生化技術課件第一章生命大分子物質的制備

生化技術課件第一章生命大分子物質的制備第一頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日生物大分子

(biomacromolecule)通常是指動物、植物和微生物在進行新陳代謝時產生蛋白質和核酸等有機化合物的總稱。特點：具有較大的分子量、由簡單的小分子排列組成、具有復雜的空間結構、生物大分子的生物活性由結構決定。闡明生物大分子復雜的結構及結構與功能的關系是生物學的主要任務。第二頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日

在自然科學，尤其是生命科學高度發(fā)展的今天，蛋白質、酶和核酸等生物大分子的結構與功能的研究是探求生命奧秘的中心課題。生物大分子結構與功能的研究，必須首先解決生物大分子的制備問題，沒有能夠達到足夠純度的生物大分子的制備工作為前題，結構與功能的研究就無從談起。生物大分子的分離純化與制備是一件十分細致而困難的工作。第三頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日生物大分子的制備有以下主要特點：與化學產品的分離制備相比較：⑴蛋白質的組成、結構極其復雜，分子差異大導致分離、純化和鑒定有難度和特殊性；核酸較之要簡單。⑵通常以復合物的形式存在，提取分離困難。⑶許多生物大分子離開了生物體環(huán)境就極易失活，因此分離過程中如何防止其失活，是生物大分子提取制備最困難之處。第四頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日⑷許多生物大分子在生物材料中的含量極微，分離純化的步驟繁多，流程長。⑸生物材料的組成極其復雜，常常包含有數(shù)百種乃至幾千種化合物，方法的通用性較差。正是這些特點致使蛋白質的分離純化和分析的難度極大。第五頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日生物大分子制備的一般過程：①根據要制備的生物大分子的目的和要求，選擇和處理合適的材料。②確立可靠的分析測定方法，這是制備生物大分子的關鍵。③有效成分的抽提。第六頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日④粗品的純化。⑤純品的鑒定（純度、量）。⑥產物的濃縮、干燥和保存。第七頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日①在水和各種有機溶劑中的溶解性。②在不同溫度、pH值和各種緩沖液中生物大分子的穩(wěn)定性。③各種物理性質：如分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、在電場中的行為、離心沉降的表現(xiàn)、在各種凝膠、樹脂等填料中的分配系數(shù)。首要了解生物大分子的理化性質：第八頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日④固態(tài)時對溫度、含水量和凍干時的穩(wěn)定性。⑤其他化學性質：如對各種蛋白酶、水解酶的穩(wěn)定性和對各種化學試劑的穩(wěn)定性。⑥對其他生物分子的特殊親和力。第九頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日蛋白質的理化性質蛋白質的兩性電離和等電點蛋白質的膠體性質蛋白質的變性、復性、沉淀和凝固蛋白質的紫外吸收第十頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日目前純化蛋白質等生物大分子的關鍵技術是電泳、層析和離心三大技術。第十一頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日材料的選擇與處理第一節(jié)第十二頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日

制備生物大分子，首先要選擇適當?shù)纳锊牧稀２牧系膩碓礋o非是動物、植物和微生物及其代謝產物。所選用的材料主要依據實驗目的來確定。選擇的材料應含量高、來源豐富、制備工藝簡單、成本低。一、材料的選擇第十三頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日有效成分：指欲純化的某種單一的生命大分子物質。雜質：有效成分以外的其他物質的統(tǒng)稱。第十四頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日例一：胰島素的提取含量：牛胰腺>豬胰腺來源：豬>牛成本：牛>豬

綜合結果：選用豬胰腺作為材料。第十五頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日例二：酸性磷酸酶分離純化與活性測定含量：小麥的胚芽中含量高第十六頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日

材料盡可能保持新鮮，盡快加工處理，以防有效成分降解、破壞，必要時可冷凍、干燥處理。1、動物組織

必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料，先進行絞碎、脫脂等處理后在適當?shù)娜軇┲刑崛。绻蟮某煞衷诩毎麅?，則要先破碎細胞。

二、材料的處理第十七頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日冰凍

-70℃保存?zhèn)溆幂^好干燥

第十八頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日2、植物材料

必須清洗,去殼，脫脂，并注意植物品種和生長發(fā)育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節(jié)性關系密切。如葉片:直接洗凈植物種子:泡脹或粉碎第十九頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日

