蛋白質(zhì)純化技術(shù)指南

蛋白質(zhì)的一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)決定了它的物理、化學(xué)、生物化學(xué)、物理化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)，綜述了不同蛋白質(zhì)之間的性質(zhì)存在差異或者改變條件是使之具有差異，利用一種同時(shí)多種性質(zhì)差異，在兼顧收率和純度的情況下，選擇蛋白質(zhì)提純的方法。蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中一般都是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類(lèi)型的細(xì)胞都含有成千種不同的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的分離和提純工作是一項(xiàng)艱巨而繁重的任務(wù)，到目前為止，還沒(méi)有一個(gè)單獨(dú)的或一套現(xiàn)成的方法能把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中提取出來(lái)，但對(duì)任何一種蛋白質(zhì)都有可能選擇一套適當(dāng)?shù)姆蛛x提純程序來(lái)獲取高純度的制品。蛋白質(zhì)提純的總目標(biāo)是設(shè)法增加制品純度或比活性，對(duì)純化的要求是以合理的效率、速度、收率和純度，將需要蛋白質(zhì)從細(xì)胞的全部其他成分特別是不想要的雜蛋白中分離出來(lái)，同時(shí)仍保留有這種多肽的生物學(xué)活性和化學(xué)完整性。能從成千上萬(wàn)種蛋白質(zhì)混合物中純化出一種蛋白質(zhì)的原因，是不同的蛋白質(zhì)在它們的許多物理、化學(xué)、物理化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)有著極大的不同，這些性質(zhì)是由于蛋白質(zhì)的氨基酸的序列和數(shù)目不同造成的，連接在多肽主鏈上氨基酸殘基可是荷正電的、荷負(fù)電的、極性的或非極性的、親水的或疏水的，此外多肽可折疊成非常確定的二級(jí)結(jié)構(gòu)（a螺旋、p折疊和各種轉(zhuǎn)角）、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)，形成獨(dú)特的大小、形狀和殘基在蛋白質(zhì)表面的分布狀況，利用待分離的蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)之間在性質(zhì)的差異，即能設(shè)計(jì)出一組合理的分級(jí)分離步驟?？梢罁?jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)與之相對(duì)應(yīng)的方法將蛋白質(zhì)混合物分離：1.分子大小不同種類(lèi)的蛋白質(zhì)在分子大小方面有一定的差別，可用一些簡(jiǎn)便的方法，使蛋白質(zhì)混合物得到初步分離。1透析和超濾透析在純化中極為常用，可除去鹽類(lèi)（脫鹽及置換緩沖液）、有機(jī)溶劑、低分子量的抑制劑等。透析膜的截留分子量為5000左右，如分子量小于10000的酶液就有泄露的危險(xiǎn)，在純化中極為常用，可除去鹽類(lèi)、有機(jī)溶劑、低分子量的抑制劑等。超濾一般用于濃縮和脫色2離心分離置換緩沖液許多酶富集于某一細(xì)胞器內(nèi)，勻漿后離心得得到某一亞細(xì)胞成分，使酶富集10~20倍，再對(duì)特定的酶進(jìn)行純化。差速離心，分辨率較低，僅適用于粗提或濃縮。速率區(qū)帶法，如離心時(shí)間太長(zhǎng)所有的物質(zhì)都會(huì)沉淀下來(lái)，故需選擇最佳分離時(shí)間，可得到相當(dāng)純的亞細(xì)胞成分用于進(jìn)一步純化，避免了差速離心中大小組分一起沉淀的問(wèn)題，但容量較小，只能用于少量制備。