抗老年性癡呆藥物篩選與評價

抗老年性癡呆藥物篩選與評價1第一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六老年性癡呆的介紹研究老年性癡呆常用的動物模型研究抗老年性癡呆藥物的主要方法主要內容2第二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六又稱阿爾茨海默?。ˋlzheimer‘sDisease，AD），是老年人最常見的一種病因不明的大腦退行性變性病，是引起癡呆最常見的病因?；颊叨喟l(fā)病于50歲前后，女性多于男性（約1.5～2:1）。早期最顯著的癥狀為健忘，通常表現(xiàn)為逐漸增加的短期記憶缺失，而長期記憶則相對不受病情的影響。隨著病情的加重，病人的語言能力、空間辨別能力、認知能力會逐步衰退，并會出現(xiàn)性格和行為的改變。在65歲以上的人群中，大約10%患有該病，全世界約有2400萬患者。目前沒有準確診斷和有效治療的方法。老年性癡呆3第三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六AloisAlzheimerAD的歷史AugusteDeter1906阿爾茨海默首次報告了一例具有進行性癡呆表現(xiàn)的51歲女性患者。當醫(yī)生給她看一個物體時，她最初能夠說出這個物體的正確名稱，重復幾次都是一樣，但是以后突然間，她把一切都忘掉了。當閱讀一本書時，她可能無緣無故地跳過一些句子，她也許會一個字母、一個字母地拼讀每一個字，也許會讀起來完全沒有抑揚頓挫。在書寫測驗時，她會反復書寫同一個音節(jié)，而完全忽略其他的音節(jié)，因而變得完全錯亂，六神無主。當她講話時，常常是使用雜亂無章的詞句，應用似是而非的表達方式。有時，在說話時會突然停下來，一言不發(fā)。不能理解向她提出的任何問題。找不到回自己住處的路。病情逐漸惡化，四年半后死亡?；颊咚篮蟛±頇z查顯示：大腦皮層萎縮，神經(jīng)原纖維纏結。其后，又有類似的病例報道。因其發(fā)病于老年前期，早期認為這是一種和老年性癡呆不同的疾病，于1910年把這種病命名為阿爾茨海默病。4第四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六AD的分類AD分為家族遺傳性（FamilialAlzheimer’sdisease,FAD)和散發(fā)性（SporadicAlzheimer’sdisease,SAD）FAD分為早發(fā)型（Earlyonset，多發(fā)病在40-60歲）和晚發(fā)型（LateonsetAD，LOAD多發(fā)病在65歲以上)APP：是第一個在早發(fā)家族性AD家系中被發(fā)現(xiàn)，定位于21q21.1-21.3，含19個外顯子，其中第16和17外顯子編碼的APP水解片段Aβ被證實為AD患者腦中SP的主要成分。PS1/2：PS1基因定位在14q24.3上，含467個氨基酸殘基；PS2定位在1q41.2上，含448個氨基酸殘基，PS1基因有100多個突變與常染色體顯性遺傳早發(fā)性AD有關，只有7個這樣的突變在PS2基因被發(fā)現(xiàn)。Tau：Tau蛋白基因位于17q21，包括16個外顯子。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)2、3、10外顯子間不同mRNA的剪接，表達6種Tau蛋白的同功異構體。ApoE：在第19對染色體上，ApoE基因的多態(tài)性與AD有著密切關系。在ApoE2,3,4等位基因中，ApoE4等位基因型是AD最主要的危險因素，主要與晚發(fā)型的散發(fā)性和晚發(fā)型家族性AD有關。5第五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六年齡是一個主要的危險因素

年齡患病率

65-74＝3％

75-84＝18.7%85+

＝47％年齡是AD發(fā)生的主要危險因素6第六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六From2000-2007,Alzheimer’sDiseaseDeathsIncreased50.6%while…Deathsby:HIV–declined22.0%Stroke–declined18.9%HeartDisease–declined13.3%ProstateCancer–declined6.4%BreastCancer–declined3.1%Alzheimer’sDiseaseHIVStrokeHeartDiseaseProstateCancerBreastCancerAD的發(fā)病率7第七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六階段智能測驗說明癥狀說明平均期間退化程度一（MMSE：29-30）正常-成人二（MMSE：29）正常年齡之健忘，與年齡有關之記憶障礙（忘記東西放置的地方及某些字，減少注意力）-成人三輕度神經(jīng)認知功能障礙（MMSE：25）降低從事復雜工作之能力及社會功能（例如：完成一件報告）-年輕之成人四輕度阿茲海默氏失智癥（MMSE：20）計算能力下降（100-7,40-4），無法從事復雜活動（個人理財、料理三餐、上市場），注意力、計算及記憶障礙（近期為主）2年8歲-青少年五中度阿茲海默氏失智癥（MMSE：14）計算能力明顯下降（20-2），失去選擇適當衣服及日?；顒又芰?，走路緩慢、退縮、容易流淚、妄想、躁動不安1.5年5-7歲六中重度阿茲海默氏失智癥（MMSE：5）無法念10-9-8-7……，需他人協(xié)助穿衣、洗澡及上廁所，大小便失禁，躁動不安，降低語言能力2.5年5-7歲七重度阿茲海默氏失智癥（MMSE：0）需依賴他人持續(xù)照顧，除叫喊外無語言能力、無法行走，行為問題減少，增加褥瘡、肺炎及四肢攣縮之可能性MMSE從23（輕度）→0約6年，每年約降3-4分，MMSE到0后可平均再活2-3年4周-15個月AD的臨床癥狀及分型8第八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六9第九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六Theself-portraitofWilliamUtermohlen10第十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六AD的腦改變海馬參與編碼短期記憶，AD首先破壞了海馬的神經(jīng)元以及海馬和大腦其他部分的連接通路。這種破壞導致了短期記憶的損傷。當大腦皮層受累后，語言能力和判斷能力就被削弱，人格也發(fā)生了改變，包括情緒的爆發(fā)以及煩躁的行為。最后全腦受累萎縮。11第十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六AD的腦改變AD大腦體積和重量都會縮小，大腦皮質變得空虛而滿是裂隙。12第十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六NeurofibrillaryTangleSenile

