淺論JNK在cGVHD狼瘡樣小鼠腎組織表達(dá)及在腎纖維化中作用研究

淺論JNK在cGVHD狼瘡樣小鼠腎組織表達(dá)及在腎纖維化中作用研究【摘要】目的：觀察cJun氨基末端激酶(JNK)在慢性移植物抗宿主病狼瘡樣小鼠腎組織中的表達(dá)情況，初步探討其在狼瘡腎炎腎臟纖維化中所起的作用。方法：建立cGVHD狼瘡樣小鼠模型。將小鼠分為12周正常對照組、16周正常對照組、12周模型組及16周模型組4組，每組6只，于12周末處死12周正常對照組和12周模型組小鼠，16周末處死16周正常對照組和16周模型組小鼠，采用雙縮脲比色法觀察各組小鼠24h尿蛋白排泄量，HE和Masson染色觀察腎間質(zhì)纖維化程度，免疫組織化學(xué)法定位檢測JNK、pJNK在腎組織的表達(dá)，RTPCR法檢測各組JNKmRNA表達(dá)及Westernblotting技術(shù)半定量檢測JNK、pJNK蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：12周模型組小鼠24h尿蛋白排泄量，JNK、pJNK蛋白及mRNA的表達(dá)與正常對照組相比均明顯增加，16周模型組更甚。結(jié)論：JNK、pJNK蛋白及mRNA表達(dá)在cGVHD狼瘡樣小鼠腎組織中明顯上調(diào)，其可能在狼瘡腎炎腎纖維化進(jìn)程中起著重要作用。

【關(guān)鍵詞】慢性移植物抗宿主?。焕钳從I炎；cJun氨基末端激酶；腎纖維化；小鼠

狼瘡腎炎是系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是SLE患者的主要死亡原因之一，其病變以腎小球、血管、腎小管及其間質(zhì)損害為特征，最終進(jìn)展為腎臟纖維化甚至腎功能衰竭。腎臟纖維化是各型狼瘡腎炎進(jìn)展到終末期的共同病理表現(xiàn)，其主要的發(fā)生機(jī)制與腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、細(xì)胞外基質(zhì)沉積以及細(xì)胞內(nèi)多種促纖維化信號途徑被激活等有關(guān)。近幾年來許多研究結(jié)果表明,cJun氨基末端激酶信號傳導(dǎo)通路的功能異常在腎臟纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用［1］，但在LN研究尚無報(bào)道，因此作者通過構(gòu)建慢性移植物抗宿主病(chronicgraftversushostdisease，cGVHD)狼瘡樣小鼠模型，探討JNK在LN發(fā)展過程中的表達(dá)與活化及其所起的作用。

1材料與方法

實(shí)驗(yàn)動物

8～10周齡雌性(C57BL/6J×DBA/2)F1雜交鼠(以下稱F1代小鼠)及6～7周齡DBA/2小鼠購自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)動物中心，體重(±)g，SPF級，飼養(yǎng)于本校公共衛(wèi)生學(xué)院SPF級動物房。

模型的建立與分組

將F1代小鼠分為12周正常對照組、16周正常對照組、12周模型組及16周模型組4組，每組6只。參考文獻(xiàn)［2］制作cGVHD狼瘡樣小鼠模型。取DBA/2小鼠脾臟、胸腺、淋巴結(jié)細(xì)胞，制成比例為約60%脾細(xì)胞、30%胸腺細(xì)胞及10%淋巴結(jié)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，分別于第0、3、7、10天經(jīng)尾靜脈注射于模型組F1代小鼠,每次給予細(xì)胞數(shù)約為50×106個(gè)。正常對照組則于相同時(shí)間經(jīng)尾靜脈注射等體積生理鹽水。4組小鼠首次尾靜脈注射后每兩周留取1次24h尿，建模后第12周末處死12周正常對照組和12周模型組兩組小鼠，16周末處死16周正常對照組和16周模型組兩組小鼠，并取下腎臟，一部分置于-70℃低溫保存以備提取總RNA和蛋白質(zhì)，另一部分置于10%中性福爾馬林溶液中，經(jīng)石蠟包埋后切片行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)和組織病理學(xué)檢查。

