核酸提取原理及方法

核酸提取原理及方法1前言

核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象，因此，核酸的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作。主要內(nèi)容核酸簡(jiǎn)介基因組DNA提取質(zhì)粒DNA提取真核細(xì)胞總RNA提取瓊脂糖凝膠電泳核酸簡(jiǎn)介核酸是由核苷酸或脫氧核苷酸通過3′，5′-磷酸二酯鍵連接而成的一類生物大分子。包括核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)兩類。DNA主要儲(chǔ)存遺傳信息。RNA主要傳遞遺傳信息。核酸簡(jiǎn)介

如何分離RNA？如何分離DNA？核酸簡(jiǎn)介——質(zhì)粒DNA

質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。

質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌等細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。核酸簡(jiǎn)介基因組DNA提取質(zhì)粒DNA提取真核細(xì)胞總RNA提取基因組DNA提取方法基因組DNA提取的幾種常用方法：CTAB法SDS法其他方法基因組DNA提取——CTAB法CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來?；蚪MDNA提取——CTAB法

CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方

組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巰基乙醇

終濃度100mM20mM0.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除?；蚪MDNA提取——CTAB法

CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方

組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巰基乙醇

終濃度100mM20mM0.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。CTAB法實(shí)驗(yàn)流程基因組DNA提取——CTAB法植物材料抽提核酸沉淀液氮研磨上層溶液細(xì)胞裂解DNA溶液干燥溶解離心洗滌SDS法原理SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（55～65℃）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰?。?，使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA?；蚪MDNA提取——SDS法注：SDS法適用于大部分實(shí)驗(yàn)材料基因組DNA提取。如動(dòng)物組織、細(xì)胞、全血、細(xì)菌、酵母等。

SDS提取緩沖液的配方基因組DNA提取——SDS法組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）

NaClSDS終濃度50mM20mM0.4M2%Tris-HCl（pH8.0）：提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA：螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl：提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中。基因組DNA提取——SDS法SDS法實(shí)驗(yàn)流程（以動(dòng)物組織為例）動(dòng)物組織抽提酒精沉淀液氮研磨或勻漿上層溶液細(xì)胞裂解DNA溶液干燥溶解離心洗滌基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)小鼠gDNA電泳圖瓊脂糖凝膠電泳：以瓊脂糖凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。基因組DNA提取常見問題DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)DNA降解DNA量少基因組DNA提取常見問題分析DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)DNA中含有蛋白、多糖、多酚類物質(zhì)

——抽提純化、高鹽洗滌DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)

——重新沉淀DNA中殘留有金屬離子

——重新70%乙醇漂洗基因組DNA提取常見問題分析DNA降解材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染DNA提取量少實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少

——

選取新鮮（幼嫩）材料破壁或裂解不充分

——充分研磨、破壁酶、延長(zhǎng)裂解時(shí)間沉淀不完全

——低溫、延長(zhǎng)沉淀時(shí)間洗滌使得丟失DNA基因組DNA提取常見問題分析核酸簡(jiǎn)介基因組DNA提取質(zhì)粒DNA提取真核細(xì)胞總RNA提取瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)粒DNA提取質(zhì)粒DNA提取的方法：堿裂解法煮沸法質(zhì)粒DNA提取——堿裂解法原理離心柱型質(zhì)粒DNA提取試劑盒工作原理離心柱型質(zhì)粒DNA提取試劑盒采用改進(jìn)的SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞，離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除，最后用低鹽、高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。質(zhì)粒DNA提取及檢測(cè)——實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1.實(shí)驗(yàn)器材

臺(tái)式高速離心機(jī)、旋渦混合儀、移液器、定時(shí)器、marker筆、電子天平、電泳設(shè)備、凝膠成像系統(tǒng)、微波爐、量筒、試劑瓶、錐形瓶等。2.實(shí)驗(yàn)耗材無菌2mL/1.5mLEP管、各規(guī)格Tip、一次性手套等。3.實(shí)驗(yàn)試劑

質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱型，YRBIO)

