ＤＮＡ的粗提取與鑒定

5.1DNA的粗提取與鑒定單位：哈32中學(xué)作者：夏炎人教（PEP）課標(biāo)版選修一生物技術(shù)實(shí)踐學(xué)習(xí)目標(biāo)：1、說出DNA的物理和化學(xué)性質(zhì)。2、概述DNA的粗提取和鑒定的原理。3、嘗試對(duì)動(dòng)物或植物組織的DNA進(jìn)行粗提取。4、培養(yǎng)學(xué)生協(xié)作意識(shí)和合作能力。一、基礎(chǔ)知識(shí)：1、提取生物大分子的基本思路是什么？2、你所知道的生物大分子有哪些?3、對(duì)DNA進(jìn)行粗提取的基本思路是什么？（一）DNA的溶解性：1、請(qǐng)根據(jù)曲線圖思考下列問題：（1）在什么濃度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何變化的？在NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時(shí)，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低；在0.14mol/L時(shí)，DNA溶解度最??；當(dāng)NaCl溶液濃度繼續(xù)增加時(shí)，DNA的溶解度又逐漸增大。（2）如何通過控制NaCl溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出？

DNA和蛋白質(zhì)等成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀；或者讓其他成分溶解，DNA析出2、DNA在酒精溶液中的溶解性如何？DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離（二）DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性如何？1、蛋白酶——水解蛋白質(zhì)，對(duì)DNA沒有影響2、

高溫——大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60～80℃，而DNA在80℃以上才會(huì)變性3、洗滌劑——溶解細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，但對(duì)DNA沒有影響（三）DNA的鑒定方法是什么？試劑：二苯胺條件：沸水浴現(xiàn)象：DNA與二苯胺反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色。

二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（一）實(shí)驗(yàn)材料的選?。?/p>

1、什么樣的材料適合提取DNA？2、下列的材料中適合做DNA的提取嗎？為什么？你打算選用哪種材料？請(qǐng)說出理由魚卵、豬肝、菜花（花椰菜）、香蕉、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基的大腸桿菌從核DNA數(shù)目來看，豬38條，雞78條，哺乳動(dòng)物血0條，獼猴桃58條，洋蔥16條，豌豆14條，菠菜12條，大腸桿菌1條。請(qǐng)選擇動(dòng)植物材料各一種。（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液1、動(dòng)物細(xì)胞討論：①雞血細(xì)胞液如何制備？為什么選雞血紅細(xì)胞，而不選哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞？②為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？2、植物細(xì)胞討論：①加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？②如果研磨不充分，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？3、濾液/研磨液中可能含有哪些成分？（三）除去濾液中的雜質(zhì)1、方案一中為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠除去雜質(zhì)？2、方案二和方案三的原理有什么不同（四）DNA的析出與鑒定1、DNA的析出思考：使用冷卻的乙醇有意義是什么？2、簡(jiǎn)述DNA的鑒定的過程實(shí)例：以雞血細(xì)胞液為例簡(jiǎn)述DNA的提取和鑒定的步驟1、制雞血細(xì)胞液（活雞鮮血經(jīng)分離或沉淀獲得）500mL中注入0.1g/mL檸檬酸鈉100mL+新鮮雞血180mL，玻璃棒攪拌5min，放入冰箱1d，吸去上清液；2、破碎細(xì)胞，釋放DNA取血細(xì)胞5-10mL＋20mL蒸餾水，用玻棒沿一個(gè)方向快速攪拌1min,過濾,收集濾液；3、溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA濾液＋2mol/L的NaCl溶液40mL，玻棒沿一個(gè)方向輕緩攪拌，使DNA充分溶解4、DNA的析出在上述溶液中緩緩加入蒸餾水，并沿一個(gè)方向輕輕攪拌，出現(xiàn)（析出）絲狀物；當(dāng)絲狀物不在增加時(shí)，停止加水（此時(shí)NaCl溶液的濃度相當(dāng)于0.14mol/L），過濾，收集黏稠物5、DNA初步純化DNA的黏稠物+20mL2mol/L的NaCl溶液，輕緩攪拌3min，過濾，向?yàn)V液中+體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻酒精50mL，用玻棒沿一個(gè)方向輕緩攪拌，溶液中（析出）出現(xiàn)乳白色絲狀物，用玻棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水分。6、DNA的鑒定⑴兩支試管中分別加入2mol/LNaCl溶液5ml⑵其中一支試管中加入DNA絲狀物⑶各加入二苯胺試劑4ml⑷混勻后，置于沸水浴中加熱5min⑸冷卻后，比較兩只試管中溶液的顏色變化，觀察現(xiàn)象7、實(shí)驗(yàn)小結(jié)：1.共有“三次過濾，兩次析出，七次攪拌”2.加入“兩次蒸餾水，三次NaCl溶液，一次酒精”三、操作提示1、以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，每100ml血液中需要加入3g檸檬酸鈉，防止血液凝固。2、加入洗滌劑后，動(dòng)作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫。加入酒精和玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。3、二苯胺要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會(huì)影響鑒定效果。四、課題延伸：