3、微生物：種類多，繁殖快、培養(yǎng)簡便、易誘變、不受季節(jié)的影響，是常用的材料。應注意它的生長期。在微生物的對數(shù)生長期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產量。以微生物為材料時有兩種情況：（1）微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產物和胞外酶等（2）菌體含有的生化物質，如蛋白質、核酸和胞內酶等第二十頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日另外，對預處理好的材料，若不立即進行實驗，應冷凍保存；對于易分解的生物大分子應選用新鮮材料制備；第二十一頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)

確立測定方法第二十二頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日一、目的與要求生物大分子的兩個重要特征：極易失活和含量極微測定方法應該：

簡便、靈敏、準確、快速、專一第二十三頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日分析測定的方法主要有兩類：即生物學和物理化學的測定方法。生物學的測定法主要有：酶的各種測活方法、蛋白質含量的各種測定法、免疫化學方法、放射性同位素示蹤法等；二、常用的測定方法第二十四頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日物理、化學方法主要有：比色法、氣相色譜和液相色譜法、光譜法（紫外／可見、紅外和熒光等分光光度法）、電泳法、以及核磁共振等。實際操作中盡可能多用儀器分析方法，以使分析測定更加快速、簡便。第二十五頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日1、光譜法不同的生命大分子物質與相應波長的光會發(fā)生特定的作用，依據作用結果可推斷出被測物質的含量和部分理化性質，這類測定方法為光譜法。所需的樣品量少、操作簡單、反應迅速、靈敏廣泛用于物質的含量測定。紫外光譜法、可見光光譜法、熒光光譜法、濁度法第二十六頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日紫外光譜法

利用某些生物大分子具有吸收紫外光的性質而建立的一種方法。將一定濃度的待測物溶液，通過某一特定波長的紫外分光光度計，測定此溶液的消光值即可換算出待測物的濃度。

1.測定核酸含量

2.測定蛋白質的含量及純度第二十七頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日芳香族氨基酸的紫外吸收第二十八頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日測定核酸\蛋白質的含量:

OD260=1.0相當于

50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）

20μg/ml寡核苷酸測定核酸\蛋白質的純度:DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0第二十九頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日可見光光譜法有色物質溶液的顏色與其濃度有關。溶液的濃度越大，顏色越深。利用光學比較溶液顏色的深度，可以測定溶液的濃度?？梢姽夤庾V法是基于有色溶液對光的選擇性吸收而建立起來的一種分析方法。將待測物與相關試劑或酶作用后的有色產物置于相應的可見光波長下，即測定其消光值。第三十頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日例如：測定某一蛋白質溶液的濃度方法：蛋白質與相關試劑（如雙縮脲試劑）作用后產生特定顏色的物質（紫色絡合物），紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，于波長540nm處進行比色測定。最后與標準品比對即可計算出該待測蛋白質溶液的濃度第三十一頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日第三十二頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日

利用有些生命大分子物質自身可以吸收特定光波的能量后，發(fā)出熒光的特性而建立的一種方法。精確性重復性靈敏度比吸收光譜法好熒光光譜法第三十三頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日濁度法主要用于懸浮液的測定。測定懸浮液在不被吸收的波長下表現(xiàn)的消光值。不被吸收，主要是散射、反射。第三十四頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日光譜法電化學法生物活性檢測法免疫分析法生物傳感器吸收光譜法熒光法濁度法直接測定法比色法第三十五頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日第三節(jié)細胞的破碎第三十六頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同。如動物臟器的細胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有較堅固的纖維素、半纖維素組成的細胞壁，要采取專門的細胞破碎方法。第三十七頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日一、機械破碎1.研磨法：將剪碎的動物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿。第三十八頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日2.組織搗碎器法：這是一種較劇烈的破碎細胞的方法，通?？上扔眉矣檬称芳庸C將組織打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的內刀式組織搗碎機(即高速分散器)將組織的細胞打碎。