Plaque

AD特征性的病理改變

13第十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六(SelkoeDJ,PhysiologicalReviews2001)

AmyloidPrecursorProteinProcessingandAβgeneration

14Ab40FragmentSolubleAb42FragmentUnsoluble,aggregatesintoplaques第十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

NeurofibrillaryTanglesFormation

p35p25CDK5AktGSK-3α/βCalpain15第十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

NeurofibrillaryTanglesFormation

16第十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六A蛋白毒性學說Tau蛋白異常與神經(jīng)纖維纏結基因突變學說膽堿能系統(tǒng)異常氧化應激炎癥反應神經(jīng)遞質失調神經(jīng)元凋亡微量元素代謝紊亂膽固醇代謝異常AD的發(fā)病機制17第十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

CurrentTherapies

與神經(jīng)遞質有關的藥物

膽堿能藥物：膽堿酯酶抑制劑、M膽堿受體激動劑

非膽堿能藥物：單胺氧化酶抑制劑2.NMDA受體拮抗劑：美金剛抗氧化劑：VitE、CoQ10、EGb761非甾體類抗炎藥神經(jīng)營養(yǎng)因子：NGF、BDNF雌激素腦細胞代謝增強劑腦細胞代謝激活劑：腦復康、奧拉西坦腦血循環(huán)促進劑：都可喜、喜得鎮(zhèn)

鈣離子拮抗劑：尼莫地平、氟桂嗪8.針對A的治療BACE抑制劑、γ分泌酶抑制劑、防止Aβ形成寡聚體、增強Aβ從大腦中清除、金屬離子螯合劑、調整體內膽固醇平衡、A抗體等。以tau為靶點的治療

微管穩(wěn)定劑、GSK-3抑制劑、CDK-5抑制劑、tau抗體。18第十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

CurrentTherapies

藥品名類型及適應癥作用機理常見副作用推薦劑量美金剛Namenda?(memantine)NMDA拮抗劑，用于中到重度癡呆，可與AchE抑制劑合用保護神經(jīng)細胞免遭過量興奮性氨基酸的毒性作用頭暈、頭痛、便秘、意識模糊初始劑量：5mg/d,前3周應按每周遞增5mg劑量的方法逐漸達到維持劑量10mg,bid加蘭他敏Razadyne?(galantamine)AchE抑制劑,用于輕到中度AD可逆性AchE抑制劑，又是煙堿受體調節(jié)劑，具有雙重作用惡心、心動過速、失眠、體重下降，食欲差初始劑量：4mg,bid,每四周增量8mg,達維持劑量12mg,bid艾斯能Exelon?(rivastigmine)AchE抑制劑,用于輕到中度AD乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶抑制劑，具有雙重作用胃腸道癥狀及昏睡、疲勞初始劑量為1.5mgbid,每2周提高劑量3mg,漸達到維持量6mgbid安理申Aricept?(donepezil)AchE抑制劑,用于輕、中、重度ADAchE抑制劑惡心、嘔吐、腹瀉初始劑量為5mgqd,4周后加量至10mgqd維持19第十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六Aβ-BasedTherapeutics(BartenDM&AlbrightCF,MolNeurobiol2008)20第二十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六Tau-BasedTherapeutics(BartenDM&AlbrightCF,MolNeurobiol2008)21第二十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

CurrentAlzheimer'sdiseasedrugdevelopmentprograms

22第二十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

CurrentTherapies

23第二十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

研究老年性癡呆常用的動物模型24第二十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

AD動物模型一、以衰老為基礎的AD動物模型自然衰老認知障礙動物模型：

動物：大鼠、小鼠和猴子方法：采用6月齡Wistar大鼠，飼養(yǎng)12個月，成功建立自然衰老大鼠模型。特征：學習記憶和空間辨別能力缺損、神經(jīng)元凋亡、膽堿能功能受損、氧化損傷、tau蛋白異常磷酸化、BACE蛋白表達增加、線粒體功能受損(18月齡自然衰老大鼠）。25第二十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六一、以衰老為基礎的AD動物模型2.快速老化小鼠(senescenceacceleratedmouse，SAM)

由日本京都大學竹田俊男教授經(jīng)20年培育而成，具備均一的遺傳背景和穩(wěn)定老化病態(tài)特征。包括快速老化的P系(SAMP)和抗快速老化的R系(SAMR)兩大系，SAMR1常被用作正常對照。特征：青年期出現(xiàn)脫毛、活動低下、白內障、角膜混濁、骨質疏松等老化現(xiàn)象，而且壽命明顯縮短。中樞學習記憶功能呈增齡性加速衰退。線粒體功能紊亂和氧化應激損傷。腦內有大量Aβ沉積。

腦內與學習記憶功能相關的神經(jīng)遞質也發(fā)生改變。

AD動物模型SAMP1(lower)andSAMR1(upper)malesof12-month-old26第二十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

AD動物模型一、以衰老為基礎的AD動物模型3.D-半乳糖（D-gal)誘導的亞急性衰老模型D-半乳糖衰老動物模型是由國內學者龔國清等在1991年根據(jù)衰老的代謝紊亂學說而構建的。與其他幾種衰老動物模型如SAMP系小鼠衰老模型和自然衰老模型等相比，該模型簡便易行，價格低廉，結果穩(wěn)定，適用于抗氧化抗衰老藥物研究。方法：正常大鼠或小鼠，腹腔注射或頸背部皮下注射D-半乳糖50～500mg/kg，1次/天，連續(xù)6-8周，造成衰老模型。特征：動物出現(xiàn)明顯衰老體征，空間學習和記憶能力下降。

