緒論酶分離純化

緒論酶分離純化演示文稿當(dāng)前第1頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)（優(yōu)選）緒論酶分離純化當(dāng)前第2頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)酶的提取與分離純化將酶從細(xì)胞或發(fā)酵液中取出，再與雜質(zhì)分開，獲得所需的酶產(chǎn)品。酶的分離純化工作,是酶學(xué)研究的基礎(chǔ).酶的純化過程就目前而言,還是門實(shí)驗(yàn)科學(xué).當(dāng)前第3頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)酶的純化過程與一般蛋白純化過程相比有本身獨(dú)有的特點(diǎn):一是特定的一種酶在細(xì)胞中含量很少;二是酶可通過測定活力的方法加以跟蹤.1、建立一個可靠和快速的測活方法；2、酶原料的選擇；3、酶的提?。?、酶的提純；5、酶的純度檢驗(yàn)。酶分離純化的一般原則:當(dāng)前第4頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)一細(xì)胞破碎（link)二酶的提取(link)三離心分離(link)四過濾與膜分離(link)

五沉淀分離(link)六層析分離七電泳分離八萃取分離九酶的結(jié)晶十濃縮與干燥主要內(nèi)容go當(dāng)前第5頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)一細(xì)胞破碎大多數(shù)酶存在于細(xì)胞內(nèi)，需破碎后才能提純細(xì)胞不同，結(jié)構(gòu)不同，所用的破碎方法和條件有所不同細(xì)胞的破碎方法：（一）機(jī)械破碎法link（二）物理破碎法link（三）化學(xué)破碎法link（四）酶學(xué)破碎法link

back當(dāng)前第6頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)原理：機(jī)械運(yùn)動所產(chǎn)生的剪力作用于細(xì)胞1機(jī)械搗碎法：搗碎機(jī)，10000rpm，實(shí)驗(yàn)、生產(chǎn)規(guī)模均可2研磨法：研缽、石磨、球磨、細(xì)菌磨等研磨器械，效率較低3勻漿法：勻漿器，用于顆粒細(xì)小的組織細(xì)胞破碎程度高。對酶破碎少，難于工業(yè)化。Back（一）機(jī)械破碎法當(dāng)前第7頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)包括:1、溫度差破碎法;2、壓力差破碎法;3、超聲波破碎法;（二）物理破碎法通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用使組織細(xì)胞破碎當(dāng)前第8頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)1、溫度差破碎法冷凍高溫，用于脆弱易破菌，難以工業(yè)化;于冷藏庫或干冰反復(fù)于零下15～20℃使之凍固，然后緩慢地融解，如此反復(fù)操作，使大部分細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)顆粒破壞。由于滲透壓的變化，使結(jié)合水凍結(jié)產(chǎn)生組織的變性，冰片將細(xì)胞膜破碎，使蛋白質(zhì)可溶化，成為粘稠的濃溶液，但脂蛋白凍結(jié)變性。

或:將材料投入沸水中，于90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分細(xì)胞被破壞。

當(dāng)前第9頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)2、壓力差破碎法高壓沖擊法用活塞或沖擊錘加高壓沖擊菌體細(xì)胞和冰晶石英沙等混合物。突然降壓法加壓至30MP以上，打開出口閥突然降為常壓爆破性減壓法用氮?dú)饣蚨趸汲鋲褐翈资翈装俅髿鈮?。滲透壓差法利用滲透壓的變化而使細(xì)胞破碎，常用于從海洋微生物中提取某些酶。當(dāng)前第10頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)頻率10~20KHz，功率100~150W，溫度0~10oC，pH4~7，時間3~10min，間隔多次;對數(shù)生長期細(xì)胞，細(xì)胞濃度和溶液粘度不宜太高。暴露于9～10kHz聲波或10～500kHz超聲波所產(chǎn)生的機(jī)械振動，只要有設(shè)備該法方便.且效果也好，但一次處理量較小;應(yīng)用超聲波處理時應(yīng)注意避免溶液中氣泡的存在;處理一些超聲波敏感的蛋白質(zhì)酶時宜慎重。3、超聲波破碎法在超聲波的作用下，細(xì)胞膜由于空穴作用而破碎。破壞程度與輸出功率、破碎時間密切相關(guān)，與頻率關(guān)系不大。操作條件Back當(dāng)前第11頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)（三）化學(xué)破碎法應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)改變或破壞。有機(jī)溶劑（如甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）可使細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細(xì)胞膜的透過性，再經(jīng)提取可使膜結(jié)合酶或胞內(nèi)酶等釋出胞外。