24h尿蛋白量測定

用雙縮脲比色法測定24h尿蛋白，小鼠尿液1∶5稀釋后按操作說明書操作。

組織病理學(xué)檢查

2μm連續(xù)切片，置多聚賴氨酸包被的載玻片上，二甲苯脫蠟，梯度酒精至水，分別作HE和Masson染色，在普通光鏡下觀察各組小鼠腎組織病理學(xué)變化。

免疫組織化學(xué)檢測

SABC法行免疫組織化學(xué)染色(試劑盒購于晶美生物技術(shù)有限公司)：取2μm厚石蠟切片脫蠟至水；加3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10min；滴加胃蛋白酶修復(fù)抗原，37℃孵育15min；加含10%羊血清的封閉液在室溫下封閉30min；滴加兔抗小鼠JNK、pJNK(Thr183/Tyr185)多克隆抗體(1∶400，CellSignaling公司)，4℃孵育過夜，37℃復(fù)溫30min；滴加生物素偶聯(lián)的羊抗兔IgG抗體；37℃孵育30min；加HRP標(biāo)記的鏈親和素，37℃孵育30min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片。以PBS替代一抗后作為陰性對照，陽性時(shí)呈棕黃色。

Westernblotting

取-70℃保存的腎組織約100mg，加入預(yù)冷的蛋白裂解液ml充分裂解。4℃、3000r·min-1離心10min后取上清，測蛋白濃度。取100μg蛋白加入上樣緩沖液，煮沸3min后進(jìn)行12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉(zhuǎn)PVDF膜，質(zhì)量分?jǐn)?shù)脫脂奶粉的TTBS封閉液37℃封閉2h，分別加入兔抗小鼠JNK多克隆抗體(1∶1000)、兔抗小鼠pJNK(Thr183/Tyr185)多克隆抗體(1∶1000)，4℃過夜。加入1∶2500稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，37℃，2h。DAB顯色。每組重復(fù)3次。圖片掃描保存后，用Totallab分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值數(shù)字化。以GAPDH為內(nèi)參，用目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參灰度值的比值代表目的蛋白的相對表達(dá)含量。

RTPCR

總RNA提取從-70℃低溫冰箱中取出腎組織，迅速用Trizol試劑(晶美生物技術(shù)有限公司)勻漿提取總RNA。取5μl總RNA進(jìn)行甲醛變性凝膠電泳，紫外燈下觀察5、18、28s條帶清晰提示RNA完整無降解。

逆轉(zhuǎn)錄在PCR管中加入1μl10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、2μlMgCl2(25mmol·L-1)、1μlOligodT、2μldNTPs(10mmol·L-1)、μlRNaseinhibitor、1μlAMV逆轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa公司)、μl總RNA，30℃10min后42℃逆轉(zhuǎn)錄50min，99℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5min，5℃5min，所得cDNA-20℃保存用于PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增JNK及GAPDH內(nèi)參照引物用DNAClub軟件設(shè)計(jì)，由上海Invitrogen公司合成，序列見表1。表1目的基因上下游引物及其擴(kuò)增片段長度

PCR反應(yīng)體系為:5×PCR緩沖液10μl、MgCl2(25mmol·L-1)4μl、dNTPs(10mmol·L-1)1μl、上下游引物(10μmol·L-1)各1μl、cDNA模板1μl、TaqDNA聚合酶(5U·μl-1)(TaKaRa公司)μl，補(bǔ)足雙蒸水至50μl。EppendorfAG22331PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增。96℃預(yù)變性3min；96℃變性30s，54℃退火40s，72℃延伸1min，循環(huán)38次；72℃終末延伸10min。

產(chǎn)物檢測擴(kuò)增產(chǎn)物在含mmol·L-1溴乙錠的1%瓊脂糖凝膠中以4～5V·cm-1電壓降電泳30min。于ImageMasterVDS凝膠掃描儀上成像,用TotallabV凝膠圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。所有JNK產(chǎn)物的吸光度均以GAPDH為基準(zhǔn)較正,以JNK/GAPDH表示。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)數(shù)資料以x-±s表示，各組之間比較采用多因素方差分析或秩和檢驗(yàn)，相同時(shí)間點(diǎn)兩組之間采用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

24h尿蛋白定量結(jié)果

12周與16周模型組小鼠24h尿蛋白總量均顯著高于相應(yīng)正常對照組小鼠()，16周模型組小鼠24h尿蛋白總量與12周模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()，見表2。表2各組小鼠24h尿蛋白檢查結(jié)果1）與正常對照組比較，；2）與12周模型組比較，