等密度梯度離心常用的離主介質(zhì)有蔗糖、聚蔗糖、氯化艷、漠化鉀、碘化鈉等等3凝膠過(guò)濾這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一，注意使要離的蛋白質(zhì)分子量落在凝膠的工作范圍內(nèi)。選擇不同的分子量凝膠可用于脫鹽、置換緩沖液及利用分子量的差異除去熱源。形狀蛋白質(zhì)在離心通過(guò)溶液運(yùn)動(dòng)時(shí)，或通過(guò)膜、凝膠過(guò)濾填料顆?；螂娪灸z中的小孔運(yùn)動(dòng)時(shí)，都會(huì)受到形狀的影響：對(duì)兩種相同質(zhì)量的蛋白質(zhì)而言，球狀蛋白質(zhì)具有較小的有效半徑（斯托克半徑），通過(guò)溶液沉降時(shí)遇到的摩擦力小，沉降較快而顯得比其它形狀的蛋白質(zhì)大；反之，在體積排阻色譜時(shí)，斯托克半徑較小的球狀蛋白質(zhì)更容易擴(kuò)散進(jìn)入凝膠過(guò)濾填料顆粒內(nèi)部，較遲洗脫出來(lái)，因而顯得比其它形狀的蛋白質(zhì)要小。3.溶解度利用蛋白質(zhì)的溶解度的差別來(lái)分別各種蛋白質(zhì)常用的方法。影響蛋白質(zhì)溶解度的外界因素很多，其中主要有：溶液的pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度，但在同一的特定外界條件下，不同的蛋白質(zhì)具有不同的溶解度。適當(dāng)改變外界條件，控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度1pH控制和等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)一般較不易溶解。2蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析3有機(jī)溶劑分級(jí)法蛋白質(zhì)在不同的溶劑中的溶解度有很大不同，從基本不溶（VL0〃g/ml）直至極易溶解（＞300mg/ml）不等。影響蛋白質(zhì)溶解度的可變因素包括溫度、pH、溶劑的極性、離子性質(zhì)和離子強(qiáng)度。引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同，故控制有機(jī)溶劑的濃度可分離蛋白質(zhì)。水溶性非離子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白質(zhì)的沉淀。4溫度不同的蛋白質(zhì)在不同的溫度具有不同的溶解度和活性。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，故分離操作一般在0°C或更低溫度下進(jìn)行。電荷蛋白質(zhì)凈電荷取決于氨基酸殘基所帶的正負(fù)電荷的總和，如中性溶液中帶凈負(fù)電荷則稱(chēng)為酸性蛋白質(zhì)，1電泳不僅是分離蛋白質(zhì)混合物和鑒定蛋白質(zhì)純度的重要手段，而且也是研究蛋白質(zhì)性質(zhì)很有用的方法。等電聚焦分辨率很高，pl有0.02pH的差異就能分開(kāi)。2D分離蛋白質(zhì)分辨率已經(jīng)發(fā)展到100000個(gè)蛋白點(diǎn)。2離子交換層析改變蛋白質(zhì)混合物溶液中的鹽離子強(qiáng)度、pH和（陰、陽(yáng)）離子交換填料，不同蛋白質(zhì)對(duì)不同的離子交換填料的吸附容量不同，蛋白質(zhì)因吸附容量不同或不被吸附而分離。洗脫可采用保持洗脫劑成分一直不變，也可采用改變洗脫劑的鹽度或pH的方法洗脫，后一種可分分段洗脫和梯度洗脫。梯度洗脫一般效果好，分辨率高，特別是使用交換容量小，對(duì)鹽濃度敏感的離子交換劑，多用梯度洗脫?？刂葡疵搫┑捏w積（與柱床體體積相比）、鹽濃度和pH，樣品組分能從離子交換柱上分別洗脫下來(lái)。