細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展歷史

1856年，實(shí)現(xiàn)紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的突破。1885年，Roux溫生理鹽水培育雞胚組織；1887年，培養(yǎng)皿(英文：Petridish)由在德國(guó)生物學(xué)家羅伯特?科赫手下工作的細(xì)菌學(xué)家朱利斯?理查德?佩特里(JuliusRichardPetri，1852-1921)于1887年設(shè)計(jì)，故也稱為“佩特里皿”。是一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室器皿，由—平面圓盤狀的底和—蓋組成，一般用玻璃或塑料制成。1902年，植物細(xì)胞培養(yǎng)是在植物組織培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。1902年Haberlandt確定了植物的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)存在其生命體的全部能力(全能性)，使成為植物組織培養(yǎng)的開端。其后，為了實(shí)現(xiàn)分裂組織的無(wú)限生長(zhǎng)，對(duì)外植體的選擇及培養(yǎng)基等方面進(jìn)行了探索。1906年，Beebe和Ewing用蓋片懸滴培養(yǎng)法，以動(dòng)物血清做培養(yǎng)基，培養(yǎng)狗淋巴細(xì)胞存活了72小時(shí)?，F(xiàn)代細(xì)胞培養(yǎng)是從Harrison(1907)和Carrel(1912)兩人開始的。Harrison參考前人經(jīng)驗(yàn)，創(chuàng)建了蓋片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法。1907年，哈里森(Harrison)在無(wú)菌條件下用淋巴液作培養(yǎng)基，培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織存活數(shù)周，并觀察到神經(jīng)細(xì)胞突起的生長(zhǎng)過(guò)程，由此創(chuàng)建了蓋片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法，奠定了動(dòng)物組織體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)。1910-1912年，Carrel采用無(wú)菌操作、更新培養(yǎng)基、傳代，完善了懸滴培養(yǎng)法；1912年，Haberlandt的學(xué)生Kotte和美國(guó)的Robins在根尖培養(yǎng)中獲得了組織培養(yǎng)的成功。Kotte采用了無(wú)機(jī)鹽、葡萄糖、蛋白胨、天冬酰胺，及添加各種氨基酸的培養(yǎng)基。1915年，昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)的鼻祖是德國(guó)人forhardBendict(1878—1958)，發(fā)表了有關(guān)昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)的第一篇文章。1923年，Carral設(shè)計(jì)創(chuàng)立了卡氏瓶培養(yǎng)法，用此法可根據(jù)需要隨時(shí)更換培養(yǎng)液，既有利于組織不斷生長(zhǎng)，又可以運(yùn)用不同種類的營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)不同的細(xì)胞，極大地推動(dòng)了當(dāng)時(shí)組織培養(yǎng)研究。在培養(yǎng)基方面，Earle在1948年設(shè)計(jì)了含有碳酸氫鈉等鹽類的Earle氏鹽溶液，Hank’s在1949年設(shè)計(jì)了Hank’s氏鹽溶液。Earle、Dulbecco等于1943年創(chuàng)建單層細(xì)胞培養(yǎng)法，首建長(zhǎng)期傳代的L-細(xì)胞系;1948年Sanford創(chuàng)建單細(xì)胞分離培養(yǎng)法，獲L-細(xì)胞純系。1948年，體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)它是利用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，測(cè)定細(xì)胞溶解，抵制細(xì)胞生長(zhǎng)的毒性作用來(lái)評(píng)價(jià)生物材料的潛在細(xì)胞毒性。1948年，RosenBluth等首次報(bào)道利用鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)篩選聚合物，開始了細(xì)胞毒性試驗(yàn)評(píng)價(jià)生物材料的生物相容性的研究與應(yīng)用工作。1950年，Enders及其同事發(fā)表了第一篇關(guān)于在培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)病毒的報(bào)告，開拓了以動(dòng)物病毒為研究對(duì)象的新領(lǐng)域。作為大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，Copsik等人成功的進(jìn)行了有關(guān)倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK)的懸浮培養(yǎng)。