機體氧化自由基產(chǎn)物MDA與脂褐質增加，而抗氧化酶SOD活力顯著降低。神經(jīng)元變性凋亡增多。

視網(wǎng)膜色素上皮超微結構的改變。

免疫方面顯示IgG水平下降，T淋巴細胞轉化功能下降，血清γ干擾素下降。27第二十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

AD動物模型膽堿能系統(tǒng)的活性與人的學習記憶與認知活動過程密切相關。基底前腦膽堿能神經(jīng)元、海馬和皮層及它們之間的通路，是學習記憶功能的重要結構基礎。AD腦組織中發(fā)現(xiàn)的第一個神經(jīng)遞質異常是乙酰膽堿（Ach），合成和降解Ach的酶活性發(fā)生變化。AD患者基底前腦膽堿能神經(jīng)元大量損傷或死亡、突觸前Ach的合成、ChAT的活性以及對膽堿的攝取能力都明顯下降，這些變化的程度與患者認知功能損害的程度呈正相關。二、以膽堿能學說為基礎的AD動物模型28第二十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

AD動物模型二、以膽堿能學說為基礎的AD動物模型東莨菪堿誘導的AD模型作為M型膽堿能受體的拮抗劑，東莨菪堿(Scopolamine)可以通過血腦屏障進入中樞阻斷腦內的M受體，從而導致整個大腦的膽堿能神經(jīng)傳導障礙。方法簡單、重復性好，可用于藥物初篩。動物：大鼠、小鼠

方法：大鼠在實驗前30min按5mg/kg體重腹腔注射東莨菪堿。

小鼠在實驗前30min按1mg/kg體重腹腔注射東莨菪堿。

特征：短期的學習記憶障礙。

膽堿酯酶活性增高。SOD活力降低，MDA水平升高。29第二十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

AD動物模型二、以膽堿能學說為基礎的AD動物模型2.鵝膏氨酸誘導的AD模型（化學損傷）谷氨酸受體激動劑鵝膏草氨酸(Ibotenicacid，IBO)是一種神經(jīng)興奮毒性劑，動物腦內注射后可致腦基底核部位神經(jīng)元變性、壞死，并可導致大腦皮層和海馬等部位神經(jīng)元減少，引發(fā)動物行為遲鈍、學習及記憶能力下降等擬似癡呆癥狀。

另外，海仁酸(Kainicacid，KA)、使君子酸(Quisqualicacid，QA)、N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)等注入動物的基底大細胞核可建立AD模型。方法：SD大鼠，雄性，體重280-300g。在立體定位儀引導下將微量注射器的針頭插入顱骨下7.3mm。將1.0l的鵝膏氨酸（5g/l）在5min內緩慢注入前腦基底核，假手術組注射等體積的生理鹽水，留針5min后拔出。中線對側對稱部位同法同量注射后，縫合頭皮。手術后，模型組大鼠蘇醒時間顯著長于假手術組，造模死亡率為20%。特征：空間學習和記憶能力下降。CHAT陽性神經(jīng)元數(shù)目減少。

30第三十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

AD動物模型二、以膽堿能學說為基礎的AD動物模型3.選擇性免疫毒素192-IgG-saporin誘導的AD模型（免疫損毀）

192-IgG-saporin是一種抗神經(jīng)免疫毒素，一側側腦室注射192-IgG2-saporin后，它和細胞膜上P75受體結合進入細胞漿，192-IgG和saporin分離，saporin作用于核糖體，使核糖體大亞基失去活性，從而阻止了蛋白質的合成，導致細胞的死亡。將192-IgG-saporin注射到腦內，顯示基底前腦的膽堿能神經(jīng)元受到嚴重破壞，但該區(qū)域的其它神經(jīng)元則未受損害。方法：SD大鼠，雄性，體重280-300g。在立體定位儀引導下側腦室注射192-IgG-saporin溶液2.5μg/5μl，三周后進行行為學實驗。特征：空間學習和記憶能力下降。

新皮質、海馬及嗅球部位的ChAT陽性神經(jīng)元數(shù)目減少，而新紋狀體、中腦、脊髓等部位ChAT陽性神經(jīng)元的數(shù)量沒有變化。

31第三十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

AD動物模型二、以膽堿能學說為基礎的AD動物模型電損傷、外科損毀所致AD模型

通過對動物進行手術，參照動物腦立體定位圖譜，用電灼傷損毀基底前腦Meynert（NBM），外科手術切斷海馬穹窿傘。手術后動物出現(xiàn)了學習和記憶功能障礙，但病理上未出現(xiàn)SP和NFT，且這種方法損毀范圍較大，目前已基本不采用。

32第三十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

AD動物模型三、以A毒性為基礎的AD動物模型A注射所致的AD模型AD的基本病理改變是大腦皮層和海馬區(qū)域的Aβ淀粉樣斑塊。Aβ由39-43個氨基酸組成，具有神經(jīng)毒性作用，能引起大鼠空間學習和記憶障礙。方法：Aβ側腦室灌注、Aβ側腦室注射、Aβ海馬注射等。特征：學習記憶障礙。皮層和海馬ChAT的活性降低。損傷煙堿和KCl誘導的乙酰膽堿的釋放。腦內睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的水平降低。33第三十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六34第三十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