1、有機(jī)溶液處理粉碎后的新鮮材料在0℃以下加入5～10倍量的丙酮，迅速攪拌均勻，可破碎細(xì)胞膜，破壞蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合。蛋白質(zhì)一般不變性，被脫脂和脫水成為干燥粉末。用少量乙醚洗，經(jīng)濾紙干燥，如脫氫酶等可保存數(shù)月不失去活性。操作當(dāng)前第12頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)表面活性劑和細(xì)胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，增加膜的透過性。離子型表面活性劑會使酶的結(jié)構(gòu)破壞，不用之。常用的非離子型表面活性劑為：Triton和Tween。用凝膠層析等方法除去表面活性劑，以便酶的進(jìn)一步純化。對膜結(jié)合酶的提取特別有效。2、表面活性劑處理Back當(dāng)前第13頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)（四）酶學(xué)破碎法在一定條件下，通過外加的酶或細(xì)胞本身存在的酶的作用，使細(xì)胞破碎。簡單原理:用胰蛋白酶等蛋白酶除去變性蛋白質(zhì)。溶菌酶處理時，它能水解構(gòu)成枯草菌等菌體膜的多糖類。能溶解菌的酶分布很廣。尤其卵白中含量高，而多易結(jié)晶化。1、外加酶處理當(dāng)前第14頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)1g菌體加1～10mg溶菌酶，pH6.2～7.01h內(nèi)完全溶菌。于生理食鹽水或0.2mol蔗糖溶液中溶菌，雖失去細(xì)胞膜，但原形質(zhì)沒有脫出。蝸牛酶及纖維素酶也常被選為破壞細(xì)菌及植物細(xì)胞用。革蘭氏陽性菌：細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形狀依賴于壁上的肽多糖，溶菌酶能專一性作用于肽多糖的β-1，4-糖苷鍵。革蘭氏陰性菌：除了溶菌酶外，另加EDTA才有效。酵母：其細(xì)胞壁的主要成分是β-1，3-葡聚糖，需加β-葡聚糖酶；霉菌：其細(xì)胞壁含有幾丁質(zhì)，可用幾丁質(zhì)酶；植物細(xì)胞：纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶。當(dāng)前第15頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)將待破碎的鮮材料在一定pH和適當(dāng)?shù)臏囟认?，利用自身的蛋白酶將?xì)胞破壞，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。比較穩(wěn)定，變性較難，蛋白質(zhì)不被分解而可溶化。利用該法可從胰臟制取羧肽酶。自體融解時需要時間，需加少量甲苯、氯仿等。應(yīng)防止細(xì)菌污染。于溫室30℃左右較早溶化。自體融解過程中PH顯著變化，隨時要調(diào)節(jié)pH。自溶溫度選在0～4℃，因自溶時間較長，不易控制，所以制備活性蛋白質(zhì)時較少用。適宜的自溶條件：溫度、pH值、離子強(qiáng)度等加入噬菌體感染細(xì)胞電離輻謝2、自溶法Back當(dāng)前第16頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)二酶的提取是指在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈希姑赋浞秩芙獾饺軇┲械倪^程。也稱酶的抽提。大部分蛋白質(zhì)均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中。因此蛋白質(zhì)的提取一般以水為主。稀鹽溶液和緩沖溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶度大，也是提取蛋白質(zhì)的最常用溶劑。

當(dāng)前第17頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)鹽溶現(xiàn)象:在一定濃度的鹽存在下,酶的溶解度增加.鹽析現(xiàn)象:當(dāng)鹽的濃度太高,蛋白的濃度反而下降,從溶液中析出.一般采用稀鹽溶液，0.02~0.05mol/L。