、LB培養(yǎng)基、抗生素、瓊脂糖、DNALoadingBuffer、GoldView核酸染料、

TAE電泳緩沖液等。4.實(shí)驗(yàn)材料

對(duì)數(shù)期菌株（pEGFP-N1inDH5α）質(zhì)粒DNA提取——堿裂解法堿裂解法試劑配方

組分1組分2Ⅰ液25mMTris-HCl（pH8.0）10mMEDTA（pH8.0）Ⅱ

液0.2MNaOH1%SDSⅢ

液3MKAc（pH4.2）RNaseA10μg/mlRNaseA洗脫液

EB10mMTris-HCl（pH8.0）1mMEDTA（pH8.0）質(zhì)粒DNA提取——實(shí)驗(yàn)流程對(duì)數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液過柱干燥溶解離心洗滌質(zhì)粒DNA溶液離心詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟請(qǐng)參考說明書！質(zhì)粒DNA提取——電泳檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA的三種帶型：1.共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子：質(zhì)粒雙鏈沒有斷裂；超螺旋結(jié)構(gòu)；泳動(dòng)速度最快；2.半開環(huán)質(zhì)粒DNA分子：質(zhì)粒的一條鏈斷裂；松弛的環(huán)狀分子；泳動(dòng)速度最慢；3.線性DNA分子：質(zhì)粒的兩條鏈均斷裂；泳動(dòng)速度居中。質(zhì)粒DNA提取常見問題

RNA殘留

質(zhì)粒斷裂量少質(zhì)粒DNA提取常見問題分析RNA殘留

忘記加RNaseA？I液中RNaseA失效？酶量不夠？質(zhì)粒DNA提取常見問題分析質(zhì)粒斷裂II液裂解時(shí)間過長(zhǎng)？裂解時(shí)動(dòng)作過于劇烈？質(zhì)粒DNA提取常見問題分析量少凝膠是否有問題？菌體量少菌體重懸不徹底裂解不完全菌株老化嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒質(zhì)粒類型嚴(yán)謹(jǐn)型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞嚴(yán)格控制之下進(jìn)行的，與寄主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步。所以，往往在一個(gè)細(xì)胞中只有一份或幾份拷貝；松馳型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞的松弛控制之下進(jìn)行的，每個(gè)細(xì)胞中含有10-200份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成才會(huì)使質(zhì)?？截悢?shù)增至幾千份。如較早的質(zhì)粒pBR322即屬于松弛型質(zhì)粒，要經(jīng)過氯霉素處理才能達(dá)到更高拷貝數(shù)。核酸簡(jiǎn)介基因組DNA提取質(zhì)粒DNA提取真核細(xì)胞總RNA提取瓊脂糖凝膠電泳總RNA提取——通用方法異硫氰酸胍/苯酚法（TRIzol法）原理：核酸在中性條件下，因磷酸基解離而帶負(fù)電荷，這一部分由于水化而溶于水。而在酸性條件下，磷酸基的負(fù)電荷消失，水溶性下降。因此，在酸性酚的處理下，DNA向疏水性的酚層移動(dòng)，而RNA由于有-OH的存在有親水性，因此向水層移動(dòng)。TRIzol試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA便分離開。水相層主要為RNA，有機(jī)層主要為DNA和蛋白質(zhì)?？俁NA提取及檢測(cè)——實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1.實(shí)驗(yàn)器材

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、移液器、定時(shí)器、marker筆、酒精噴壺、電子天平、電泳設(shè)備、凝膠成像系統(tǒng)（或紫外透射儀）、紫外分光光度計(jì)、微波爐、量筒、試劑瓶、錐形瓶等。2.實(shí)驗(yàn)耗材

1.5mLEP管（RNasefree）、各規(guī)格Tip（RNasefree）、一次性手套、一次性口罩等。3.實(shí)驗(yàn)試劑

TRIzol總RNA提取試劑（YRBIO)、氯仿、異丙醇、75%乙醇（RNasefree）、DEPCH2O（RNasefree）等。4.實(shí)驗(yàn)材料

新鮮293細(xì)胞RNase是導(dǎo)致RNA降解的最主要物質(zhì)！RNase的來源樣品試劑多次使用的器具裸露的手說話產(chǎn)生的唾沫空氣RNase非常穩(wěn)定，它在一些極端的條件可以暫時(shí)失活，但限制因素去除后有迅速?gòu)?fù)性。用常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能使RNase完全失活。總RNA提取——去除RNase污染玻璃器皿處理：

量筒、試劑瓶等玻璃器皿須200℃烘烤2小時(shí)以上。塑料器皿處理：0.1%DEPC水溶液浸泡過夜，再高溫高壓滅菌。試劑處理：氯仿、異丙醇、無水乙醇新開后RNA專用。0.1%DEPC水配制75%的酒精。專用的RNA操作室、專用器械。操作時(shí)戴口罩、手套、帽子、穿實(shí)驗(yàn)服?？俁NA提取——樣本準(zhǔn)備植物/動(dòng)物組織樣本：新鮮取材或組織離體后液氮速凍，存于液氮或-80℃。為避免反復(fù)凍融，需小份分裝（50~100mg/份）。細(xì)胞樣本：新鮮收集待用或加入TRIzol后-80℃凍存細(xì)胞沉淀。血液樣本：新鮮血液分離出淋巴細(xì)胞，待用或加入TRIzol后-80℃凍存細(xì)胞沉淀。真核細(xì)胞總RNA提取——實(shí)驗(yàn)步驟293細(xì)胞樣品為例收集細(xì)胞上層溶液離心洗滌裂解變性異丙醇沉淀