1951年，Dulbecco等采用胰蛋白酶消化組織培養(yǎng)法，獲得了單層細(xì)胞培養(yǎng)，并開始應(yīng)用人工合成培養(yǎng)液。 隨著抗生素的普遍應(yīng)用，體外培養(yǎng)細(xì)胞已經(jīng)是分離、鑒定和大量培養(yǎng)病毒的簡(jiǎn)便而又十分有效的工具。1951年，Gey首建人腫瘤細(xì)胞——Hela細(xì)胞系。1952年，水痘一帶狀皰疹是由一種DNA病毒即水痘一帶狀皰疹病毒(varicella-zostervirus，VZV)感染引起，該病毒1952年由Weller等首先通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)獲得。1954年，Peebles采自麻疹病人的材料進(jìn)行人的腎臟細(xì)胞培養(yǎng)，從而成功地分離到病毒。乙醚易使病毒鈍化。用人細(xì)胞、猴腎等作為第一代培養(yǎng)的細(xì)胞，再以FL.Hela細(xì)胞等的株細(xì)胞進(jìn)一步增殖，并可在雞胚的羊膜和絨毛尿囊膜上進(jìn)行減毒增殖。1955年，恩德斯(J.H.Enders)發(fā)表了用組織細(xì)胞培養(yǎng)分離麻疹病毒成功的報(bào)告。中國(guó)第一代醫(yī)學(xué)病毒學(xué)家湯飛凡認(rèn)為這是病毒方法學(xué)的一個(gè)突破，必須盡快掌握它。1955年，他就領(lǐng)導(dǎo)聞仲權(quán)開始建立了人胚和猴腎細(xì)胞的組織培養(yǎng)。1956年，支原體是一種能營(yíng)獨(dú)立生活的最小微生物,它沒(méi)有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，故其形態(tài)有較大的可塑性，容易通過(guò)細(xì)菌濾器,是動(dòng)物細(xì)胞系長(zhǎng)期培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染源。1956年由Robison['〕首次從體外細(xì)胞培養(yǎng)物中分離出支原體。1957年，各種培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)基孕育而生。1957年Dulbecco實(shí)驗(yàn)室采用胰蛋白酶消化處理，使成塊的組織分散成單個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行懸液培養(yǎng)，從而開創(chuàng)了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。用單層細(xì)胞培養(yǎng)法可以建立很多細(xì)胞系(cellline)，通過(guò)單細(xì)胞分離培養(yǎng)法又可建立克隆細(xì)胞株(clone或cellstrain)。1958年，狂犬病毒適應(yīng)于在細(xì)胞培養(yǎng)中增殖，隨后利用該技術(shù)生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)疫苗在安全性和效力上都日臻完善。1958年，陳善明先生等老一輩科學(xué)家?guī)ьI(lǐng)科研人員根據(jù)新疆地區(qū)的資源特點(diǎn)，首先開展了動(dòng)物病毒學(xué)的研究，為新疆生物化學(xué)的研究開創(chuàng)了局。利用兔腎、牛腎、羊腎和雞脾等原代單層細(xì)胞，進(jìn)行口蹄疫病毒的研究。采用兔腎細(xì)胞培養(yǎng)出的A型III系口蹄疫苗，深受牧區(qū)廣大牧民的歡迎。1958年，日本科學(xué)家崗田用滅活的仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)人的腹水癌細(xì)胞融合成功。后來(lái)科學(xué)家們又成功地誘導(dǎo)了不同種動(dòng)物的體細(xì)胞融合，并且能將雜種細(xì)胞培養(yǎng)成活。隨著細(xì)胞融合技術(shù)的不斷改進(jìn)，現(xiàn)在這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、病毒學(xué)等多種學(xué)科的研究工作中。1959年，美國(guó)M.Klein等用牛腎細(xì)胞培養(yǎng)物最先分離到腺病毒(命名為“10”系腺病毒)，其抗原結(jié)構(gòu)類似于人腺病毒。1960年1960年，人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)方法是1960年由Moorhead提出來(lái)的。正常情況下，人外周血小淋巴細(xì)胞都處在G1期(或G0期)，但在體外給予一定的條件，進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)72h就可獲得大量的有絲分裂細(xì)胞。這種取材簡(jiǎn)易、用血量少的培養(yǎng)方法已被廣泛采用。

1961年，Hayflick首建人二倍體細(xì)胞系25種，開辟了應(yīng)用新方向。1962年，由Murashige和Skoog為煙草細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)的MS培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽和離子濃度較高，是較穩(wěn)定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養(yǎng)分的數(shù)量和比例合適，能滿足植物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和生理需要，因而適用范圍比較廣，多數(shù)植物組織培養(yǎng)快速繁殖用。1963年，進(jìn)行了單細(xì)胞克隆。