獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室人員培訓(xùn)內(nèi)容

培訓(xùn)內(nèi)容分為三部分:一、血凝及血凝抑制試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)操作為高致病性禽流感抗原及抗體測定二、間接血凝試驗(yàn)試驗(yàn)講解為口蹄疫抗體測定三、ELISA試驗(yàn)謝謝閱讀謝謝閱讀利用特異性抗體或病毒血凝素與紅細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合而出現(xiàn)凝感謝閱讀集現(xiàn)象，用于檢測特異性抗體或病毒血凝素。紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)血凝和血凝抑制試驗(yàn)?zāi)承┎《净虿《镜难肺臋n放心下載素,能選擇性地使某種或某幾種動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集,這種凝集紅細(xì)謝謝閱讀胞的現(xiàn)象稱為血凝（hemagglutination，HA),也稱直接血凝反應(yīng),謝謝閱讀當(dāng)病毒的懸液中先加入特異性抗體,且這種抗體的量足以抑制病毒顆精品文檔放心下載精品文檔放心下載接接觸。這時(shí)紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象就被抑制，稱為紅細(xì)胞凝集抑制精品文檔放心下載(hemagglutinationinhibiion,HI)反應(yīng)，也稱血凝抑制反應(yīng).精品文檔放心下載血凝抑制(HI）試驗(yàn)禽流感流感病毒顆粒表面的血凝素（HA）蛋白,具有識(shí)別并吸附于紅細(xì)感謝閱讀胞表面受體的結(jié)構(gòu)，試驗(yàn)由此得名。蛋白的抗體與受體的特謝謝閱讀異性結(jié)合能夠干擾蛋白與紅細(xì)胞受體的結(jié)合從而出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。精品文檔放心下載該試驗(yàn)是目前WHO進(jìn)行全球流感監(jiān)測所普遍采用的試驗(yàn)方法。謝謝閱讀可用于流感病毒分離株精品文檔放心下載有與抗原亞型一致的感染或免疫抗體.HA—HI試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是目前WHO進(jìn)行全球流感監(jiān)測所普遍采用感謝閱讀感謝閱讀亞型相一致精品文檔放心下載時(shí)才能出現(xiàn)感謝閱讀細(xì)胞檢測哺乳動(dòng)物和水禽的血清時(shí)需要除去存在于血清中的非特異感謝閱讀凝集素，對于其它禽種,也可以考慮選用在調(diào)查研究中的禽種紅細(xì)胞；感謝閱讀需要在每次試驗(yàn)時(shí)進(jìn)行抗原標(biāo)準(zhǔn)化；需要正確判讀的技能。精品文檔放心下載1阿氏（Alsevers稱量葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉。8g、檸檬酸0。、氯化謝謝閱讀鈉0.42g，加蒸餾水至100mL,散熱溶解后調(diào)pH值至感謝閱讀15min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?雞紅細(xì)胞液的制備1采血用注射器吸取阿氏液約2只SPF謝謝閱讀果沒有SPF精品文檔放心下載采血約10mL阿氏液的離心管中混精品文檔放心下載勻。2。2洗滌雞紅細(xì)胞將離心管中的血液經(jīng)1500~1800r/min謝謝閱讀離心8～謝謝閱讀1800r/min離心8分鐘,用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)精品文檔放心下載胞薄膜,再重復(fù)2次以上過程后，加入阿氏液20感謝閱讀胞懸液，4℃保存?zhèn)溆?，不超過5天。2.310%雞紅細(xì)胞懸液取阿氏液保存不超過5天的紅細(xì)胞,謝謝閱讀在錐形刻度離心管中離心1500～1800r/min8分鐘，棄去上清液,精品文檔放心下載準(zhǔn)確觀察刻度離心管中紅細(xì)胞體積(mL),加入9謝謝閱讀鹽水,用吸管反復(fù)吹吸使生理鹽水與紅細(xì)胞混合均勻。