基于核磁共振技術(shù)的代謝組學(xué)研究進(jìn)展

一、生命科學(xué)領(lǐng)域的核磁共振當(dāng)前第1頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)磁共振成像(NMRI,NuclearMagneticResonanceImaging)磁共振定域譜(MRS,MagneticResonanceSpectroscopy)核磁共振波譜(NMR,NuclearMagneticResonanceSpectroscopy)核磁共振當(dāng)前第2頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)二、代謝組學(xué)概述當(dāng)前第3頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)JeremyKNicholsonImperialCollegeLondon，UK代謝組學(xué)的定義Metabonomics:thequantitativemeasurementof

themulti-parametricmetabolicresponseoflivingsystems

topathophysiologicalstimuliorgeneticmodifications對(duì)生物系統(tǒng)因病理生理或基因改變等刺激所致動(dòng)態(tài)多參數(shù)代謝應(yīng)答的定量測(cè)定。J.K.Nicholson,J.C.Lindon,E.Holmes.Xenobiotica,1999,29:1181-89.技術(shù)：NMR動(dòng)物代謝分析：動(dòng)物的體液和組織當(dāng)前第4頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)OliverFiehnUniversityofCaliforniaHealthSciencesDriveDavis,USAMetabolomics:comprehensiveanalysisofallthemetabolitesofanorganism.Thequantitativemeasurementofalllowmolecularweightmetabolitesinanorganism’scellsataspecifictimeunderspecificenvironmentalconditions.生物體所有代謝物的系統(tǒng)分析。本質(zhì)是“給定細(xì)胞在給定時(shí)間和條件下所有小分子代謝物的定量分析”。

O.Fiehn.PlantMol.Biol.,2002,48:155–171.技術(shù)：GC-MS植物代謝分析：細(xì)胞當(dāng)前第5頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)代謝組學(xué)的發(fā)展198219831984198919992000200120022004Sadler,BuckinghamandNicholson:Firstpublicationon1H-NMRofbloodandplasmaNicholson,etal.:

Multi-componentanalysisofspectradatafromraturineNicholsonandWilson:

NMRspectroscopyofbiofluidsNicholson:

DefinitionofMetabonomicsHaselden,etal.:

FirstindependentPharmapublicationofMetabonomicsNicholson,Lindon,andHolmes:PublicationinNatureonMetabonomicsHolmesandAntti:

ExplanationofstatisticsinMetabonomicsIncreasing#ofpublicationsVanDeGreef:publicationofMSforurineprofiling19701997Oliver:DefinitionofMetabolomeHorming,etal.:

Metabolicprofilesofmetabolitesinhuman當(dāng)前第6頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)代謝組學(xué)的中心任務(wù)對(duì)生物體液和組織中內(nèi)源性代謝物質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)測(cè)量和分析。對(duì)生物體在受到病理生理上的刺激以及某種基因修飾所帶來(lái)的代謝物的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行量化和編錄，從而得到生物體代謝隨時(shí)間及生化過(guò)程的變化而改變的信息。將這些信息與病生理過(guò)程中的生物學(xué)事件關(guān)聯(lián)起來(lái)，從而確定此變化規(guī)律相關(guān)的靶器官和作用部位，進(jìn)而確定相關(guān)的生物標(biāo)志物。當(dāng)前第7頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)系統(tǒng)生物學(xué)(SystemsBiology)的組成表現(xiàn)型(phenotype)個(gè)體(individual)器官(organ)組織(tissue)細(xì)胞(cell)代謝物(metabolite)蛋白質(zhì)(protein)mRNADNA代謝組(metabonome/metabolome)蛋白質(zhì)組(proteome)轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)基因組(genome)代謝組學(xué)(metabonomics/metabolomics)蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)轉(zhuǎn)錄組學(xué)(transcriptomics)基因組學(xué)(genomics)系統(tǒng)生物學(xué)(SystemsBiology)當(dāng)前第8頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)不同組學(xué)關(guān)系及分析技術(shù)NMR,GC&MSGene當(dāng)前第9頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)MetabolomicsisMoreTimeSensitiveThanOther“Omics”MetabolomicsProteomicsGenomicsResponseResponseResponseTime當(dāng)前第10頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)GenomicsTranscriptomicsProteomicsMetabonomicsTargetmaterialGene,chromosome(geneticcode)mRNA(geneticcode)Protein(functionoftheprotein)LowmolecularweightmetabolitesMW100,000-120,000100,000-120,0005,000-20,000100-5000CharacteristicsContextindependentContextdependentContextdependentContextdependentAnalysisMapping,sequencingSequencingSeparation,characterizationSeparation,characterizationMethodsDNAsequencerHybridization2Dgel,MaldiTOFNMR,MS,GC,LCHuman30,000genome>109?~2,500各種組學(xué)技術(shù)的比較當(dāng)前第11頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)代謝組學(xué)分析檢測(cè)技術(shù)UPLC,HPLCCE/microfluidicsLC-MSFT-MSQqQ-MSNMRspectroscopyX-raycrystallographyGC-MSLIFdetection當(dāng)前第12頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)?簡(jiǎn)便：樣品不需復(fù)雜預(yù)處理，檢測(cè)不需嚴(yán)格分析條件，避免引入干擾物的可能。?快捷：常規(guī)1HNMR譜只需幾分鐘，且對(duì)低分子量和高分子量的代謝物均能給出定性和半定量的信息。?避免漏檢：不需預(yù)先選定化合物，在對(duì)待測(cè)物知識(shí)非常有限的情況下意義尤為重要?；贜MR的代謝組學(xué)的特點(diǎn)當(dāng)前第13頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)?不破壞樣品的原有組成：NMR方法具有無(wú)損傷性,可以在生理?xiàng)l件下對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)且不影響混合物的生理生化性質(zhì)甚至化學(xué)平衡，以達(dá)到模擬體內(nèi)條件和進(jìn)行分子水平的分析需要。?NMR方法可以進(jìn)行實(shí)時(shí)和動(dòng)態(tài)的檢測(cè)?；贜MR的代謝組學(xué)的特點(diǎn)當(dāng)前第14頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)?

分析組織的高分辨魔角旋轉(zhuǎn)(HR-MAS)NMR方法：消除了磁場(chǎng)不均勻性、化學(xué)位移各向異性和偶極－偶極相互作用帶來(lái)的譜線增寬影響，從而可以獲得與液體高分辨NMR

相媲美的分辨率。?無(wú)偏向性:NMR對(duì)所有化合物的靈敏度是一樣的,氫譜中譜峰和化合物的氫原子是一一對(duì)應(yīng)的,所測(cè)的每個(gè)氫原子都有其相關(guān)的譜峰,并且信號(hào)的強(qiáng)弱反映樣品中各組分的相對(duì)含量?；贜MR的代謝組學(xué)的特點(diǎn)當(dāng)前第15頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)?多參數(shù)：從核磁譜圖中的多種參數(shù)得出結(jié)構(gòu)信息。對(duì)于藥物代謝來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)化學(xué)位移、譜峰的多重性、偶合常數(shù)、弛豫時(shí)間、NOE效應(yīng)、譜峰強(qiáng)度等多種參數(shù)對(duì)同一問題做全面的反映。?多核與多維NMR：解決同一問題可采用多核（1H、13C、15N、31P、23Na、7Li、139La等）和多維（2DCOSY、NOESY、TOCSY、HSQC）等多種核磁共振編輯手段和實(shí)驗(yàn)方法。基于NMR的代謝組學(xué)的特點(diǎn)當(dāng)前第16頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)?檢測(cè)靈敏度低：500MHz譜儀的1HNMR的檢測(cè)限理論為10μM。?水峰過(guò)強(qiáng)：體液中的生物分子一般其濃度為毫摩爾級(jí)，水中質(zhì)子濃度約為100mol/L，是生物分子濃度的105