本課題使用的洗滌劑是多組分的混合物，在嚴(yán)格的科學(xué)實(shí)驗(yàn)中很少使用。實(shí)驗(yàn)室提取高純度的DNA時(shí)，通常使用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、十二烷基硫酸鈉（SDS）或吐溫等化學(xué)試劑。練習(xí)：

1．（2017?常州模擬）在DNA粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)中，將獲得的含有DNA的黏稠物分別按下表處理3次，則DNA主要集中在標(biāo)號(hào)（）A．①③⑤ B．②③⑤ C．①④⑥ D．②④⑥【解答】解：（1）由于DNA可以溶于氯化鈉溶液中，在2mol/L的氯化鈉溶液中DNA的溶解度較高，攪拌過濾后，DNA存在于得到濾液②，而黏稠物①只含有少量DNA而可以丟棄；（2）DNA在O.14mol/L的氯化鈉溶液中溶解度最低，此時(shí)DNA會(huì)從溶液中析出，攪拌過濾后，得到黏稠物③主要就是DNA，因此濾液④可以丟棄；（3）由于DNA不溶于酒精，而其它雜質(zhì)可以溶于酒精，因此放入冷卻的95%的酒精溶液中，攪拌過濾后，DNA存在于黏稠物⑤中，濾液⑥可以丟棄．故選：B．2．（2017?鹽城一模）下列有關(guān)用雞血進(jìn)行DNA粗提取和鑒定實(shí)驗(yàn)的操作，錯(cuò)誤的是（）A．雞血細(xì)胞中加入蒸餾水后，用玻棒攪拌B．用蛋白酶純化溶解于2mol/LNaCl溶液中的DNAC．在溶有DNA的濾液中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精后，用玻棒輕緩攪拌D．將卷在玻棒上的絲狀物加入到4mL二苯胺試劑中，沸水浴加熱，冷卻后觀察答案：D3（2017?揚(yáng)州模擬）下列關(guān)于DNA粗提取與鑒定的實(shí)驗(yàn)敘述，正確的是（

）A．酵母、菜花和豬血均可作為提取DNA的材料B．由于DNA對(duì)高溫耐受性差，故提取時(shí)需加入95%的冷酒精C．可用木瓜蛋白酶純化過濾后研磨液中的DNAD．向溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中緩緩加蒸餾水，當(dāng)出現(xiàn)析出物時(shí)停止加水答案：C4．洗滌劑能夠瓦解（），但對(duì)DNA沒有影響。A.細(xì)胞壁B.細(xì)胞膜C.細(xì)胞核D.細(xì)胞質(zhì)5．在沸水浴的條件下，DNA遇（）會(huì)被染成藍(lán)色。A.斐林試劑B.蘇丹Ⅲ染液C.雙縮脲試劑D.二苯胺6．在DNA提取過程中，最好使用塑料試管和燒杯，目的是（）A.不易破碎B.