41%雞紅細(xì)胞液取混合均勻的10%雞紅細(xì)胞懸液1，精品文檔放心下載加入9mL生理鹽水，混合均勻即可。3抗原血凝效價(jià)測定（試驗(yàn)，微量法)3.1在微量反應(yīng)板的1孔～孔均加入。025mLPBS，換滴感謝閱讀頭。3。2吸取0。025mL病毒懸液加入第l孔，混勻。精品文檔放心下載3.3從第1孔吸取病毒液加入第20。感謝閱讀025mL加入第3孔，如此進(jìn)行對倍稀釋至第孔，從第孔吸取謝謝閱讀。025mL棄之，換滴頭。3。4每孔再加入0.025mLPBS。3.5每孔均加入0.025mL體積分?jǐn)?shù)為％雞紅細(xì)胞懸液（將雞精品文檔放心下載。6振蕩混勻，在室溫（～25℃）下靜置40min后觀察結(jié)精品文檔放心下載果（如果環(huán)境溫度太高，可置4℃環(huán)境下反應(yīng)1感謝閱讀胞將呈明顯的鈕扣狀沉到孔底。3。7結(jié)果判定感謝閱讀表：血凝試驗(yàn)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)孔底所見1紅細(xì)胞全部凝集，均勻鋪于孔底，即100%紅細(xì)胞凝集++++感謝閱讀2紅細(xì)胞凝集基本同上，但孔底有大圈+++3紅細(xì)胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝塊+4紅細(xì)胞于孔底形成小圓點(diǎn)，四周有少許凝集塊—5感謝閱讀凝集精品文檔放心下載該抗原的血凝效價(jià),此效價(jià)為1精品文檔放心下載4血凝抑制（HI）試驗(yàn)（微量法)1根據(jù)3的試驗(yàn)結(jié)果配制4HAU謝謝閱讀病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點(diǎn)，終點(diǎn)稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU的精品文檔放心下載4HAU抗感謝閱讀原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是：64（除以4.2在微量反應(yīng)板的1孔～孔加入0.025mL第孔加謝謝閱讀入0.05mLPBS。3吸取0.025mL血清加入第1孔內(nèi),充分混勻后吸0.025mL謝謝閱讀于第2孔，依次對倍稀釋至第10孔從第孔吸取0.025mL棄去。謝謝閱讀41孔~11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液，感謝閱讀室溫（約20℃）靜置至少30min.5每孔加入體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液混勻,感謝閱讀輕輕混勻，靜置約40min（室溫約20℃，若環(huán)境溫度太高可置4℃精品文檔放心下載.4.6結(jié)果判定以完全抑制4個(gè)HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為滴度。感謝閱讀只有陰性對照孔血清滴度不大于21og2，陽性對照孔血清誤差感謝閱讀不超過1個(gè)滴度,試驗(yàn)結(jié)果才有效。價(jià)小于或等于21og2判定精品文檔放心下載試驗(yàn)陰性；價(jià)等于31og2為可疑，需重復(fù)試驗(yàn)；價(jià)大于或等謝謝閱讀于為陽性。正向間接血凝試驗(yàn)的原理是將可溶性抗原吸附于與免疫無關(guān)的載謝謝閱讀體（紅細(xì)胞）表面，此吸附抗原的紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體結(jié)合，在有電謝謝閱讀解質(zhì)存在的適宜條件下發(fā)生的肉眼可見的凝集性反應(yīng).正向間接血凝謝謝閱讀謝謝閱讀簡單,實(shí)驗(yàn)原理也易于理解，在基層實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)相對落后的情況感謝閱讀下經(jīng)常被應(yīng)用到，因此，正確熟練地操作應(yīng)用，在一些動(dòng)物疫病的免謝謝閱讀疫抗體檢測、疫病診斷上具有現(xiàn)實(shí)意義。謝謝閱讀感謝閱讀接血凝試驗(yàn)的原理,對整個(gè)試驗(yàn)的操作和結(jié)果判定都具有很大的指導(dǎo)感謝閱讀意義。