抽提RNA溶液干燥溶解詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟請(qǐng)參考說明書！總RNA提取——完整性檢測(cè)293細(xì)胞總RNA28S18S5S

由于動(dòng)物細(xì)胞中70-80%的RNA為rRNA，后者又由28S（約4800nt），18S（約1900nt）和5.8S（約120nt）三種組成，所以電泳后應(yīng)該在UV下看見三條清晰的rRNA帶。由于核酸長(zhǎng)度與結(jié)合EB的數(shù)量成正比，所以28SrRNA條帶的熒光強(qiáng)度一般比18SrRNA條帶的熒光強(qiáng)度強(qiáng)1.5-2.3倍。如果這兩條rRNA帶不清晰或比例小于此范圍則表示RNA有降解（因?yàn)榇蟮腞NA被酶降解的可能更大）。電泳檢測(cè)總RNA提取——產(chǎn)量產(chǎn)率與純度檢測(cè)1.打開紫外分光光度計(jì)設(shè)定參數(shù)，具體操作參照儀器說明。2.取少量待測(cè)RNA樣品，用TEBuffer稀釋50倍（或100倍）。3.用TEBuffer做空白，在260nm、280nm、310nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)至零。4.加入待測(cè)RNA樣品在三個(gè)波長(zhǎng)處讀取OD值?？俁NA提取——產(chǎn)量產(chǎn)率與純度檢測(cè)5.根據(jù)OD值計(jì)算RNA的濃度：[SSRNA]=40×(OD260－OD310)×稀釋倍數(shù)6.RNA產(chǎn)量產(chǎn)率計(jì)算：RNA的產(chǎn)量=RNA濃度×溶解體積RNA的產(chǎn)率=RNA產(chǎn)量/細(xì)胞用量7.根據(jù)OD值計(jì)算RNA的純度純RNA樣品的OD260/OD280

大約在1.8-2.0之間。RNA提取常見問題RNA降解DNA殘留OD260/OD280比值偏低電泳帶型異常RNA提取常見問題分析RNA降解外源RNase的污染裂解液質(zhì)量裂解液用量不足樣品本身富含RNase環(huán)境溫度過高28S18S5SRNA提取常見問題分析DNA殘留樣本量過多吸取到中間層及下層試劑解決辦法：DNA酶（RNasefree）消化，再抽提純化處理。RNA提取常見問題分析OD260/OD280比值偏低蛋白污染/苯酚殘留

——加入氯仿后徹底混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。

——不要吸入中間層及有機(jī)相，寧愿多損失些上清。 ——減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底。解決辦法:重新抽提一次，再沉淀、溶解。RNA提取常見問題分析

電泳帶型異常上樣量超過3μg電壓超過8V/cm電泳緩沖液陳舊均可能導(dǎo)致28S和18S條帶分不開核酸簡(jiǎn)介基因組DNA提取質(zhì)粒DNA提取真核細(xì)胞總RNA提取瓊脂糖凝膠電泳DNA的瓊脂糖凝膠電泳1.原理：

DNA分子在高于其等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。而瓊脂糖凝膠具有分子篩作用，不同分子量或分子形狀的核酸，其移動(dòng)速度有差異。因此，利用這種“電荷”和“分子篩”的雙重效應(yīng)，達(dá)到分離核酸的目的。DNA的瓊脂糖凝膠電泳2.瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍DNA的瓊脂糖凝膠電泳3.DNA染料A:EB

溴化乙錠(EthidiumBromide,EB）可以嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。EB染料優(yōu)點(diǎn)：染色操作簡(jiǎn)便，快速，室溫下15-20min；不會(huì)使核酸斷裂；靈敏度高，10ng或更少的DNA即可檢出；可以直接加到樣品中或膠中；價(jià)格低廉。

EB是誘變劑，使用時(shí)一定要戴手套。EB廢液要經(jīng)過處理才能丟棄。B：新型低毒染料：

如GoldView、SYBR

GreenⅠ、SYBR

Gold等。毒性較低，但價(jià)格較昂貴。靈敏度較好，但不如EB。DNA的瓊脂糖凝膠電泳4.瓊脂糖膠液制備（1%，50ml）

4.1