原始的細(xì)胞株是成纖維細(xì)胞，貼壁依賴性。但后來(lái)經(jīng)無(wú)數(shù)次傳代后細(xì)胞可懸浮生長(zhǎng)，它廣泛用于增殖各種病毒，生產(chǎn)獸用疫苗。1964年，我國(guó)就開始進(jìn)行人參細(xì)胞培養(yǎng)。1965年，有學(xué)者在進(jìn)行魚類細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)魚類細(xì)胞能夠分泌類似哺乳類IFN的抗病毒活性物質(zhì)，之后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種魚類機(jī)體和體外培養(yǎng)細(xì)胞均能誘生出IFN。1966年，Steele和Breg成功的進(jìn)行了羊水細(xì)胞培養(yǎng)及胎兒核型分析之后，使羊膜腔穿刺術(shù)廣泛地應(yīng)用于胎兒染色體疾病及先天性代謝病的產(chǎn)前...Cordocentesis），隨后此方法開始廣泛應(yīng)用于胎兒疾病的產(chǎn)前診斷。1967年，Mancini和Yates在雞胚腦細(xì)胞培養(yǎng)中首次成功繁殖了AEV的VR株。隨后雞胚成纖維細(xì)胞、腎細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和雛雞胰細(xì)胞也被用于病毒適應(yīng)株和野毒株的培養(yǎng)，病毒滴度，特別是自然毒株，一般較低，且未見(jiàn)細(xì)胞病變。1967年，HyClone實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建于1967年，從為美國(guó)大學(xué)基礎(chǔ)研究中的細(xì)胞培養(yǎng)開發(fā)高質(zhì)量的胎牛血清做起，HyClone最先使用科學(xué)的收集方法和生產(chǎn)工藝生產(chǎn)出了內(nèi)毒素和血紅蛋白含量極低的高品質(zhì)血清。第一個(gè)使用了高效過(guò)濾方法，大大的提高了FBS的質(zhì)量和促生長(zhǎng)特性。1969年，煙草的單個(gè)單倍體孢子培養(yǎng)成了完整的單倍體植株。1970年，Melchers在金魚草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中獲得了溫度突變體。1970年,PSCarlson、H.Binding和YMHeimer等人分別分離出煙草營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞、矮牽?？规溍顾丶?xì)胞系及煙草抗蘇氨酸細(xì)胞系。1971年，地鼠腎細(xì)胞疫苗（PHKCV）：原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)疫苗，加拿大、前蘇聯(lián)于1971年開始使用。1972年，中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)是由RAKnazek于1972年模擬體內(nèi)微循環(huán)，設(shè)計(jì)了小型中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)裝置，中空纖維是用聚砜或丙烯的聚合物制成。培養(yǎng)細(xì)胞在中空纖維上能不斷從流動(dòng)培養(yǎng)液獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，細(xì)胞代謝產(chǎn)物和分泌物又可隨培養(yǎng)液的流動(dòng)運(yùn)走。1973年，紅豆杉細(xì)胞大量培養(yǎng)在我國(guó)也獲得初步成功，從細(xì)胞培養(yǎng)物中得到了貴重的抗癌藥物紫杉醇，但產(chǎn)率還有待提高。1975年，角質(zhì)形成細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)是在Rheinwald和Green于1975年創(chuàng)立的飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上逐漸發(fā)展起來(lái)的。1975年，Sato成功地用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株CH4，還有人用HamF12無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基成功地克隆了CHO細(xì)胞。

1976年，VanWezel首次報(bào)道使用微載體培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，創(chuàng)立了生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)細(xì)胞工藝，使動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)入高密度培養(yǎng)階段。1977年，Dexter創(chuàng)立了骨髓細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)，可支持粒系血細(xì)胞的分化和成熟。1978年，植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用范圍得到了迅速發(fā)展，利用體細(xì)胞無(wú)性系產(chǎn)生的大量變異，再結(jié)合人工誘變方法對(duì)植物組織或細(xì)胞進(jìn)行突變體篩選，已經(jīng)獲得了許多抗病抗蟲，抗除草劑、矮稈、高蛋白等新品種。