蛋白分子暴露在外表面的側(cè)鏈基團(tuán)的種類(lèi)和數(shù)量不同，故在一定的PH值和離子強(qiáng)度的緩沖液的所帶的電荷不同電荷分布電荷的氨基酸殘基可均勻地分布于蛋白質(zhì)的表面，既可以適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度與陽(yáng)離子交換柱結(jié)合也能以適當(dāng)強(qiáng)度與陰離子結(jié)合，因多數(shù)蛋白質(zhì)都有不能在單一的溶劑條件下同時(shí)與兩種類(lèi)型的離子交換柱結(jié)合，故可得用此性質(zhì)純化；電荷的氨基酸殘基亦可成簇分布，使某一區(qū)域帶強(qiáng)正電荷而另一區(qū)域帶強(qiáng)負(fù)電荷，呈強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性，只能在極端pH與陽(yáng)離子交換樹(shù)脂或陰離子交換樹(shù)脂結(jié)合，如鈣調(diào)蛋白只能在pH2時(shí)與陽(yáng)離子交換樹(shù)脂結(jié)合。疏水性多數(shù)疏水性的氨基酸殘基藏在蛋白質(zhì)的內(nèi)部，但也有一些在表面。蛋白質(zhì)表面的疏水性氨基酸殘基的數(shù)目和空間分布決定了該蛋白質(zhì)是否具有與疏水柱填料結(jié)合從而利用它來(lái)進(jìn)行分離的能力。因其廉價(jià)和純化后的蛋白質(zhì)具有生物活性，是一種通用性的分離和純化蛋白質(zhì)的工具。高濃度鹽水溶液中蛋白質(zhì)在柱上保留，在低鹽或水溶液中蛋白質(zhì)從柱上被洗脫，故特別適用于濃硫酸銨溶液沉淀分離后的母液以及該沉淀用鹽溶解后的含有目標(biāo)產(chǎn)品的溶液直接進(jìn)樣到柱上，當(dāng)然也適用7mol/鹽酸胍或8mol/L脲的大腸桿菌的治療蛋白質(zhì)提取液直接進(jìn)樣到柱上，在分離的同時(shí)也進(jìn)行了復(fù)性。密度多數(shù)蛋白質(zhì)的密度在1.3~1.4g/cm3之間，分級(jí)分離蛋白質(zhì)時(shí)一般不常用此性質(zhì)，不過(guò)對(duì)含有大量磷酸鹽或脂質(zhì)的蛋白質(zhì)與一般蛋白質(zhì)在密度上明顯不同，可用密度梯度法離心與大部分蛋白質(zhì)分離?；蚬こ虡?gòu)建的純化標(biāo)記通過(guò)改變cDNA在被表達(dá)的蛋白的氨基端或羧基端加入少許幾個(gè)額外氨基酸，這個(gè)加入的標(biāo)記可用來(lái)作為一個(gè)有效的純化依據(jù)。8.1GST融合載體使要表達(dá)的蛋白質(zhì)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶一起表達(dá)，然后利用GlutathioneSepharose4B作親和純化，再利用凝血酶或因子X(jué)a切開(kāi)。8.2蛋白A融合載體使要表達(dá)的蛋白和蛋白A的IgG結(jié)合部位融合在一起表達(dá)，以IgGSepharose純化。3含組氨酸標(biāo)記(Histidine-tagged)ChelatingSepharose最通行的標(biāo)記之一，是在蛋白質(zhì)的氨基端加上6~10個(gè)組氨酸，在一般或變性條件(如8M尿素)下借助它能與Ni2+螯合柱緊緊結(jié)合的能力，用咪唑洗脫，或?qū)H降至5.9使組氨酸充分質(zhì)子化，不再與結(jié)合Ni2+使之得以純化。重組蛋白在設(shè)計(jì)、構(gòu)建時(shí)已融入純化構(gòu)想。樣品多夾雜了破碎細(xì)胞或可溶產(chǎn)物，擴(kuò)張床吸附技術(shù)STREAmlINE適合做粗分離。親和能力結(jié)合效率高，分離速度快的特點(diǎn)。配基可是酶的底物、抑制劑、輔因子、特異性的抗體、吸附后可改變緩沖液的離子強(qiáng)度和PH的方法，洗耳恭聽(tīng)脫下來(lái)，也可用更高濃度的同一配體溶液或親和力更強(qiáng)的配體溶液洗脫親和層析固定相的配基與生物分子之間的特殊的生物大分子親和能力不同來(lái)進(jìn)行相互分離的，依親和選擇性的高低分為：基團(tuán)性親和層析，固定相上的配基對(duì)一類(lèi)基團(tuán)的極強(qiáng)的親和力。