注意溫度的影響第三十九頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日二、物理法：1.超聲波法：此法是借助超聲波的振動力破碎細胞壁和細胞器。破碎微生物細菌和酵母菌時，時間要長久一些。第四十頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日2.壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細胞的方法。在1.77×108Pa～3.54×108Pa的高壓下使細胞懸液通過一個小孔突然釋放至常壓，細胞將徹底破碎。第四十一頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日3.凍融法：將待破碎的細胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室溫(或40℃)迅速融化，如此反復凍融多次，由于細胞內形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細胞溶脹破碎。第四十二頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日三、化學與生物化學方法：1.自溶法：將新鮮的生物材料存放于一定的pH和適當?shù)臏囟认?，細胞結構在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細胞內含物釋放出來。2.溶脹法：細胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進入細胞，將細胞膜脹破釋放出細胞內含物。第四十三頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日3.有機溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細胞，可將細胞膜溶解，從而使細胞破裂，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。4.酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，處理15分鐘，可以專一性地將細胞壁分解。

第四十四頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日第四節(jié)抽提第四十五頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日一、抽提抽提：指用適當?shù)娜軇┖头椒?，從原料中把有效成分分離出來的過程。是在分離純化之前將經過預處理或破碎的細胞置于溶劑中，使被分離的生物大分子充分地釋放到溶劑中，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)不丟失生物活性。第四十六頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日提取時所選擇的條件應有利于目的產物溶解度的增加和保持其生物活性。影響提取的因素主要有：目的產物在提取的溶劑中溶解度的大??；由固相擴散到液相的難易；溶劑的pH值和提取時間等。第四十七頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日二、抽提有效成分的影響因子稀鹽溶液和緩沖液對蛋白質的穩(wěn)定性好，溶解度大，是提取蛋白質和酶最常用的溶劑。第四十八頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日1)pH值：蛋白質、酶與核酸的溶解度和穩(wěn)定性與pH值有關。過酸、過堿均應盡量避免，一般控制在pH=6～8范圍內，提取溶劑的pH應在蛋白質和酶的穩(wěn)定范圍內，通常選擇偏離等電點的兩側。遠離等電點的pH值，溶解度增加。通常，堿性物質易溶于酸性溶劑，酸性物質易溶于堿性溶劑。第四十九頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日2)溶劑的極性和離子強度：離子強度對生物大分子的溶解度有極大的影響，有些物質，如DNA-蛋白復合物，在高離子強度下溶解度增加。有些蛋白質和酶，在低離子強度的溶液中有較大的溶解度，如在純水中加入少量中性鹽，蛋白質的溶解度比在純水時大大增加，稱為“鹽溶”現(xiàn)象。第五十頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日為了提高提取效率，有時需要降低或提高溶劑的極性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其極性降低；增加離子強度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的極性。通常，極性物質易溶于極性溶劑，非極性物質易溶于非極性溶劑。

相似相溶第五十一頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日3)水解酶：無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質量的減少。加入抑制劑或調節(jié)提取液的pH、離子強度或極性等方法使相應的水解酶失去活性，防止它們對欲提純的蛋白質、酶及核酸的降解作用。第五十二頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日

加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性；加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力；還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合于目的物質的提取。第五十三頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日4)溫度：為防止變性和降解，制備具有活性的蛋白質和酶，提取時一般在0℃～5℃的低溫操作。溫度升高，溶解度加大。第五十四頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日5)攪拌：攪拌能促使被提取物的溶解，一般采用溫和攪拌為宜，速度太快容易產生大量泡沫，增大了與空氣的接觸面，會引起酶等物質的變性失活。第五十五頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日6)氧化：因為一般蛋白質都含有相當數(shù)量的巰基，有些巰基常常是活性部位的必需基團。若提取液中有氧化劑或與空氣中的氧氣接觸過多都會使巰基氧化為分子內或分子間的二硫鍵，導致酶活性的喪失。在提取液中加入少量巰基乙醇或半胱氨酸以防止巰基氧化。還有金屬離子、提取液的比例等因素第五十六頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日第五節(jié)濃縮第五十七頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日1.沉淀法:沉淀是溶液中的溶質由液相變成固相析出的過程。沉淀法（即溶解度法）操作簡便，成本低廉，不僅用于實驗室中，也用于某些生產目的的制備過程，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質和酶時最常用的方法。通過沉淀，將目的生物大分子轉入固相沉淀或留在液相，而與雜質得到初步的分離。第五十八頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日2.吸咐法:

通過吸咐劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮所用的吸咐劑必需與溶液不起化學反應，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等。第五十九頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日3.超濾:超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法，液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留。最適于生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，并具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優(yōu)點。第六十頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日

關鍵在于膜的選擇，不同類型和規(guī)格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數(shù)均不同，必須根據工作需要來選用。第六十一頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日4.透析法:

在生物大分子的制備過程中，除鹽、除少量有機溶劑、除去生物小分子雜質和濃縮樣品等都要用到透析的技術。透析只需要使用專用的半透膜即可完成。保留在透析袋內未透析出的樣品溶液稱為“保留液”，袋（膜）外的溶液稱為“滲出液”或“透析液”。截留分子量通常為1萬左右。第六十二頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日半透膜阻留蛋白質分子，而讓小的溶質分子和水通過，以達到除去蛋白質溶液中小分子（鹽、低分子酸等）。第六十三頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日5.蒸餾法:減壓加溫蒸發(fā)濃縮:通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發(fā)愈快，此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。第六十四頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日6.空氣流動蒸發(fā)濃縮:空氣的流動可使液體加速蒸發(fā),鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置于冷室，用電扇對準吹風，使透過膜外的溶劑蒸發(fā)，而達到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適于大量溶液的濃縮。第六十五頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日7.冰凍干燥法:生物大分子制備得到產品，為防止變質，易于保存，常需要干燥處理，最常用的方法是冷凍真空干燥,適用于不耐高溫，易于氧化物質的干燥和保存。第六十六頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日

在低溫低壓下，冰很易升華為氣體。操作時一般先將待干燥的液體冷凍到冰點以下使之變成固體，然后在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干后的產品具有疏松、溶解度好、保持天然結構等優(yōu)點，適用于各類生物大分子的干燥保存。第六十七頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日第六十八頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日第六節(jié)純化方案的設計與評價第六十九頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日

由于生物體的組成成分是如此復雜，數(shù)千種乃至上萬種生物分子又處于同一體系中，因此不可能有一個適合于各類分子的固定的分離程序，但多數(shù)分離工作關鍵部分的基本手段是相同的。為了避免盲目性，節(jié)省實驗探索時間，要認真參考和借鑒前人的經驗，少走彎路。

第七十頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日1.分離純化方法的選擇制備生物大分子的方法分類如下：①以分子大小和形態(tài)的差異為依據的方法：差速離心、區(qū)帶離心、超濾、透析和凝膠過濾等。②以溶解度的差異為依據的方法：鹽析、萃取、分配層析、選擇性沉淀和結晶等。一、純化方案的設計第七十一頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日③以電荷差異為依據的方法：電泳、電滲析、等電點沉淀、吸附層析和離子交換層析等。④以生物學功能專一性為依據的方法：親和層析等。第七十二頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日切忌！重復使用同一種分離純化方法。第七十三頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日分離純化步驟前后要有科學的安排和銜接，盡可能減少工序，提高效率。2.分離純化方法的排布:第七十四頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日⑴早期分離純化

1)特點：①粗提取液中物質成份十分復雜;②欲制備的生物大分子濃度很稀;③物理化學性質相近的物質很多;④希望能除去大部分與目的產物物理化學性質差異大的雜質;第七十五頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日2)對所選方法的要求：①要快速、粗放;②能較大地縮小體積;③分辨力不必太高;④負荷能力要大;第七十六頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日3)可選用的方法：①吸附；②萃??；③沉淀法（熱變性、鹽析、有機溶劑沉淀等）；④離子交換（批量吸附、胖柱交換）、親和層析。第七十七頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日⑵晚期分離純化：

分離純化后期，目的產物的純度和濃度都大大提高，此時對于很多敏感的酶極易變性失活，因此操作步驟要連續(xù)、緊湊，并盡可能在低溫下（如在冷室中）進行。

第七十八頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日可選用的方法：吸附層析、鹽析、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析、等電聚焦制備電泳、制備HPLC等。第七十九頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日每一步都要進行測定有效成分的含量；比活力；(活力單位數(shù)/毫克蛋白)純化倍數(shù)；(每步的比活力/粗抽提液比活力）收得率；(每步的總活力/粗抽提液總活力）二、純化方案的評價第八十頁，共八十九頁，編輯于2023年，星期日步驟總蛋白/g總活性/U比活性/（U/mg）純化倍數(shù)收得率%1.粗抽體液30.0210000.71.01002.氯化錳處理7.64150172.02.8723.冰凍融解5.58148722.73.8714.DEAE-纖維素層析0.113502544.563.5245.硫酸銨鹽析0.048336771.7102.0176.羥基磷灰石柱層析0.0163133200.0286.0157.聚丙烯酰