1979年，Provost首次在體外培養(yǎng)成功后，HAV可用多種原代及傳代細(xì)胞株分離培養(yǎng)，如非洲綠猴腎細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞、傳代猴腎細(xì)胞（Vero、BSC-1、FRhK-4）以及人2倍體肺細(xì)胞株（MRC5、KMB17）等。1981年，Larkin等系統(tǒng)地論述了在植物體細(xì)胞培養(yǎng)再生植株的無(wú)性系變異以來(lái)，利用無(wú)性系進(jìn)行突變體篩選來(lái)改良農(nóng)作物品種。1982年，F(xiàn)ridenshtein等發(fā)現(xiàn)并建立了以貼壁培養(yǎng)法為主要手段的分離擴(kuò)增方法。1983年，英國(guó)Wellcome公司就能夠利用5000L的細(xì)胞罐進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)口蹄疫疫苗；美國(guó)Genentech公司應(yīng)用SV40為載體，將乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行高效表達(dá)生產(chǎn)出乙型肝炎疫苗；1987年，國(guó)外有人把培養(yǎng)的黑素細(xì)胞開始用于臨床。利用黑素細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，可以把少量皮膚組織擴(kuò)增培養(yǎng)出大量黑素細(xì)胞。有人用來(lái)治療白瘢風(fēng)等疾病，療效滿意，前景很好。但是由于黑素細(xì)胞常用培養(yǎng)基中含佛波醇酯（TPA），存在致瘤危險(xiǎn)，影響了這種方法在臨床的應(yīng)用。1988年，Hofmann等首次在培養(yǎng)基含胰酶的Vero細(xì)胞上成功繁殖出PEDV,此后，該方法在PEDV的分離、細(xì)胞培養(yǎng)和疫苗的研究中廣泛應(yīng)用。1996年，Cha等發(fā)現(xiàn)在臨床低傳代分離株Toledo等病毒株中有一個(gè)包含19個(gè)開放閱讀框（ORF,UL133~UL151）的區(qū)域，該區(qū)域是實(shí)驗(yàn)室株AD169所不具有的。1997年，Laurain等在1997年用野生型發(fā)根農(nóng)桿菌AgrobacteriumrhizogenesA4菌株感染銀杏合子胚誘導(dǎo)發(fā)根，建立了懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系，同時(shí)用銀杏胚囊（雌配子體）作外植體誘導(dǎo)，建立了懸浮培養(yǎng)系，用HPLC測(cè)定了GA、GB、GC、GJ和BB的含量。1999年，劉勇等成功地進(jìn)行了胎兒椎間盤細(xì)胞的單層培養(yǎng)。目前，國(guó)內(nèi)外進(jìn)行椎間盤細(xì)胞單層培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究較多，技術(shù)方法已經(jīng)成熟。在流加懸浮培養(yǎng)工藝方面，美國(guó)麻省理工XieLiangzhi等人2000年報(bào)道在2L生物反應(yīng)器中流加培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)控制降低氨和乳酸的比生成速率，補(bǔ)充培養(yǎng)基包括營(yíng)養(yǎng)成分、胎牛血清和痕量金屬，最大活細(xì)胞密度達(dá)到1.7x107cells/mL。2001年，美國(guó)Ohashi、Ryo等人報(bào)道采用2L一次性生物反應(yīng)器灌注培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。2001年，瑞士Heine、Holger等人用帶超聲細(xì)胞分離器（UCS）的連續(xù)灌注攪拌罐生物反應(yīng)器培養(yǎng)鼠雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。2004年，德國(guó)Thomas等人在1L攪拌罐生物反應(yīng)器中培養(yǎng)rCHO細(xì)胞生產(chǎn)人MUC-1糖蛋白，采取葡萄糖濃度限制的高產(chǎn)率灌注工藝減少有害代謝物，代謝轉(zhuǎn)向TCA循環(huán)增加，活細(xì)胞密度保持在（1~2）x107cells/ml。2005年，在新華奶牛場(chǎng)降生的被導(dǎo)入人乳鐵蛋白基因的體細(xì)胞克隆牛耳朵成纖維細(xì)胞，經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)、克隆、胚胎培養(yǎng)和移植等技術(shù)實(shí)現(xiàn)的。經(jīng)相關(guān)技術(shù)鑒定，確系轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆牛的再克隆體。此次實(shí)驗(yàn)的妊娠率、出生率、存活率等均達(dá)到世界一流水平。2007年，世界上第一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的流感疫苗上市；在2007年6月13日宣布，歐盟已經(jīng)批準(zhǔn)其流感疫苗Optaflu上市。2007年11月，成功地用人類皮膚細(xì)胞培養(yǎng)出了誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞。由于這項(xiàng)研究解決了胚胎干細(xì)胞研究所面臨的倫理問(wèn)題，因此將徹底改變干細(xì)胞研究的科學(xué)與政策，為生物醫(yī)學(xué)研究開辟新的方向。2008年9月13日，日本京都大學(xué)日前宣布，該校教授山中伸彌開發(fā)的誘導(dǎo)