如含有糖基的一類(lèi)蛋白質(zhì)或糖蛋白對(duì)三嗪染料顯示特別強(qiáng)的吸附能力；高選擇性(專(zhuān)一性)親和層析，配基僅對(duì)某一種蛋白質(zhì)有特別強(qiáng)的親和性。如單克隆抗體對(duì)抗原的特異性的吸附。親和層析除特異性的吸附外，仍然會(huì)因分子的錯(cuò)誤認(rèn)別和分子間非選擇性的作用力而吸附一些雜蛋白質(zhì)，另洗脫過(guò)程中的配體不可避免的脫落進(jìn)入分離體系。與超濾結(jié)合起來(lái)，將兩者優(yōu)點(diǎn)集中形成超濾親和純化，具有高分離效率和大規(guī)模工業(yè)化的優(yōu)點(diǎn)，適用于初分離。按配基的不同可分為：金屬螯合介質(zhì)過(guò)渡金屬離子Cu2+、Zn2+和Ni2+等以亞胺絡(luò)合物的形式鍵合到因定相上，由于這些金屬離子與色氨酸、組氨酸和半胱氨酸之間形成了配價(jià)鍵，從而形成了亞胺金屬一蛋白螯合物，使含有這些氨基酸的蛋白被這種金屬螯合親和色譜的固定相吸附。螯合物的穩(wěn)定性受單個(gè)組氨酸和半胱氨酸解離常數(shù)所控制，從而亦受流動(dòng)相的pH和溫度的影響，控制條件可以使不同蛋白質(zhì)相互分離。小配體親和介質(zhì)配體有精氨酸、苯甲酰胺、鈣調(diào)因子、明膠、肝素和賴(lài)氨酸等等?？贵w親和介質(zhì)即免疫親和層析，配體有重組蛋白A和重組蛋白G，但蛋白A比蛋白G專(zhuān)一，蛋白G能結(jié)合更多不同源的IgG。（4） 顏料親和介質(zhì)染料層析的效果除主要取決于染料配基與酶的親和力大小外，還與洗脫緩沖液的種類(lèi)、離子強(qiáng)度、PH值及待分離的樣品的純度有關(guān)。配體有CibacronBlue和ProcionRed兩種。在一定的條件下，固定化的染料能起陽(yáng)離子交換劑的作用，為了避免此現(xiàn)象的發(fā)生，最好要離子強(qiáng)度小于0。1和PH大于7時(shí)操作。（5） 外源凝集素親和介質(zhì)配體有刀豆球蛋白、扁豆外源凝集素和麥芽外源凝集素，固相外源凝集素能和數(shù)種糖類(lèi)殘基發(fā)生可逆反應(yīng)，適合純化多糖、糖蛋白。非極性基團(tuán)之間作用力溶質(zhì)分子中的非極性基團(tuán)與非極性固定相間的相互作用力（非選擇性分散力或倫敦力）大小與溶質(zhì)分子極性基團(tuán)與流動(dòng)力相中極性分子在相反方向上相互作用力的差異進(jìn)行分離。因其流動(dòng)相中的置換劑是極性小于水的有機(jī)溶劑（如甲醇、乙腈、四氫呋喃等），這些有機(jī)溶劑可能使許多蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生不可逆的變性；流動(dòng)相中須有離子對(duì)試劑（如三氟乙酸、甲酸、磷酸等）存在才可使分離有效地進(jìn)行和獲得高的質(zhì)量回收率；分離須在酸性介質(zhì)中進(jìn)行（一般pH在2~3之間），又有一些蛋白質(zhì)會(huì)在后兩種條件下產(chǎn)生不可逆的分子構(gòu)象變化，故在生物大分子中人分離純化中受到限制，但分子構(gòu)象變化可逆的蛋白質(zhì)而言是有效的方法。正相色譜在生物大分子中的分離和純化中應(yīng)用相對(duì)較少，因所用的溶劑很貴。可逆性締合在某些溶液條件下，有一些酶能聚合成二聚體、四聚體等，而在另一種條件下則形成單體，如相繼在這兩種不同的條件下按大小就可以進(jìn)行分級(jí)分離。穩(wěn)定性12.1熱穩(wěn)定性大多數(shù)蛋白質(zhì)加熱到95r時(shí)會(huì)解折疊或沉淀，利用這一性質(zhì)，可容易地將一種經(jīng)這樣加熱后仍保持其可溶性活性的蛋白質(zhì)從大部分其它細(xì)胞蛋白質(zhì)中分離開(kāi)。2蛋白酶解穩(wěn)定性用蛋白酶處理上清液，消化雜蛋白，留下抗蛋白酶解抗性蛋白質(zhì)。