等滲鹽溶液尤以0.02～0.05mol/L磷酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液常用。0.15mol/L氯化鈉溶液應(yīng)用也較多。如6-磷酸葡萄糖脫氫酶用0.1mol/L碳酸氫鈉液提取等。酶提取的主要方法1、鹽溶液提取當(dāng)前第18頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)有時為了螯合某些金屬離子和解離酶分子與其他雜質(zhì)的靜電結(jié)合，也常使用焦磷酸鈉緩沖液等。有些蛋白質(zhì)在低鹽濃度下濃度低，如脫氧核糖核蛋白質(zhì)需用1mol/L以上氯化鈉液提取。總之，只要能溶解在水溶液中而與細(xì)胞顆粒結(jié)合不太緊密的蛋白質(zhì)和酶，細(xì)胞破碎后選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度及pH，一般是不難提取的。只有某些與細(xì)胞顆粒上的脂類物質(zhì)結(jié)合較緊的，需采用有機(jī)溶劑或加入表面活性劑處理等方法提取。當(dāng)前第19頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)蛋白質(zhì)提取液的pH值首先應(yīng)保證在蛋白質(zhì)穩(wěn)定的范圍內(nèi)，即選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)。如堿性蛋白質(zhì)則選在偏酸一側(cè)，酸性蛋白質(zhì)選擇偏堿一側(cè)，以增大蛋白質(zhì)的溶解度，提高提取效果。酸性條件下溶解度較大，且穩(wěn)定性較好，宜用酸溶液提取。

2、酸溶液提取、堿溶液提取原則：當(dāng)前第20頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)如細(xì)胞色素C屬堿性蛋白質(zhì)，常用稀酸提?。患∪飧视腿?3-磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質(zhì)，用稀堿提取；某些蛋白質(zhì)或酶與其分物質(zhì)結(jié)合常以離子鍵形式存在，選擇pH3～6范圍對于分離提取是有利的。當(dāng)前第21頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)與脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中含非極性基團(tuán)較多的酶需用有機(jī)溶劑提取。有機(jī)溶劑提取用于提取蛋白質(zhì)的實(shí)例至今是不多的。一些和脂結(jié)合較牢或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)，不溶于水、稀鹽或稀堿液中，可用不同比例的有機(jī)溶劑提取。例:從一些粒線體（Mitochondria)及微粒體（Microsome)等含多量脂質(zhì)物質(zhì)中提取蛋白質(zhì)時，采用Morton的丁醇法效果較好。因丁醇使蛋白質(zhì)的變性較少，親脂性強(qiáng)，易透入細(xì)胞內(nèi)部，與水也能溶解10%，因此具有脂質(zhì)與水之間的表面活性作用，可占據(jù)蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合點(diǎn)，也阻礙蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的再結(jié)合，使蛋白質(zhì)在水中溶解能力大大增加。3、有機(jī)溶劑提取當(dāng)前第22頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣（pH3～10，溫度-2℃至40℃）。國內(nèi)用該法曾成功地提取了琥珀酸脫氫酶。用之提取堿性磷酸脂酶效果也是十分顯著的。胰島素既能溶于稀酸、稀堿又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中。以60—70%的酸性乙醇提取效果最好，一方面可抑制蛋白質(zhì)水解酶對胰島素的破壞，同時也達(dá)到大量除去雜蛋白的目的。當(dāng)前第23頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)影響酶提取的主要因素1、溫度為了防止酶變性失活，溫度不宜高；多數(shù)酶的提取溫度在5℃以下；耐溫較高的酶可適當(dāng)提高溫度，以提高酶溶解度和擴(kuò)散速率。少數(shù)對溫度耐受性較高的蛋白質(zhì)和酶，可適當(dāng)提高溫度，使雜蛋白變性分離且也有利于提取和進(jìn)一步純化。如胃蛋白酶等及許多多肽激素類，選擇37～50℃條件下提取，效果比低溫提取更好。當(dāng)前第24頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)2、pH值為了防止酶的變性，pH不宜過高或過低；溶液的pH值應(yīng)遠(yuǎn)離酶的等電點(diǎn)，以增加酶的溶解度。3、提取液的體積提取液的用量增加，可提高提取率；過量，酶濃度降低，不利進(jìn)一步純化。back當(dāng)前第25頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)三離心分離離心：借助離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、密度的物質(zhì)分離的技術(shù)；要根據(jù)欲分離物質(zhì)及雜質(zhì)的大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件。當(dāng)前第26頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)1、常速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速8000rpm。2、高速（冷凍）離心機(jī)1×104-2.5×104rpm3、超速離心機(jī)轉(zhuǎn)速：2.5-8×104rpm，分制備用、分析用、制備及分析用三種。分析用超速離心機(jī)裝有光學(xué)檢測系統(tǒng)、自動記錄系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；離心機(jī)的種類與用途當(dāng)前第27頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)臺式高、超速離心機(jī)0.6-10萬轉(zhuǎn)/分以上離心機(jī)制備性分析性分析性超速離心機(jī)普通離心機(jī)冰凍離心機(jī)臺式（或地面式）普通離心機(jī)大容量冰凍離心機(jī)小于0.6萬轉(zhuǎn)/分高速冰凍離心機(jī)0.6-2.5萬超速冰凍離心機(jī)2.5-8萬或更高(分析性超速離心主要用于檢測大分子物質(zhì)的沉降特征和結(jié)構(gòu)等)概述當(dāng)前第28頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)當(dāng)前第29頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)當(dāng)前第30頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)當(dāng)前第31頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)當(dāng)前第32頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)對常速、高速離心,由于所分離的顆粒大小和密度相差較大,較易達(dá)到效果,應(yīng)用以上離心設(shè)備;若從樣品液中分離2種以上大不密度不同的顆粒,則應(yīng)用以下包括差速離心在內(nèi)的制備性超離心技術(shù);離心方法的選用當(dāng)前第33頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)一般為4oC。穩(wěn)定性好的酶，可取室溫；超高速離心需冷凍。pH值應(yīng)處于酶穩(wěn)定的pH范圍。溫度和pH值back當(dāng)前第34頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)四過濾與膜分離過濾