AD動物模型四、轉基因AD動物模型APP轉基因小鼠模型用實驗的方法將外源性APP基因(野生或突變型)導入，使其在染色體基因組中穩(wěn)定整合、表達，并遺傳給后代。動物過多地表達APP基因或其突變基因產(chǎn)物，引起Aβ的沉積和相關的病理損害或臨床癥狀。三種hAPP被應用于轉基因，分別由695、751和770個氨基酸殘基組成。最常使用的APP基因的突變根據(jù)它們被發(fā)現(xiàn)的地點命名為：Swedish(由兩個相鄰的突變組成：K670N&M671L)，London(V717I)和Indiana(V717F)。hAPP基因可以在不同的啟動子PDGF，Thy-1或Thy-1.2(神經(jīng)元特異性)和hamsterPrP(非神經(jīng)元特異)的控制下，使得hAPP基因可以僅在或主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達。（1）PDGF-APPLondon轉基因小鼠：PDGF-APPLondon轉基因小鼠在6~8月齡表現(xiàn)出胞外老年斑沉積、星形膠質細胞病變、神經(jīng)元萎縮和明顯的行為學異常，在斑塊形成之前其CAI區(qū)樹突棘密度大量減少，可以再現(xiàn)人類AD突觸損傷進程。（2）prp-APPK670N和M671L（Tg2576）：Tg2576轉基因在小鼠8~11月齡時，海馬區(qū)長時程增強效應以及皮質區(qū)突觸間連接均遭到破壞，從而導致記憶損傷。（3）Thy1.2-APPK670N和M671L（APP23）：APP23轉基因小鼠在6月齡左右就出現(xiàn)淀粉樣斑、淀粉樣血管病和記憶缺陷，同時CAI區(qū)出現(xiàn)約14%的神經(jīng)元丟失。（4）Thy1-APPSwDutIowa小鼠：Thy1-APPSwDutIowa小鼠在大腦表達Swedish突變K670N/M671L，荷蘭突變E693Q及愛荷華突變D694N的APP770基因。3月齡時小鼠腦內就出現(xiàn)進行性Aβ40和Aβ42的聚集。6月齡之后彌散型類淀粉樣斑塊在嗅球及丘腦區(qū)大量生成，同時出現(xiàn)小膠質細胞和星形膠質細胞增生。35第三十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

AD動物模型四、轉基因AD動物模型2.PS1-AD小鼠模型

PS1L286V轉基因小鼠：PS-1突變體具有增強凋亡的作用，加速了AD患者腦的退行性變性過程，PS-1突變家族性AD具有發(fā)病早的特點，而且突變型PS還抑制膽堿能神經(jīng)元神經(jīng)遞質的合成，提示具有調節(jié)神經(jīng)元表型的作用。PS1L286V轉基因小鼠過表達人類家族性AD相關的PS1突變基因（L286V），可以部分再現(xiàn)AD的表型。36第三十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

AD動物模型四、轉基因AD動物模型tau-AD轉基因小鼠模型（1）野生型tau轉基因鼠：表達人類最短tau蛋白基因轉錄的轉基因鼠表現(xiàn)出進行性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理改變，包括高度磷酸化的不溶性tau蛋白，皮質、腦干和脊髓區(qū)出現(xiàn)含tau蛋白陽性細絲、嗜銀神經(jīng)元內包涵體，星形膠質細胞增生，快速軸突運動受損，以及伴隨軸突變性出現(xiàn)的漸進性運動能力減弱等。（2）TauP301L突變轉基因鼠：表達P301L突變的tau蛋白轉基因鼠在4、5月齡出現(xiàn)運動和行為缺陷，在杏仁核、隔核、視前核、下丘腦、中腦、腦橋、延髓、小腦深部核團和脊髓出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結及類似于Pick體的神經(jīng)病變，在皮質、海馬和基底神經(jīng)節(jié)出現(xiàn)纏結前病變。脊髓前角運動神經(jīng)元數(shù)目減少約48%。（3）tauV377M突變轉基因鼠：tauV377M突變轉基因鼠神經(jīng)元體積變小和表面向外突起等形態(tài)改變。海馬神經(jīng)元活力降低，行為學異常。表現(xiàn)出與人類AD類似的神經(jīng)病理和行為特征。37第三十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

AD動物模型38第三十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

AD動物模型四、轉基因AD動物模型4.APP/PS-AD雙轉基因小鼠模型通過重組DNA技術將兩種外源性突變基因同時轉染小鼠，這兩種突變基因將整合人小鼠的基因組中，所得到的小鼠稱作雙轉基因小鼠。雙轉基因小鼠與單APP轉基因小鼠相比，加快了淀粉樣沉積的速度，最早形成老年斑的年齡顯著降低。（1）APPSWE×PS1M146L雙轉基因小鼠：3個月時，突觸可塑性的損害開始出現(xiàn)；6個月出現(xiàn)淀粉樣斑塊；8個月時出現(xiàn)選擇性空間記憶損害。22個月時，Aβ負荷大量增加。（2）APPSWE×PS1L166P雙轉基因小鼠：3個月時見腫脹的球莖狀異常軸突；腦淀粉樣變于6-8周在海馬開始出現(xiàn)，小膠質細胞的數(shù)量在1-8月增加了3倍，神經(jīng)元丟失很少。Aβ42比Aβ40多幾倍。8個月時神經(jīng)發(fā)生(neurogenesis)減少。（3）APPSL×PS1M146L雙轉基因小鼠：在兩個月可見細胞內Aβ堆積；3個月在皮質和海馬產(chǎn)生細胞內Aβ和細胞外Aβ聚集；17個月時發(fā)現(xiàn)大量海馬錐體細胞丟失；出現(xiàn)與年齡相關的腦萎縮，包括中腦和內囊，肼胝體和穹窿。（4）APPSL×PS1ki雙轉基因小鼠：病變嚴重且發(fā)展迅速，細胞外Aβ迅速沉積，在海馬CA1區(qū)出現(xiàn)年齡依賴性的大量神經(jīng)元丟失。10個月大時無論雄鼠還是雌鼠在CA1/2亞區(qū)都有廣泛的神經(jīng)元丟失，Aβ42是此模型產(chǎn)生的主要Aβ。（5）APPSWE×PS1dE9雙轉基因小鼠：2-3個月皮質和海馬發(fā)生膽堿能軸突腫脹，呈ChAT和AchE陽性反應；6個月開始在大腦皮質、海馬和杏仁體形成大量淀粉樣斑塊；15個月時，在杏仁體和海馬出現(xiàn)大量活化的星形膠質細胞；18個月時海馬5-HT和NE水平下降。39第三十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