操作步驟可簡化為:①稀釋液→②待檢血清→③對倍稀釋→④感謝閱讀血凝抗原→⑤震蕩靜置→⑥結(jié)果判定六個(gè)環(huán)節(jié)。正向間接血凝試驗(yàn)（IHA）1原理感謝閱讀精品文檔放心下載這種復(fù)合物的分子團(tuán)很小，肉眼看不見.若將抗原吸附（致敏）在經(jīng)精品文檔放心下載過特殊處理的紅細(xì)胞表面,只需少量抗原就能大大提高抗原和抗體的感謝閱讀反應(yīng)靈敏性.這種經(jīng)過口蹄疫純化抗原致敏的紅細(xì)胞與口蹄疫抗體相精品文檔放心下載遇，紅細(xì)胞便出現(xiàn)清晰可見的凝集現(xiàn)象.2適用范圍主要用于檢測O型口蹄疫免疫動(dòng)物血清抗體效價(jià)。3試驗(yàn)器材和試劑3.1孔110°V型醫(yī)用血凝板,與血凝板大小相同的玻板謝謝閱讀3.2微量移液器（50μL25μL）取液塑咀3.3微量振蕩器3.4O型口蹄疫血凝抗原3.5O型口蹄疫陰性對照血清3。6O型口蹄疫陽性對照血清3。7稀釋液8待檢血清(每頭約0。分感謝閱讀鐘4試驗(yàn)方法4。1加稀釋液在血凝板上1-6排的—9孔;第7排的—4孔第—7孔；第精品文檔放心下載8排的—12孔各加稀釋液50μL.4。2稀釋待檢血清取1號待檢血清50μL加入第1排第1孔，并將塑咀插入孔底，感謝閱讀右手拇指輕壓彈簧精品文檔放心下載50μL移入第2孔，混勻后取出50μL移入第3孔……直至第9孔混精品文檔放心下載勻后取出50μL1排謝謝閱讀數(shù)）依次為:1：2⑴、：4⑵、1:8⑶、1:16⑷、：32⑸、1:64⑹、謝謝閱讀：、1:256⑻、：。取2號待檢血清加入第23號待檢血清加入第3排……均精品文檔放心下載按上法稀釋，注意！每取一份血清時(shí),必須更換塑咀一個(gè)。謝謝閱讀4。3稀釋陰性對照血清在血凝板的第7排第1孔加陰性血清4孔，精品文檔放心下載混勻后從該孔取出50μL丟棄.此時(shí)陰性血清的稀釋倍數(shù)依次為：2感謝閱讀⑴、：4⑵、：8⑶、1：。第—7孔為稀釋液對照。感謝閱讀4.4稀釋陽性對照血清在血凝板的第8排第1孔加陽性血清感謝閱讀50μL丟棄.此時(shí)陽性血清的稀釋倍數(shù)依次為1：感謝閱讀—：4096。4.5加血凝抗原被檢血清各孔、陰性對照血清各孔、陽性對照血清各孔、稀釋液謝謝閱讀對照孔均各加O型血凝抗原充分搖勻，瓶底應(yīng)無血球沉淀）25μL。感謝閱讀4。6振蕩混勻?qū)⒀逯糜谖⒘空袷幤魃?-2分鐘，如無振蕩器,用手輕拍混精品文檔放心下載勻亦可,然后將血凝板放在白紙上觀察各孔紅血球是否混勻，不出現(xiàn)精品文檔放心下載血球沉淀為合格。蓋上玻板，室溫下或37℃下靜置1.5-2小時(shí)判定精品文檔放心下載結(jié)果，也可延至翌日判定。4。7判定標(biāo)準(zhǔn)1:16孔，謝謝閱讀感謝閱讀精品文檔放心下載懸浮。陽性血清對照謝謝閱讀合格（少量血球沉入孔底,大部血球懸浮于孔內(nèi)。在對照孔合格的前提下，再觀察待檢血清各孔，以呈現(xiàn)“++”精品文檔放心下載凝集的最大稀釋倍數(shù)為該份血清的抗體效價(jià)。例如1號待檢血清1謝謝閱讀—5,第8孔精品文檔放心下載第9感謝閱讀效價(jià)為1:128。接種口蹄疫疫苗的豬群免疫抗體效價(jià)達(dá)到7感謝閱讀群、羊群免疫抗體效價(jià)達(dá)到1:256（第8“++”凝集為免精品文檔放心下載疫合格.注意事項(xiàng)：收到試劑盒時(shí),應(yīng)立即打開包裝，取出血凝抗原瓶，感謝閱讀用力搖動(dòng)，使粘附在瓶蓋上的紅細(xì)胞搖下，否則易出現(xiàn)沉渣，影響使謝謝閱讀精品文檔放心下載精品文檔放心下載謝謝閱讀別很大用來檢測同一血清樣品，肯定會(huì)出現(xiàn)檢測結(jié)果不一致。謝謝閱讀ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定（Enzyme-Linked感謝閱讀ImmunosorbnentAssay）的簡稱。ELISA試驗(yàn)是一種敏感性高，謝謝閱讀特異性強(qiáng),重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法。將抗原、抗體免疫反應(yīng)的特異謝謝閱讀精品文檔放心下載量的特異性抗體或抗原。在測定時(shí),把受檢標(biāo)本(測定其中的抗體或抗感謝閱讀感謝閱讀謝謝閱讀精品文檔放心下載比例。加入酶反