倍!?檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍有限：很難同時(shí)檢測(cè)同一樣品中含量相差很大的物質(zhì)。?譜峰重疊及譜線較寬。NMR檢測(cè)生物樣品中存在的問題當(dāng)前第17頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)代謝組學(xué)中主流技術(shù)的比較ChromatographyMassSpectrometryNMRObjectiveYesYesYesReproducibilityPoorGoodGoodResolutionFairFairGoodSensitivitySelectiveSelectiveFairUnbiaseddetection(Simultaneous)NoNoYesHolisticNoNoYesMolecularinformationPoorFairRichSamplepreparationExtensiveExtensiveLittlePre-knowledgerequirementsYesYesNoinvivo/insituImpossibleAlmostimpossibleYesThroughputFairHighHighRecurrentexpenditureHighHighLowLabourintensivenessFairFairLowCostpersampleFair/lowFairLow當(dāng)前第18頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)AnalyticalApproachesBio-systemsExogenousEndogenousExposureassessmentBio-monitoringDiseasediagnosticsTimecourseDoseresponseToxins,DrugsEnvironmentaletcMetabolicpathwaysDatabasesMol.Biosyst.2009,5:288;J.Proteome.Res.2009,8:5657;2009,8:352.代謝組學(xué)方法和流程當(dāng)前第19頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)三、基于NMR的代謝組學(xué)研究進(jìn)展當(dāng)前第20頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)

在藥物毒理代謝組學(xué)的研究領(lǐng)域，最為矚目的工作是國(guó)際COMET(ConsortiumforMetabonomicToxicology)計(jì)劃，旨在建立代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)，并為目標(biāo)器官及其位點(diǎn)的毒性建立預(yù)測(cè)性專家系統(tǒng)。他們已經(jīng)建立起了第一個(gè)基于機(jī)器學(xué)習(xí)的實(shí)驗(yàn)室嚙齒動(dòng)物肝臟和腎臟毒性預(yù)測(cè)的專家系統(tǒng)。1.毒理研究當(dāng)前第21頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)

腎毒素：HgCl2、CdCl2、Na2CrO4、硝酸鈾酰、苯酚、對(duì)氨基苯酚、六氯丁二烯(HCBD)、順鉑、2-溴乙胺(BEA)、丙烯亞胺(PI)等

肝毒素：肼、異硫氫酸萘(ANIT)、半乳糖胺(GaIN)、羥丁基甲苯(BHT)

當(dāng)前第22頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)例1.各種腎毒素對(duì)大鼠尿液1HNMR譜的影響。

A,對(duì)照組；B，20mg/kgNa2CrO4(腎臟近曲小管毒)組；C，50mg/kg對(duì)氨基苯酚(腎臟近直小管毒)組；D，50mg/kg丙烯亞胺(令腎髓質(zhì)壞死)組；E，250mg/kg2-溴乙胺(產(chǎn)生急性腎乳頭壞死)組。當(dāng)前第23頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)-25-20-15-10-50510152025-30-20-10010PC1PC2PAPANITControl-15-10-5051015-40-30-20-10010PC1PC2ANITControla-naphthylisothiocyanite(ANIT)p-Aminophenol(PAP)Control當(dāng)前第24頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)尿中乳酸升高：急性腎小管受損TMAO、DMA、DMG和琥珀酸水平升高：腎乳頭受損氨基酸，乳酸（血中）升高：急性肝受損氨基酸，乳酸（尿中）升高：腎小管損壞尿中琥珀酸升高，α-酮戊二酸升高，檸檬酸降低：腎小管酸中毒或線粒體酶活性降低?；撬嵘撸焊闻K受損酮體含量升高：線粒體中酶代謝紊亂肌酸含量升高：睪丸毒一些重要的NMRmarkers當(dāng)前第25頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)

基于NMR的代謝組學(xué)方法不僅能區(qū)分組織器官的正常與非正常的狀態(tài)，而且能給出毒性作用的靶器官以及作用機(jī)制，識(shí)別出毒性的生物標(biāo)記物。當(dāng)前第26頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)2.藥物代謝及安全性評(píng)價(jià)藥物種類：利尿劑（乙酰唑胺），抗菌素（氨比西林、芐基青霉素、先鋒霉素、氟氯西林、青霉素），中樞神經(jīng)藥（脫氧麻黃堿），抗炎解熱鎮(zhèn)痛藥（氨茴酸、萘普生、布洛芬、阿斯匹林、退熱凈、撲熱息痛），抗滴蟲藥（滅滴靈），治關(guān)節(jié)炎藥（青霉胺），抗癌藥物（[Au(Ph2P(CH2)2PPh2)2]Cl、IF、CarboplationPt(II)(NH3)2