AD動物模型四、轉基因AD動物模型APPSWE×PS1M146L×TauP301L-AD三轉基因小鼠模型神經(jīng)細胞內Aβ免疫反應性。細胞外出現(xiàn)Aβ沉積，主要集中在額葉皮層，到15月齡則在枕葉與頂葉出現(xiàn)了Aβ

沉積，這說明了3×Tg-AD小鼠Aβ沉積具有年齡相關性和區(qū)域依賴性。12月齡有明顯的tau蛋白異常磷酸化?；罨切湍z質細胞聚集在胞外Aβ沉積物周圍。海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元內Aβ免疫反應性與突觸可塑性的損傷有關聯(lián)，

包括LTP。突觸傳遞與LTP障礙早于

沉積物與NFT形成，提示突觸

功能障礙是AD早期表現(xiàn)。40第四十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

AD動物模型四、轉基因AD動物模型6.APP/PS五轉基因小鼠模型APP/PS1雙轉基因小鼠同時表達5種FAD突變APPK670N/M671L(Swedish)APPI716V(Florida)APPV7171(London)PS1M146LPS1L286V此型表現(xiàn)出Aβ42非?？焖俚某练e。在1.5個月可見細胞內Aβ42聚集，2個月開始出現(xiàn)淀粉樣沉積，大約4個月出現(xiàn)記憶損害，9個月時在大腦皮層(第V層)出現(xiàn)大量的大錐體神經(jīng)元丟失，與淀粉樣蛋白沉積出現(xiàn)的區(qū)域相同。41第四十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

AD動物模型四、轉基因AD動物模型ApoE基因敲除和轉基因小鼠模型

ApoE作為一種與血脂轉運有關的血漿蛋白，在外周和中樞神經(jīng)損傷的再生中起部分作用，可將脂類轉送到細胞內，參與神經(jīng)元軸突的伸展和生長。ApoE對調控大腦中Aβ的含量、沉積和分解起著至關重要的作用。ApoE敲除小鼠：表現(xiàn)出異常高血脂癥狀，在3月齡時即出現(xiàn)動脈脂肪堆積。隨著月齡增加出現(xiàn)大量類似動脈粥樣硬化前期損傷。17月齡時小鼠腦內出現(xiàn)脂瘤性纖維瘤，同時還有脂質小球和泡沫細胞?；蚯贸∈蟊憩F(xiàn)為突出損傷和學習記憶能力障礙。ApoE4轉基因鼠模型：學習記憶缺失，子代小鼠中存在大量SPs，膽堿乙酰轉移酶活性明顯降低。42第四十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

AD動物模型五、三氯化鋁致鼠癡呆模型鋁可進入腦內取代鈣和鎂離子，同氨基酸鏈上的谷氨酸或精氨酸的羧基結合形成谷氨鋁鹽或精氨酸鋁鹽的穩(wěn)定復合物而沉積于腦內，引起雙螺旋纖維蛋白異常磷酸化反應，形成神經(jīng)元纏結，引起Aβ的形成而產(chǎn)生老年斑，最終導致神經(jīng)元死亡。方法：1.小鼠腹腔注射法：小鼠，體重(30±4)g，12月齡，雄性。用AlCl3溶液100mg/kg腹腔注射，隔日一次，連續(xù)50d。2.小鼠灌胃給藥法：小鼠，體重(30±4)g，12月齡，雄性。每日上午以AlCl3溶液200mg/kg劑量灌胃給藥，共90d。3.大鼠頸背部皮下注射法：SD大鼠，體重(300-350)g，雄性。在大鼠頸背部皮下注射pH值為6.5的1.5%的AlCl3溶液60mL/kg，每日1次，連續(xù)20d。4.大鼠灌胃給藥法：Wistar大鼠，體重(200-220)g，雄性。按每天灌服AlCl3溶液500mg/kg，共30d。特征：空間學習和記憶能力下降。海馬及腦皮層M受體亞型的含量減少。小鼠部分腦區(qū)中的鐵及鐵蛋白的分布異常。

SOD、GSH-PX活性減少、MDA含量升高海馬內APP陽性神經(jīng)元的數(shù)量增多。神經(jīng)元凋亡率。43第四十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

AD動物模型六、岡田酸(okadaicacid，OA)慢性損害模型OA是一種磷酸酯酶抑制劑，能抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酯酶1A和2A的活性。正常胞內磷酸酯酶和磷酸激酶處在動態(tài)平衡之中，OA通過抑制磷酸酯酶的活性，使激酶處于相對高的活性狀態(tài)，從而能使tau蛋白高度磷酸化并形成NFT樣改變。方法：通過微滲透泵輸送OA到側腦室或海馬注射。特征：大鼠腦的紋狀體、海馬和皮質等部位出現(xiàn)高度磷酸化Tau蛋白免疫陽性神經(jīng)元、APP免疫陽性星形膠質細胞和Aβ免疫陽性斑塊，并伴有記憶損害。44第四十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