腎組織HE、Masson染色結(jié)果

12周及16周正常對照組小鼠腎小球和腎小管的大小、形態(tài)正常，腎間質(zhì)未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤及纖維增生。12周模型組小鼠腎組織可見腎小球系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增生，系膜區(qū)增寬，腎小球體積增大，部分呈萎縮硬化改變，腎小管擴(kuò)張，間質(zhì)可見大量單個(gè)核細(xì)胞浸潤及膠原纖維沉積。16周模型組小鼠腎小球硬化改變更為明顯，腎小管多灶性萎縮及空泡變性，管腔內(nèi)可見大量蛋白管型，腎小球囊壁、腎小管間質(zhì)均有更為明顯的膠原纖維沉積。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

腎組織中JNK表達(dá)變化12周及16周正常對照組小鼠腎小球臟層上皮、近端及遠(yuǎn)端腎小管均有少量JNK表達(dá)；12周模型組小鼠腎小球系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、臟層上皮細(xì)胞及腎小管間質(zhì)中陽性細(xì)胞數(shù)目增加，陽性表達(dá)顏色加深；16周模型組小鼠腎組織中JNK表達(dá)更加明顯。見圖1。

周正常對照組；周模型組；周正常對照組；周模型組

圖1各組小鼠腎組織JNK蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果DAB顯色×400

腎組織中pJNK表達(dá)變化12周及16周正常對照組小鼠僅腎小管間質(zhì)有極少量的pJNK表達(dá)；12周模型組小鼠腎組織pJNK主要表達(dá)在腎小球系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、臟層上皮細(xì)胞及近端和遠(yuǎn)端腎小管，16周模型組小鼠腎組織pJNK表達(dá)更加顯著。見圖2。

Westernblotting檢測結(jié)果分析

Westernblotting檢測結(jié)果見圖3。12周與16周模型組小鼠腎組織JNK、pJNK蛋白表達(dá)較正常對照組小鼠明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()，16周模型組各因子蛋白表達(dá)與12周模型組相比差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()，12周正常組與16周正常組之間沒有明顯差異，見表3。

腎組織JNKmRNA半定量檢測結(jié)果

RTPCR檢測結(jié)果見圖4。12周及16周模型組小鼠腎組織JNKmRNA表達(dá)比相應(yīng)正常對照組小鼠明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()，16周模型組JNKmRNA表達(dá)與12周模型組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()，12周正常對照組與16周正常對照組之間沒有明顯差異，見表4。

3討論

cGVHD狼瘡樣小鼠是國際公認(rèn)并被廣泛應(yīng)用的LN小鼠模型，它是一種誘導(dǎo)性免疫復(fù)合物腎炎模型，其腎臟多呈彌漫性病變,主要表現(xiàn)為腎小球系膜增生、硬化、萎縮，腎小管損害，腎間質(zhì)出現(xiàn)大量單個(gè)核細(xì)胞表3各組小鼠腎組織JNK、pJNK蛋白表達(dá)的定量分析1）與正常對照組比較，；2）與12周模型組比較，浸潤，且常伴間質(zhì)膠原纖維沉積。本實(shí)驗(yàn)病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)12周模型組腎小球系膜細(xì)胞彌漫增生、基底膜節(jié)段性增厚和間質(zhì)細(xì)胞浸潤，16周模型組出現(xiàn)腎小球硬化、細(xì)胞明顯減少、基質(zhì)大量增生及間質(zhì)纖維化，表明我們已成功構(gòu)建了cGVHDLN小鼠模型。

腎臟纖維化是各型狼瘡腎炎進(jìn)展到終末期的共同病理表現(xiàn)，其主要的發(fā)生機(jī)制與腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、細(xì)胞外基質(zhì)沉積以及細(xì)胞內(nèi)多種促纖維化信號途徑被激活等有關(guān)。JNK家族是1990年被發(fā)現(xiàn)的促分裂原活化蛋白激酶與正常對照組比較，；2）與12周模型組比較，

MAPK）超家族成員之一，屬于進(jìn)化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。目前在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的編碼JNK的基因包括jnk1、jnk2和jnk3，其相應(yīng)的編碼產(chǎn)物JNK1和JNK2表達(dá)廣泛，JNK3則僅限表達(dá)于腦、心臟、睪丸等組織［34］。典型的MAPK信號通路包括3個(gè)連續(xù)的酶促反應(yīng)，即MAPKKKs→MAPKKs→MAPKs。JNKs的直接上游激酶MAPKKs目前確認(rèn)的有MKK4和MKK7，激活MAPKKs的MAPKKKs目前確認(rèn)的有MEKKs、混合連接激酶、凋亡信號調(diào)節(jié)激酶和TGFβ激活的蛋白激酶等，而激活的JNK可調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子AP1蛋白，如cJun、JunB、JunD和ATF2，提高其轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而促發(fā)一系列生物學(xué)反應(yīng)。