）樣本：鼠尿，鼠膽汁，人尿，人淋巴液，血漿方法：1HNMR,13C,19FNMR,31P,1H-1HCOSY,1H-19FCOSY當(dāng)前第27頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)?在藥物開發(fā)階段，代謝組學(xué)不僅可以進(jìn)行早期活體毒理測(cè)試，而且能為藥物分子的篩選提供依據(jù)；?在藥物臨床應(yīng)用前，它能幫助確定藥物的安全性生物標(biāo)記物和代謝表型；?評(píng)價(jià)將動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于人類疾病的可行性。當(dāng)前第28頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)3.病理診斷及病理生理學(xué)

代謝組學(xué)相對(duì)于基因組學(xué)研究來(lái)說(shuō)，在疾?。ㄈ绨┌Y，糖尿病，心血管疾病，肥胖，哮喘）領(lǐng)域是一個(gè)相對(duì)較新，不斷獲得更加廣泛認(rèn)可的分析方法。利用代謝組學(xué)的方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的診斷，通過(guò)對(duì)生物標(biāo)記物的尋找和相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)的研究，探尋生物標(biāo)記物的代謝途徑和疾病的產(chǎn)生機(jī)理，實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的診斷。當(dāng)前第29頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)1957年，“NMR醫(yī)學(xué)研究系”1979年，利用體液的氫譜對(duì)癌癥進(jìn)行診斷

1986年，利用人血漿中脂蛋白峰的甲基和亞甲基的線寬區(qū)別進(jìn)行惡性腫瘤的診斷近年來(lái)，通過(guò)對(duì)血漿、血清、腦脊液、卵巢囊液、組織液、鼠肝提取液的NMR分析，對(duì)體液NMR技術(shù)進(jìn)行癌癥或一些特異的腫瘤如：子房瘤、卵巢瘤、腦瘤、肝臟淋巴瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性膠質(zhì)瘤進(jìn)行檢測(cè)診斷的可能性進(jìn)行了研究。當(dāng)前第30頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)臨床和生化研究的一個(gè)重要領(lǐng)域：利用高分辨NMR技術(shù)研究慢性腎功能衰竭(chronicrenalfailure,CRF)者的生化異常。利用NMR技術(shù)可以研究先天性代謝失常，包括2-羥基戊二酸尿癥、棕色糖尿病、酪氨酸血癥、先天性血色沉著病、先天性尿道鈣結(jié)石，在其它疾病如腦白質(zhì)病、糖尿病、神經(jīng)病等方面也取得了一些有益的研究成果。當(dāng)前第31頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)例1.Urinesamples–Cataract（白內(nèi)障）Cataract(48)Control(48)當(dāng)前第32頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)例2.Serumsamples-cardiovasculardisease(冠心病)BrindleJTetal.,2002.NatMed.8(12),1439-45.當(dāng)前第33頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)4.

食品安全及質(zhì)量控制目前對(duì)飲食的安全可靠性和食品的質(zhì)量控制引起了科學(xué)領(lǐng)域和公眾的特別關(guān)注，促進(jìn)了在食品領(lǐng)域的代謝組學(xué)分析和對(duì)其質(zhì)量控制方面的研究。當(dāng)前第34頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)

目前主要研究方向：酒精飲料和釀造食品（啤酒、葡萄酒、蒸餾酒、醬油、醋），咖啡和茶類，水果和蔬菜（果汁、柑橘、獼猴桃、芒果、黑樹莓、甜瓜、西瓜、西紅柿、萵苣、蕓苔、土豆、胡蘿卜、玉米、小麥），橄欖油，牛奶和乳制品（牛奶、奶酪、黃油和人造黃油），蜂蜜，魚和肉類。還有其它的研究如松露、菌類和藏紅花。當(dāng)前第35頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)PCA(A)andOPLS-DA(B)3Dscoreplotsderivedfromthe1HNMRspectraofbeefsirloin(orchuck)extractsobtainedfromAustralia,Korea,NewZealand,andtheUnitedStatesofAmerica.例1.Extractsfrombeefsirloin(牛里脊肉)當(dāng)前第36頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)例2.Beer（啤酒）Thesamecompany,protocol(Genome),pipe-line(Proteome),butdifferenttaste(Metabolome)當(dāng)前第37頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)例3.Wine（葡萄酒）RedwineMoretanninsandphenolicsWhitewineMoreaminoacid當(dāng)前第38頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)例4.蜂蜜（Honey）CJ(Chinesejujube，棗花),LJ(Lonicerajaponica，金銀花),FS(Flossophorae，槐花),FCI(Floschrysanthemiindici，菊花),EJ(Eriobotryajaponica，枇杷)不同花蜜的NMR譜當(dāng)前第39頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)例4.蜂蜜（Honey）相同產(chǎn)地不同花源相同花源不同產(chǎn)地相同廠家不同批次當(dāng)前第40頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)5.營(yíng)養(yǎng)代謝研究