分配系數(shù)即利用雙水相萃取分離，常用的生物物質(zhì)分離體系有：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（DEXTRAN）＞PEG/磷酸鹽、PEG/硫酸銨等。由于具有含水比例高、選用的聚合物及鹽對(duì)酶無(wú)毒性、分離設(shè)備與化學(xué)工業(yè)通用等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)上目益受重視。分配行為受聚合物分子大小、成相濃度、PH、無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)等因素影響發(fā)展：具有親和雙水相萃取及膜分離雙水相萃取等新型雙水相分離技術(shù)。雙向水溶液系統(tǒng)的蛋白質(zhì)純化一些與水混合多聚物的不相溶性導(dǎo)致依賴(lài)于多聚物濃度的兩相系統(tǒng)的液-液分配技術(shù)，可以由兩不同的高水溶性的多聚物或一種多聚物各一種鹽，用于從微生物勻漿中除支細(xì)胞碎片、后續(xù)分配步驟進(jìn)一步純化。分離的選擇性一般隨著分離分子或顆粒大小面增加。表面活性14.1泡沫分離蛋白質(zhì)溶液具有表面活性，氣體在溶液中鼓泡，氣泡與液相主體分離，在塔頂富集，達(dá)到分離和濃縮的目的。14.2反膠團(tuán)相轉(zhuǎn)移法反膠團(tuán)相轉(zhuǎn)移法是80年代興起的一種新型分離技術(shù)，它利用表面活性劑分子在有機(jī)溶劑中自發(fā)形成的反向膠團(tuán)（反膠團(tuán)），在一定條件下將水溶性蛋白質(zhì)分子增溶進(jìn)反膠團(tuán)的極性核（水池）中，再創(chuàng)造條件將蛋白質(zhì)抽提至另一水相，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的相轉(zhuǎn)移，達(dá)到分離和提純蛋白質(zhì)的目的。反膠團(tuán)中的蛋白質(zhì)分子受到周?chē)肿雍捅砻婊钚詣O性頭的保護(hù)，仍保持一定的活性，甚至表現(xiàn)出超活性。由于蛋白質(zhì)增溶于反膠團(tuán)與蛋白質(zhì)所帶電荷及反膠團(tuán)內(nèi)表面電荷間的靜電作用及反膠團(tuán)的大小有關(guān)，因而表面活性劑的種類(lèi)、水溶液的pH值及離子強(qiáng)度等因素均影響反膠團(tuán)對(duì)蛋白質(zhì)的相轉(zhuǎn)移。據(jù)報(bào)道利用AOT/異辛烷反膠團(tuán)對(duì)酵母脂肪酶進(jìn)行相轉(zhuǎn)移。14.3聚合物-鹽-水液-固苯取體系是90年代在國(guó)內(nèi)開(kāi)發(fā)的種新的萃取體系，成功地用于萃取金屬離子及卞果酸脫氫酶等生物活性物質(zhì)較強(qiáng)的吸附及乳化作用等缺陷，成相容易成相后直接傾出液相即可使液固的相分離，勿需特殊技術(shù)處理，不用有機(jī)溶劑，無(wú)毒性，成相聚合物及鹽對(duì)生物活性物質(zhì)有穩(wěn)定和保護(hù)作用，萃取分離選擇性好消耗低、易于規(guī)模放大的分離生隊(duì)物活件物質(zhì)的新技術(shù)在聚乙二醇修飾物的聚乙二醇/葡聚糖雙水相萃取體系共價(jià)作用：主要用于含巰基酶的純化，通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合在層析介質(zhì)上，偶聯(lián)是可逆的，能還原二硫鍵的低分子化合物洗脫，如空間位阻，可在含變性劑的緩沖液時(shí)吸附，如已含二硫鍵，則先用還原劑打開(kāi)。蛋白質(zhì)純化的一般原則及方法選擇蛋白質(zhì)純化技術(shù)指南隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的科研人員熟練掌握了分子生物學(xué)的各種試驗(yàn)技術(shù)，并研制成套試劑盒，使基因克隆表達(dá)變得越來(lái)越容易111。