借助過濾介質(zhì)將大小不同，形狀不同的物質(zhì)分離的技術(shù)介質(zhì)有濾紙、纖維、陶瓷、高分子膜等。以膜為過濾介質(zhì)的過濾稱膜分離技術(shù)；微濾、超濾、反滲透、透析、電滲析都屬于膜分離技術(shù)當(dāng)前第35頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)表1-2過濾的分類與特性（P16）類別

截留的顆粒大小主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾>2um酵母、霉菌、動植物細(xì)胞、固形物濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷微濾0.2~2um細(xì)菌、灰塵微濾膜超濾20A~0.2um病毒、生物大分子超濾膜反滲透<20A生物小分子、鹽、離子反滲透膜當(dāng)前第36頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)表例：當(dāng)前第37頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)一、非膜過濾截留顆粒直徑大于2μm,用于分離酵母、霉菌、動植物細(xì)胞、培養(yǎng)基殘?jiān)取＿^濾介質(zhì)有濾紙、濾布、多孔陶瓷等。(1)常壓過濾以液位差為推動力，易操作，分離效果差，難成規(guī)模。(2)加壓過濾以壓力泵或壓縮空氣為推動力。效果較好，生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛。(3)減壓過濾真空過濾、抽濾。多用于粘性不大的物料。1、粗濾2、微濾微孔過濾,截留顆粒直徑0.2～2μm，光學(xué)顯微鏡可見顆粒，采用微孔陶瓷、微濾膜等。當(dāng)前第38頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)二、膜分離技術(shù)借助于一定孔徑的各種高分子薄膜，將不同大小、不同性狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿臃蛛x的技術(shù)。薄膜有丙烯腈、醋酸纖維素、硝酸纖維素、賽璐玢及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。當(dāng)前第39頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)