AD動物模型七、Wortmannin和GF-109203X聯(lián)用損害模型大鼠側腦室或雙側海馬注射wortmannin(磷脂酰肌醇3激酶抑制劑)和GF-109203X(蛋白激酶C抑制劑)。特征：1.大鼠出現(xiàn)明顯行為學障礙。

2.模型組大鼠海馬GSK-3酶活性增加到原來的3.7倍。

3.模型組大鼠Tau蛋白Ser198/Ser199/Ser202和Ser396/404位點磷酸化明顯增強，并出現(xiàn)NFT樣病理變化；而骨架蛋白Tau的這些特殊位點的磷酸化程度與動物的學習、記憶障礙正相關，即Tau蛋白過度磷酸化程度越高，大鼠學習記憶能力越差。該類模型可用于篩選針對蛋白激酶過度激活引發(fā)的Tau蛋白AD樣異常過度磷酸化、NFT樣病理變化及學習、記憶障礙的AD治療藥物，還可用于研究蛋白激酶和AD發(fā)病機制之間的內在關系。45第四十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

AD動物模型八、老年動物慢性腦缺血癡呆模型人腦的供氧系統(tǒng)對腦功能有重要的保護作用。缺氧缺血首先影響的是正常腦功能。此時極易出現(xiàn)智能障礙。通常老年動物腦血流較成年動物減少20%以上。

慢性缺血癡呆模型是通過結扎老年大鼠的雙側頸總動脈和一側椎動脈或者一側鎖骨下動脈，造成老年腦的長期供血不足和相應的腦損害，這些腦損害與AD的臨床表現(xiàn)和病理改變有一定相似性。特征：1.水迷宮測試顯示空間記憶能力明顯下降。2.神經(jīng)元丟失。3.膠質纖維酸性蛋白免疫反應增強。

該模型可用開發(fā)記憶障礙藥物的臨床前篩選，但該模型出現(xiàn)的神經(jīng)病理學改變廣泛，適用于研究混合型老年性癡呆的發(fā)病機制和有關藥物治療的研究。46第四十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

AD動物模型九、復合型AD動物模型Aβ與D-gal聯(lián)合誘導的AD模型。IBO與D-gal聯(lián)合誘導的AD模型。喹啉酸(QA)與D-gal聯(lián)合誘導的AD模型。QA是興奮性氨基酸受體激動劑，QA海馬內注射可破壞海馬膽堿能神經(jīng)元。氯化鋁(AlCl3)與D-gal聯(lián)合誘導的AD模型。亞硝酸鈉(NaNO2)與D-gal聯(lián)合誘導的AD模型。

由于NaNO2

會將正常血紅蛋白變?yōu)楦哞F血紅蛋白而失去攜氧能力，造成全身反復慢性缺氧，特別對腦的代謝有較大影響。東莨菪堿(SCOP)、AlCl3與D-gal聯(lián)合誘導的AD模型。IBO、Aβ1-40與D-gal聯(lián)合誘導的AD模型。IBO、醋酸氫化可的松龍與D-gal聯(lián)合誘導的AD模型。47第四十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

研究抗老年性癡呆藥物的主要方法行為學測定Ab途徑的測定Tau蛋白途徑的測定氧化損傷的檢測神經(jīng)炎癥反應的檢測神經(jīng)退行性改變測定神經(jīng)發(fā)生的檢測神經(jīng)遞質的改變的測定48第四十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六Morris水迷宮（Morriswatermaze，MWM）MWM實驗是一種強迫實驗動物（大鼠、小鼠）游泳，學習尋找隱藏在水中平臺的一種實驗，主要用于測試實驗動物對空間位置感和方向感（空間定位）的學習記憶能力。被廣泛應用于學習記憶、老年癡呆、海馬／外海馬研究、智力與衰老、新藥開發(fā)／篩選／評價、藥理學、毒理學、預防醫(yī)學、神經(jīng)生物學、動物心理學及行為生物學等多個學科的科學研究和計算機輔助教學等領域，在世界上已經(jīng)得到廣泛地認可，是學習與記憶研究的首選經(jīng)典實驗。實驗原理：

雖然老鼠是天生的游泳健將，但是它們卻厭惡處于水中的狀態(tài)，同時游泳對于老鼠來說是十分消耗體力的活動，他們會本能的尋找水中的休息場所。尋找休息場所的行為涉及到一個復雜的記憶過程，包括收集與空間定位有關的視覺信息，再對這些信息進行處理、整理、記憶、加固、然后再取出，目的是能成功的航行并且找到隱藏在水中的站臺，最終從水中逃脫。

行為學實驗49第四十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六50第五十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六51第五十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六2.八臂輻射狀迷宮（RadialArmMaze）實驗原理：利用食物作為激勵措施使饑餓的動物到達目的地。小鼠若想利用最短的時間或最小的錯誤來尋求獎賞，它必須利用空間線索來實行特別的搜索策略。在實驗中，動物需要記住那些臂已被探索過，食物已被攝取，以免再次進入，從而在最短的時間內獲得最多的食物。動物適應實驗環(huán)境1周后，稱重，禁食24小時。此后每天訓練結束后限制性地給予正常食料（據(jù)體重不同，大鼠16-20g，小鼠2-3g），以使體重保持在正常進食大鼠的80%-85%。