代謝組學(xué)的方法可以幫助識(shí)別和常量營(yíng)養(yǎng)物的最終攝入效應(yīng)密切相關(guān)的代謝物，并且有助于定義各種常量營(yíng)養(yǎng)物的正常攝入范圍。營(yíng)養(yǎng)代謝組學(xué)（Nutrimetabolomics）定義的提出。當(dāng)前第41頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)

飲食與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)與代謝組學(xué)相結(jié)合系統(tǒng)地表征在不同健康狀態(tài)（健康，亞健康，疾?。┫?，飲食習(xí)慣，地域差異，營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)（種類和用量），營(yíng)養(yǎng)相關(guān)疾病等對(duì)機(jī)體造成的細(xì)微代謝變化，這些變化概況為探索不同飲食或營(yíng)養(yǎng)條件下機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞，組織和器官的生物標(biāo)記物，代謝整體水平以及代謝作用機(jī)制，并有可能為機(jī)體的健康狀況動(dòng)態(tài)地況進(jìn)行診斷和營(yíng)養(yǎng)搭配提供新的策略。當(dāng)前第42頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)6.功能基因組的研究

隨著人類基因組測(cè)序工作的完成，人們已經(jīng)步入到了后基因組時(shí)代即對(duì)功能基因組學(xué)的研究。通常，功能基因組學(xué)利用基因組提供的信息和產(chǎn)物，運(yùn)用遺傳或其他新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，通過(guò)識(shí)別基因在一個(gè)或多個(gè)生物模型中的作用來(lái)全面認(rèn)識(shí)和分析基因的功能。當(dāng)前第43頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)

基因產(chǎn)生變異的生物體在生長(zhǎng)速率等表型上可能沒有顯著的改變，這是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的代謝物濃度的改變補(bǔ)償了變異產(chǎn)生的影響。但是這也同時(shí)意味著生物體在代謝表型上可能會(huì)有顯著的變化。代謝組學(xué)作為功能基因組學(xué)研究應(yīng)用的一個(gè)重要方法，主要是從基因表達(dá)譜的終點(diǎn)——代謝物組的信息來(lái)鑒定或推測(cè)出基因的功能?！盎蚪M學(xué)告訴我們什么可能發(fā)生，代謝組學(xué)則告訴我們發(fā)生了什么”，二者相互關(guān)聯(lián)，將會(huì)從現(xiàn)象到本質(zhì)探尋生命的奧秘。當(dāng)前第44頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)7.中醫(yī)藥現(xiàn)代化

代謝組學(xué)有可能在中醫(yī)“病、證、方”的研究體系中發(fā)揮作用，在規(guī)范中醫(yī)基于證的診斷標(biāo)準(zhǔn)、探索證候的動(dòng)態(tài)內(nèi)涵和演變規(guī)律，以及提示證與疾病療效的相關(guān)性和科學(xué)性方面扮演重要的角色。另外在中藥質(zhì)量控制、整體療效和中藥安全性也進(jìn)行了初步研究。當(dāng)前第45頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)8.微生物領(lǐng)域的研究

微生物代謝組學(xué)是力求在特定的條件下分析微生物體系中所有代謝物的動(dòng)態(tài)變化，它不僅反映了基因、轉(zhuǎn)錄和環(huán)境等作用的最終結(jié)果，還為發(fā)現(xiàn)新的標(biāo)記代謝物和代謝