫性疾病、過敏性疾病的相關(guān)性方面［5,6］。

鑒于Tim4與細胞凋亡關(guān)系密切，本研究首先建立了檢測人Tim4基因表達的實時熒光定量PCR的方法，為Tim4基因的定量檢測提供可能；初步探討其在不同腫瘤組織，如胃癌和結(jié)直腸癌中的表達水平。研究結(jié)果顯示，在大多數(shù)胃癌和結(jié)直腸癌患者中，Tim4在癌組織中的表達低于配對的癌旁組織，但無論在胃癌還是結(jié)直腸癌，癌組織和癌旁組織中的Tim4mRNA表達水平并無顯著的統(tǒng)計學差異，這可能與樣本例數(shù)較少，腫瘤標本未分期等相關(guān)，可進一步擴大標本量，從蛋白水平探討Tim4在腫瘤中的表達，并對其作用機制進行深入研究。

本研究建立的檢測Tim4基因表達的實時定量PCR方法特異性好，敏感性高，線性范圍廣且結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于其他腫瘤組織或腫瘤患者血清學中Tim4的定量分析。本研究顯示Tim4基因在胃癌和結(jié)直腸癌的癌組織中均有不同程度表達，腫瘤標本中Tim4基因表達的定量檢測可能提供一些新的實驗數(shù)據(jù)，Tim4與腫瘤的相關(guān)性值得探討。

【參考文獻】

［1］KuchrooVK,UmetsuDT,DekruyffRH,etTIMgenefamily:emergingrolesinimmunityanddisease［J］.NatRevImmunol,2003,3(6):454-462.

［2］MeyersJH,ChakavartiS,SchlesingerD,et4istheligandforTIM1,andtheTIM1TIM4interactionregulatesTcellproliferation［J］.NatImmunol,2005,6(5):455-464.

［3］MiyanishiM,TadaK,KoikeM,etofTim4asaphosphatidylserinereceptor［J］.Nature,2007,450(7168):435-439.

［4］KhademiM,IllesZ,AlexanderW,etcellIgandmucindomaincontainingmolecule3(TIM3)andTIM1moleculesaredifferentiallyexpressedonhumanTh1andTh2cellsandincerebrospinalfluidderivedmononuclearcellsinmultiplesclerosis［J］.JImmunol,2004,172(11):7169-7176.

［5］CaiP