行為學實驗52第五十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六3.T迷宮（Tmaze）實驗原理：利用食物作為激勵措施使饑餓的動物到達目的地。Ｔ迷宮是檢測嚙齒類動物空間工作記憶的一種經(jīng)典行為學方法，與前額葉皮層功能相關。小鼠節(jié)食至原體重85％。實驗設備：迷宮由兩個目標臂（goalarms）和一個與之垂直的主干臂（stem）或起始臂（approachalley）組成。飲水不限，但進食控制在每天16-20g，以使體重保持在非進食大鼠體重的85%。在整個訓練和測試期間，大鼠體重每周增加不超過5g。實驗方法1.訓練前2d，小鼠放入T迷宮適應10min，在迷宮兩臂碗里放入食物，待小鼠取食完畢后將其取出。2.訓練實驗：每一個trial包括兩個部分，即forcedrun和testrun。forcedrun：任意選擇T迷宮的一臂，用木閘門將之關閉，小鼠只能進入一臂獲取食物。取食完畢，立即取出，用酒精清洗去除氣味。15s后，撤去所有的閘門。Testrun：兩臂全部打開，將小鼠放入開始臂中，若小鼠選擇未曾進入的臂，為正確選擇，給予食物獎勵；若重復進入相同的臂，則為錯誤選擇，不給予食物。每只動物每天進行4個trial，每次間隔15min，連續(xù)4d，分別計算每天每組小鼠的正確率。當平均正確率都達到85％以上，訓練階段結束。3.測試實驗：延長forcedrun和testrun之間的時間間隔至1min和3min，分別計算每組小鼠的正確率。

行為學實驗53第五十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六4.Y迷宮（Ymaze）Y迷宮能夠檢測嚙齒類動物與海馬和前額葉腦區(qū)相關的空間記憶。實驗裝置：

環(huán)境為安靜暗室。Y-迷宮為一個三等臂式反射箱，三臂的夾角為120°，底部為可通電的銅棒，每臂端有一信號燈，燈亮表示安全區(qū)，此臂不通電無電流，另兩臂通電(電壓50

~

70

V，大致固定在能使小鼠產(chǎn)生逃避行為的強度)。實驗開始時，讓大鼠在起步區(qū)(大鼠開始所在的臂)適應5min，然后無規(guī)則次序變換安全區(qū)，觀察動物學會逃離電擊區(qū)而進人安全區(qū)的反應能力。規(guī)定大鼠在受電擊后10s內一次性跑向安全區(qū)為正確反應。實驗中每次通電刺激的間隔時間為30s。以大鼠連續(xù)訓練10次中出現(xiàn)9次以上正確反應作為學會的標準，以達到學會標準所需總電擊次數(shù)表示學習成績。2

4

h

后進行記憶保持能力的檢測，以正確反應次數(shù)占總檢測次數(shù)的百分比表示記憶保持能力(正確反應的次數(shù)/總檢測次數(shù)×100%)，此值越高說明記憶力越好。

行為學實驗54第五十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六5.避暗實驗（passiveavoidance）

實驗原理：避暗又稱為被動回避利用小鼠或大鼠具有趨暗避明的習性設計的裝置，一半是暗室，一半是明室，中間有一小洞相連。暗室底部鋪有通電的銅柵。動物進入暗室即受到電擊。本實驗簡單易行，反應箱越多，同時訓練的動物越多。以潛伏期為指標，動物的差異性比較小。對記憶過程特別是記憶再現(xiàn)有較高的敏感度。實驗方法：（1）將小鼠放入明箱，10s后，將明暗箱之間的門打開。多數(shù)品系的小鼠有很強的探究行為，喜暗惡光。因此，小鼠會很快進入暗箱。（2）小鼠（四肢）完全進入暗箱后，立即將中門關上，并給予一次電擊。電擊強度為能引起小鼠退縮和發(fā)聲的最小電流。根據(jù)小鼠品系不同，電流范圍為0.2~0.8mA(100V，50~60HzAC)，持續(xù)1~2s。（3）讓小鼠在暗箱內停留10s（以使讓動物形成箱與電擊之間的關聯(lián)），將小鼠放回籠內。清潔操作箱。進行下一只動物的訓練。

（4）記憶保持測試

電刺激訓練24h后，將小鼠放回明箱，中門打開，但不給電擊，。

觀察指標：潛伏期、錯誤次數(shù)

行為學實驗55第五十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

行為學實驗5.避暗實驗56第五十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六6.跳臺實驗實驗原理：跳臺實驗屬一次性刺激回避反應實驗。跳臺法的實驗裝置一般為一長方形反射箱，其長徑被黑色塑料板隔為若干區(qū)間，底部鋪以間距為5mm的銅柵，可通適當?shù)碾娏鳌Ｃ總€小的區(qū)間有一個高和直徑均為4.5cm的小平臺。實驗方法：實驗時，首先將小鼠放在銅柵上，當銅柵通電時，跳在銅柵上的小鼠受到電擊，其正常反應是躲避電擊跳上平臺，大多鼠有可能再次或多次跳下平臺受到電擊，受到電擊時又會迅速跳回平臺。如此訓練5min，并記錄每只鼠受到電擊的次數(shù)（錯誤次數(shù)），以此為學習成績。24h后重新測驗，此次測驗時，首先將鼠放在跳臺上，記錄第一次跳下的時間（潛伏期）、受電擊的動物數(shù)和3min內的錯誤次數(shù)，以此反映記憶保持情況。測定指標：潛伏期、錯誤次數(shù)