但分子生物學(xué)的上游工作往往并非是最終目的，分子克隆與表達(dá)的關(guān)鍵是要拿到純的表達(dá)產(chǎn)物，以研究其生物學(xué)作用，或者大量生產(chǎn)出可用于疾病治療的生物制品。相對(duì)與上游工作來(lái)說(shuō)，分子克隆的下游工作顯得更難，蛋白純化工作非常復(fù)雜，除了要保證純度外，蛋白產(chǎn)品還必須保持其生物學(xué)活性。純化工藝必須能夠每次都能產(chǎn)生相同數(shù)量和質(zhì)量的蛋白，重復(fù)性良好。這就要求應(yīng)用適應(yīng)性非常強(qiáng)的方法而不是用能得到純蛋白的最好方法去純化蛋白。在實(shí)驗(yàn)室條件下的好方法卻可能在大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用中失敗，因?yàn)楹笳咭笠?guī)模化，且在每日的應(yīng)用中要有很好的重復(fù)性。本文綜述了蛋白質(zhì)純化的基本原則和各種蛋白純化技術(shù)的原理、優(yōu)點(diǎn)及局限性，以期對(duì)蛋白純化的方法選擇及整體方案的制定提供一定的指導(dǎo)。1蛋白純化的一般原則蛋白純化要利用不同蛋白間內(nèi)在的相似性與差異，利用各種蛋白間的相似性來(lái)除去非蛋白物質(zhì)的污染，而利用各蛋白質(zhì)的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來(lái)。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學(xué)活性都會(huì)有差異，利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來(lái)得到重組蛋白。蛋白的純化大致分為粗分離階段和精細(xì)純化階段二個(gè)階段。粗分離階段主要將目的蛋白和其他細(xì)胞成分如DNA、RNA等分開(kāi)，由于此時(shí)樣本體積大、成分雜，要求所用的樹(shù)脂高容量、高流速，顆粒大、粒徑分布寬.并可以迅速將蛋白與污染物分開(kāi)，防止目的蛋白被降解。精細(xì)純化階段則需要更高的分辨率，此階段是要把目的蛋白與那些大小及理化性質(zhì)接近的蛋白區(qū)分開(kāi)來(lái)，要用更小的樹(shù)脂顆粒以提高分辨常用的離子交換柱和疏水柱，應(yīng)用時(shí)要綜合考慮樹(shù)脂的選擇性和柱效兩個(gè)因素。選擇性指樹(shù)脂與目的蛋白結(jié)合的特異性，柱效則是指蛋白的各成分逐個(gè)從樹(shù)脂上集中洗脫的能力，洗脫峰越窄，柱效越好。僅有好的選擇性，洗脫峰太寬，蛋白照樣不能有效分離。各種蛋白純化方法及優(yōu)缺點(diǎn)2.1蛋白沉淀蛋白能溶于水是因?yàn)槠浔砻嬗杏H水性氨基酸。在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)處若溶液的離子強(qiáng)度特別高或特別低，蛋白則傾向于從溶液中析出。硫酸銨是沉淀蛋白質(zhì)最常用的鹽，因?yàn)樗诶涞木彌_液中溶解性好，冷的緩沖液有利于保護(hù)蛋白的活性。硫酸銨分餾常用做純化的第一步，它可以初步粗提蛋白質(zhì)，去除非蛋白成分。蛋白質(zhì)在硫酸銨沉淀中較穩(wěn)定，可以短期在這種狀態(tài)下保存中間產(chǎn)物，當(dāng)前蛋白質(zhì)純化多采用這種辦法進(jìn)行粗分離翻。在規(guī)?；a(chǎn)上硫酸銨沉淀方法仍存在一些問(wèn)題，硫酸銨對(duì)不銹鋼器具的腐蝕性很強(qiáng)。其他的鹽如硫酸鈉不存在這種問(wèn)題，但其純化效果不如硫酸銨。除了鹽析外蛋白還可以用多聚物如PEG和防凍劑沉淀出來(lái)，PEG是一種惰性物質(zhì)，同硫酸銨一樣對(duì)蛋白有穩(wěn)定效果，在緩慢攪拌下逐漸提高冷的蛋白溶液中的PEG濃度，蛋白沉淀可通過(guò)離心或過(guò)濾獲得，蛋白可在這種狀態(tài)下長(zhǎng)期保存而不損壞。蛋白沉淀對(duì)蛋白純化來(lái)說(shuō)并不是多么好的方法，因?yàn)樗荒苓_(dá)到幾倍的純化效果，而我們?cè)谶_(dá)到目的前需要上千倍的純化。