熒光顯微鏡的基本原理及應用演示文稿

熒光顯微鏡的基本原理及應用演示文稿當前第1頁\共有19頁\編于星期四\10點熒光顯微鏡的基本原理及應用當前第2頁\共有19頁\編于星期四\10點當前第3頁\共有19頁\編于星期四\10點一、熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)

原理：

某些物質經一定波長的光（如紫外光）照射后，物質中的分子被激活，吸收能量后躍遷至激發(fā)態(tài)；當其從激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)時，所吸收的能量除部分轉化為熱量或用于光化學反應外，其余較大部分則以光能形式輻射出來，由于能量沒能全以光的形式輻射出來，故所輻射出的光的波長比激發(fā)光的要長，這種波長長于激發(fā)光的可見光部就是熒光(fluorescence)。所謂熒光就是某些物質在一定波長光（如紫外光）的照射下、在極短時間內所發(fā)出的比照射光波長更長的可見光。當前第4頁\共有19頁\編于星期四\10點當前第5頁\共有19頁\編于星期四\10點當前第6頁\共有19頁\編于星期四\10點二、熒光顯微鏡的組成1、光源：一般采用高壓汞燈2、濾色系統：由激發(fā)濾板和壓制濾板組成a、激發(fā)濾板：提供一定范圍的激發(fā)光b、壓制濾板：完全阻擋激發(fā)光通過，提供相應濾長范圍熒光3、反光鏡：一般采用平面反光鏡4、聚光鏡：用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成5、物鏡和目鏡當前第7頁\共有19頁\編于星期四\10點Theopticalsystemofafluorescencemicroscope.Afiltersetconsistsoftwobarrierfilters(1and3)andadichroicmirror(beam-splitting2)當前第8頁\共有19頁\編于星期四\10點當前第9頁\共有19頁\編于星期四\10點三、熒光顯微鏡的操作

(1)安裝紫外防護罩。

(2)打開高壓汞燈的電源控制箱開關。

(3)插入擋光板，中斷光路。

(4)預熱5—10分鐘。

(5)將載有樣品的載玻片放到載物臺上。

(6)選擇接物鏡(按照先低倍，后高倍順序)。當前第10頁\共有19頁\編于星期四\10點

(7)旋轉分光鏡組件轉盤，選擇所需要的分光鏡組件：“O”為觀察透射光時用；“WU”為觀察藍色熒光時用(如DAPl)；“WB”為觀察綠色熒光時用(如FITC)；“WG"為觀察紅色熒光時用(如TRITC)。

(8)使用阻斷濾片(目前多數阻斷濾片內置于熒光顯微鏡)。

(9)通過粗、細螺旋調整焦距。

(10)打開與顯微鏡連接的計算機，點擊數碼成像系統軟件，采集數碼圖像。當前第11頁\共有19頁\編于星期四\10點四、熒光顯微鏡標本制作要求（一）載玻片載玻片厚度應在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發(fā)熒光。有時需用石英玻璃載玻片。（二）蓋玻片蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光女可激發(fā)標本。當前第12頁\共有19頁\編于星期四\10點（三）標本

組織切片或其他標本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外，細胞重迭或雜質掩蓋，影響判斷。（四）封裱劑封裱劑常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/lpH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。（五）鏡油一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標本時，必須使用鏡油，最好使用特制的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質量略有影響。當前第13頁\共有19頁\編于星期四\10點五、熒光染料的使用1、吖啶橙：吖啶橙是最經典的靈敏的熒光染料，它可對細胞中的DNA和RNA同時染色而顯示不同顏色的熒光，DNA呈綠色熒光，RNA呈橙紅色熒光。2、溴化乙錠（EB）:染色DNA和RNA。3、熒光素雙醋酸酯(FDA)：FAD本身無熒光,無極性,可透過完整的原生質膜。一旦進入原生質體后,由于受到酯酶分解而產生具有熒光的極性物質熒光素。4、熒光染料Ho33342和羅丹明123:Ho33342能與細胞中DNA進行特異的結合，羅丹明123能與線粒體進行特異的結合。當前第14頁\共有19頁\編于星期四\10點六、熒光組化實驗中應注意的幾個問題1、每種熒光染料，均有自己的最適pH值，此時熒光最強。當pH改變時，不僅熒光強度減弱，而且波長將有所改變，因此熒光檢測時要在一定的pH值的緩沖液中進行。2、一放熒光染色在20。C以下時熒光比較穩(wěn)定，溫度升高常出現溫度猝滅。3、在熒光觀察中，常因激發(fā)光的增強而使樣品熒光很快衰竭，造成觀察和照相困難。為此最好用能量小的長波長光進行觀察，需照相時再適當增強激發(fā)光。4、一般熒光染液的濃度在萬分之一以下，甚至億萬分之一，也能使標本著色。在一定的限度內，熒光強度可隨熒光素的濃度增加而增強，但超過限度，熒光強度反而下降，這是由于熒光分子間的締合而使自身熒光猝滅所致。當前第15頁\共有19頁\編于星期四\10點七、熒光顯微鏡應用技術1.對細胞結構或組分的定性位、半定量研究免疫熒光技術

用熒光標記的抗體或抗原與樣品(細胞、組織或分離的物質等)中相應的抗原或抗體結合，以適當檢測熒光的技術對其進行分析的方法。將抗原或抗體與熒光染料連接，用于檢測相應特異性的抗體或抗原的方法稱“直接免疫熒光技術(directimmunofluorescenttechnique)”。用熒光染料標記的第二、第三抗體等檢測相應抗原抗體復合體的方法則稱“間接免疫熒光技術(indirectimmunofluorescenttechnique)”。當前第16頁\共有19頁\編于星期四\10點由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對抗原進行細胞定位當前第17頁\共有19頁\編于星期四\10點1.分子標記

利用綠色熒光的發(fā)光機制，可將GFP作為蛋白質標簽(proteintagging)，即利用DNA重組技術，將目的基因與GFP基因構成融合基因，轉染合適的細胞進行表達，然后借助熒光顯微鏡便可對標記的蛋白質進行細胞內活體觀察當前第18頁\共有19頁\編于星期四\10點2.藥