行為學實驗57第五十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六7.條件性恐懼實驗（ContextualFearConditioning）實驗原理：動物遭受痛苦刺激如電擊后，可記住受苦時的環(huán)境和場景如伴隨的聲、光等。當再次遭遇原環(huán)境或場景后就會表現(xiàn)出恐懼反應。嚙齒類動物在恐懼時會表現(xiàn)出特有的不動狀態(tài)（Freezing），動物在這種情況下傾向于保持靜止不動的防御姿勢。實驗方法：實驗對象被給與一個聲音信號（條件刺激），隨后給予電擊（非條件）刺激。該訓練稱為條件性訓練，訓練結束后實驗動物進行聲音信號或環(huán)境聯(lián)系性實驗。一般情況下嚙齒類動物對相應的環(huán)境和不同環(huán)境下同樣的聲音信號都會做出明顯的條件性恐懼反應，如靜止不動。這種測試可以在訓練結束后立刻或幾天后進行可以提供在條件信號影響下短期和長期記憶的信息。測定指標：動物靜止不動的時間(freezingtime)，并計算靜止不動的時間占總時間的百分比(percentoffreezingtime)

行為學實驗58第五十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六8.物體識別實驗（objectrecognitiontest）原理：小鼠有探索新物體的習性。當能區(qū)分出熟悉的物體和新物體時，它總是要花較長的時間探索新物體。該實驗可測定視覺認知記憶，是海馬依賴性認知實驗。

行為學實驗5924h實驗準備及認知訓練：1.實驗裝置為一正方形白色塑膠材料制作的暢箱。2.實驗動物在訓練前必須在前一日適應環(huán)境5min。3.兩相同物體為正方形藍色積木。4.實驗時放置動物到兩物體正中間位置，計時5min。5.記錄動物對兩物體的探索時間。認知測試：1.其中一物體更換為新物體。2.記錄5min內動物對新舊物體的認知時間。Therecognitionindex（認知指數(shù)）:Tn/(Tn+Tf).Tn=對新物體認知時間；Tf=對舊物體認知時間探索：指小鼠鼻子在2cm內指向物體或鼻子觸及物體。59第五十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六9.其他實驗：Barnes（巴恩斯）型迷宮6或8臂輻射狀水迷宮實驗LashleyIII水迷宮H-W水迷宮嗅覺辨別

行為學實驗60第六十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

APP及Ab相關的檢測指標Ab的生化測定：樣品：血漿、腦組織（皮層、海馬、小腦）方法：ELISA

61第六十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

APP及Ab相關的檢測指標Ab的特殊染色：HE、ThioflavinS、Bielschowskysilverstain、Congored

Amyloidinfiltratesthewallofthissmallvessel(H&E).Typicalplaquewithamyloidcoreanddystrophicneurites（Thioflavinstain）

SilverstainCongoredstainluminescentconjugatedpolymer(LCP)PTAA62第六十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

APP及Ab相關的檢測指標3.Ab的免疫組化染色常用的抗體：6E10、4G8、Anti-Abeta1-40/42等公司：Covance、ELANpharmaceuticals、EMDMillipore、LifeTechnologiesCorporation、Karen等。

63第六十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

APP及Ab相關的檢測指標APP加工過程及信號調節(jié)通路

方法：Westernblot或直接測定酶活性指標：APP、αAPPs、CTFs、ADAM10、ADAM17、BACE、IDE、NEP、PKC、MAPKMAPK64第六十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

tau磷酸化及NFT檢測1.NFT特殊染色Silverstain、ThioflavinSTanglesasdrawnbyBonfiglioin1908withsilverstain.TanglesasseenwithThioflavinS.65第六十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

tau磷酸化及NFT檢測2.Tau和NFT的蛋白表達方法：WesternblotTau5-totaltau;CP27-totalhumantauAT180,CP9,andCP17-pThr231-tau;AT8-pSer202/pThr205-tauAT100-pThr212-tauintheNFT-specificconformationMC1-tauintheearlyNFTconformationPHF-1-tauinthelateNFTconformationpolyclonalP-tau(ser199)antibody;polyclonalP-tau(Thr205)antibodypolyclonalP-tau(ser396)antibody;polyclonalP-tau(ser404)antibody66第六十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

tau磷酸化及NFT檢測3.Tau和NFT的染色方法：IHC，IFFluorescentdoublelabelingof3xTg-ADmice.IntraneuronalAβ(green)colocalizeswithΔTau(red)withinCA1pyramidalneuronsof12-month-old(A)and18-month-old(B)3xTg-ADmiceandwithin18-month-oldneocortex(C).ΔTauimmunoreactivity(red)alsocolocalizeswithanearlytanglemarker,MC1(green),withinCA1pyramidalneuronsatboth12-month(D)and18-monthtimepoints(EandF).Phospho-tauimmunoreactivityfromtheCA1hippocampalsectorof18-month-oldtransgenicmice.ImmunohistochemistryperformedwithT-14(A–C),12E8(D–F),AT-180(G),AT-8(H)andPHF-1(I).67第六十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

tau磷酸化及NFT檢測4.Tau蛋白磷酸化激酶的檢測方法：Westernblot和酶活性測定ImmunofluorescencestainingofGSK-3β(Ser9)(green)68第六十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

氧化損傷的檢測檢測指標：活性氧自由基（ROS）、超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、總-SOD）、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽-過氧化物酶（GSH-PX）、黃嘌呤氧化酶（XOD）、髓過氧化物酶（MPO）、過氧化物酶(POD)、一氧化氮合成酶（NOS）、丙二醛（MDA）、

4-羥基壬烯醛（HNE）、還原型谷胱甘肽（GSH）、超氧陰離子自由基、一氧化氮（NO）方法：生化測定公司：南京建成生物工程研究所69第六十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

神經(jīng)炎癥反應的檢測70第七十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期六

神經(jīng)炎癥反應的檢測小膠質細胞活化

方法：IHC、IF、Westernblot常用抗體：CD45、CD11b、CD40、Iba-1、F4/80、CD68、MHC-II、ED1、Mac-1等。Microglia(Iba-1,brown)accumulatearoundAβplaques(Congored,red)intransgenicmousemodelsofAD.

Double-labelingimmunofluorescenceanalysesofAβdepositandmicroglia