膜過程國家年代應(yīng)用

微濾*德國1920年實(shí)驗(yàn)室用（細(xì)菌過濾器）

超濾*德國1930年實(shí)驗(yàn)室用

血液透析*荷蘭1950年人工腎

電滲析#美國1955年脫鹽

反滲透#美國1960年海水脫鹽

超濾#美國1960年大分子物質(zhì)濃縮

氣體分離#美國1979年氫回收

膜蒸餾*德國1981年水溶液濃縮

全蒸發(fā)#德國/荷蘭1982年有機(jī)溶液脫水膜分離技術(shù)發(fā)展階段*:小規(guī)模；#：工業(yè)規(guī)模當(dāng)前第40頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)以薄膜兩邊的流體靜壓差為推動力；根據(jù)截留的顆粒大小可分為3種；MEF微濾器根據(jù)顆粒或分子通過薄膜的原理和推動力不同分三類。（1）微濾截留的物質(zhì)顆粒直徑為0.2～2um，操作壓力0.1MPa以下。1、加壓膜分離當(dāng)前第41頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)(2)超濾截留的物質(zhì)顆粒直徑為20～2000?（0.2um）；可同時截留菌絲體和可溶性蛋白。

操作壓力50～700KPa；特別適于液體酶制劑的生產(chǎn)；對需要輔酶的酶的生產(chǎn)不適用；SHM系列膜分離裝置【截留分子量】：300～50000道爾頓；

【操作壓力】：0.1～0。2Mpa

【操作溫度】：20～50℃。在發(fā)酵行業(yè)中，由于傳統(tǒng)分離工藝技術(shù)條件的限制，預(yù)處理中常有5-15%的產(chǎn)品損失，大量的可溶性蛋白、大分子雜質(zhì)被帶入到下游工序，增加了后提取工藝的環(huán)節(jié)和負(fù)荷，影響產(chǎn)品質(zhì)量及生產(chǎn)收率。Ultra-flo超濾分離技術(shù)徹底突破這一技術(shù)瓶頸。當(dāng)前第42頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)超濾(續(xù))超乎尋常的膜通量，且維持恒定適合處理高粘度、高含固量料液濃縮倍數(shù)極高，可使?jié)饪s液呈糊狀消除濃差極化，不易堵塞，易清洗系統(tǒng)可逐級拓展，中試結(jié)果完全適用于生產(chǎn)規(guī)模當(dāng)前第43頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)(3)反滲透反滲透（RO）是膜分離技術(shù)的一個重要組成部分

膜孔徑小于20?，操作壓力為0.7～13MPa。用于海水淡化。在水過濾時利用反滲透膜的選擇性透過原理，通過設(shè)備的高壓泵對經(jīng)過反滲透膜的原水施加一定壓力，在壓力作用下原水中的水分子可以透過膜而滲析出來，而其他無機(jī)鹽、微生物與有機(jī)物等卻由于反滲透膜對這些物質(zhì)的截留特性而不能透過膜，從而可以獲得純凈的無離子水。

當(dāng)前第44頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)（2）離子交換膜電滲析2、電場膜分離在半透膜的兩側(cè)分別裝上正負(fù)極，電場作用下小分子帶電物或離子向與其本身電荷相反的電極移動，透過半透膜，達(dá)到分離目的。（1）電滲析樣品液緩沖液如圖離子交換膜代替一般膜當(dāng)前第45頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)主要指透析；利用小分子擴(kuò)散作用透過半透膜，而大分子被截留；用于酶、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分離。透析設(shè)備簡單，但操作時間長，要更換水或緩沖液。3、擴(kuò)散膜（透析）膜分離膜公司網(wǎng)站Back當(dāng)前第46頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)五沉淀分離改變某些條件，使溶液中某種溶質(zhì)溶解度降低，從而從溶液中沉淀析出，達(dá)到與其它溶質(zhì)分離。是酶分離純化常用的方法之一。其本質(zhì)是降低溶液的溶解度。方法有鹽析沉淀、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、復(fù)合沉淀等,表4-3.當(dāng)前第47頁\共有56頁\編于星期四\7點(diǎn)在某一濃度的鹽溶液中，不同的蛋白質(zhì)和酶因溶解度各不相同而分離。鹽為什么會改變蛋白酶的溶解度？鹽在溶液中離解為正負(fù)離子，反離子作用改變蛋白酶分子表面的電荷；同時離子存在改變水活度使分子表面水化膜改變。1、鹽析沉淀法『鹽溶』是加鹽使蛋白質(zhì)融入水中，『鹽析』是加鹽使蛋白質(zhì)沉淀出來。兩者所加的鹽類不同，其作用機(jī)制也毫無關(guān)系。當(dāng)前第48頁\共有56頁\編于星期四\7