JNK的主要表達(dá)部位在腎小球臟層上皮、近端和遠(yuǎn)端腎小管［5］。張梅等［6］研究表明，IgA腎病患者腎小管JNK的表達(dá)及活化均顯著增高，此增高與ɑSMA和FN的表達(dá)密切相關(guān)，提示JNK激活是調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和參與間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞內(nèi)信號。Sugiura等［7］研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ可通過JNK/SAPK信號通路誘導(dǎo)系膜細(xì)胞AP1活化、促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖，且JNK特異性抑制劑SP600125能部分抑制AngⅡ誘導(dǎo)的AP1活化及細(xì)胞增殖，表明AngⅡ→JNK/SAPK→cJun/AP1信號通路在系膜細(xì)胞增殖中發(fā)揮一定的作用。Hocevar等［8］在Mv1Lu細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ1誘導(dǎo)的纖維結(jié)合蛋白的生成有賴于JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和AP1的活性；同時(shí)，Jiang等［9］在用醛糖還原酶抑制劑預(yù)處理的腎小球系膜細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)JNK和P38的活性均被抑制，然而在經(jīng)醛糖還原酶轉(zhuǎn)染腎小球系膜細(xì)胞后，只有JNK的活性增強(qiáng)，提示AR可能是通過JNK/AP1信號通路來影響TGFβ1誘導(dǎo)的纖維連接蛋白和Ⅳ型膠原蛋白的合成。Bennett等［10］研究表明，JNK新奇的特異性抑制劑SP600125可抑制cJun的磷酸化及一些炎癥基因如IL2、INFγ、TNFα的表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)性腎炎大鼠腎組織中JNK和AP1活性顯著增強(qiáng)，腎組織中活化的AP1含有cFos和cJun，腎組織中活化的JNK和AP1與MCP1表達(dá)呈顯著正相關(guān)，提示JNKcJun/AP1信號通路參與了實(shí)驗(yàn)性腎炎腎組織中MCP1表達(dá)［11］，從而激活、趨化單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞浸潤腎小球。激活的JNK主要通過影響基因表達(dá)和線粒體的功能介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而誘導(dǎo)腎小球及腎間質(zhì)萎縮、凋亡，進(jìn)而引起腎進(jìn)行性損傷和腎臟纖維化［12］。TGFβ1是目前公認(rèn)的關(guān)鍵致纖維化因子，JNK可以通過其下游的AP1而啟動TGFβ1的基因轉(zhuǎn)錄，從而介導(dǎo)其發(fā)揮一系列的促纖維化作用而導(dǎo)致腎臟纖維化的形成。

以上研究表明，JNK確實(shí)參與了多種腎臟疾病腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展過程,是腎臟固有細(xì)胞重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。但是，JNK信號通路是否與LN腎纖維化有關(guān)，目前尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)我們通過構(gòu)建cGVHD狼瘡樣小鼠模型，從蛋白質(zhì)和mRNA兩個(gè)不同水平觀察了小鼠腎組織JNK的表達(dá)分布及表達(dá)量的變化。結(jié)果表明，JNK在正常小鼠的腎組織中有一定的基礎(chǔ)表達(dá)，但其活化形式pJNK僅有極少量表達(dá)，模型組JNK、pJNK蛋白和mRNA表達(dá)明顯增多，與正常對照組相比差異顯著，且隨著腎纖維化進(jìn)展，兩者增加更為明顯。這一結(jié)果提示，JNK在cGVHD狼瘡樣小鼠模型發(fā)病中可能起重要作用，其可能作用方式：促進(jìn)腎臟固有細(xì)胞轉(zhuǎn)分化；促使腎小球系膜細(xì)胞增殖；促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積；介導(dǎo)早期炎癥細(xì)胞趨化、黏附及炎癥介質(zhì)的分泌；調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡；介導(dǎo)TGFβ1的致纖維化作用，促進(jìn)腎小球硬化及間質(zhì)纖維化。

綜上所述，JNK可能在LN的發(fā)病以及病變的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，因此，抑制JNK的活化及分泌有望成為阻止和延緩LN腎纖維化的一條新的治療途徑。

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