其好處是可以把蛋白從混雜有蛋白酶和其他有害雜質(zhì)的培養(yǎng)基及細(xì)胞裂解物中解脫出來(lái)。2.2緩沖液的更換雖然更換緩沖液不能提高蛋白純度，但它卻在蛋白純化方案中起著極其重要的作用。不同的蛋白純化方法需要不同pH及不同離子強(qiáng)度的緩沖液。假如你用硫酸銨將蛋白沉淀出來(lái)，毫無(wú)疑問(wèn)蛋白是處在高鹽環(huán)境中，需要想辦法脫鹽，可用的方法有利用半透膜透析，通過(guò)勤換透析液體去除鹽分，此法尚可，但需幾個(gè)小時(shí)，通常要過(guò)夜，也難以用予大規(guī)模純化中。新型的設(shè)備將透析膜夾在兩個(gè)板中間，板的一側(cè)加緩沖液，另一側(cè)加需脫鹽的蛋白溶液，并在蛋白溶液一側(cè)通過(guò)泵加壓，可以使兩側(cè)溶液在數(shù)小時(shí)內(nèi)達(dá)到平衡，若增加對(duì)蛋白溶液的壓力，還可迫使水分和鹽更多通過(guò)透析膜進(jìn)入透析液達(dá)到對(duì)蛋白濃縮的目的。也有出售的脫鹽柱，柱內(nèi)的填料是小孔徑的顆粒，蛋白分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，先于高濃度鹽離子從柱中流出，從而使二者分離。蛋白純化的每一步都會(huì)造成目的蛋白的丟失，緩沖液平衡的步驟尤甚。蛋白會(huì)結(jié)合在任何它能接觸的表面上，剪切力、起泡沫和離子強(qiáng)度的快速變化很容易讓蛋白失活。2.3離子交換色譜這是在所有的蛋白純化與濃縮方法中最有效方法?；诘鞍着c離子交換樹(shù)脂間的相互電荷作用，通過(guò)選擇不同的緩沖液，同一種蛋白既可以和陰離子交換樹(shù)脂(能結(jié)合帶負(fù)電荷的分子)結(jié)合，也可以和陽(yáng)離子交換樹(shù)脂結(jié)合。樹(shù)脂所用的帶電基團(tuán)有四種：二乙基氨基乙基用于弱的陰離子交換樹(shù)脂；羧甲基用于弱的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂；季銨用于強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂；甲基磺酸酯用于強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。蛋白質(zhì)由氨基酸組成，氨基酸在不同的pH環(huán)境中所帶總電荷不同。大多數(shù)蛋白在生理pH(pH6—8)下帶負(fù)電荷，需用陰離子交換柱純化，極端的pH下蛋白會(huì)變性失活.應(yīng)盡量避免。由于在某個(gè)特定的pH下不同的蛋白所帶電荷數(shù)不同，與樹(shù)脂的結(jié)合力也不同，隨著緩沖液中鹽濃度的增加或pH的變化，蛋白按結(jié)合力的強(qiáng)弱被依次洗脫。在工業(yè)化生產(chǎn)中更多地是改變鹽濃度而不是去改變pH值，因?yàn)榍罢吒菀卓刂啤Ｔ趯?shí)驗(yàn)室中幾乎總是用鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩(wěn)地上升，當(dāng)離子強(qiáng)度能夠中和蛋白的電荷時(shí)，蛋白就被從柱上洗脫下來(lái)。但在工業(yè)生產(chǎn)中鹽濃度很難精確控制，所以常用分步洗脫而不足連續(xù)升高的鹽梯度。與排阻層析相比，離子交換特異性更好，有更多的參數(shù)可以調(diào)整以獲得最優(yōu)的純化效果，樹(shù)脂也比較便宜。值得一提的是，即便是用最精確控制的條件，僅用離子交換單一的方法也得不到純的蛋白，還需要其他的純化步驟。2.4親和層析親和層析基于目的蛋白與固相化的配基特異結(jié)合而滯留，其他雜蛋白會(huì)流過(guò)柱子。本方法存在的問(wèn)題是:單抗非常昂貴，而且也需先純化;單抗與目的蛋白結(jié)合力太強(qiáng).要用苛刻的條件來(lái)洗脫，這會(huì)使目的蛋白失活并破壞單抗；混合物中的其他蛋白如蛋白酶也可能破壞抗體或與它們非特異結(jié)合;某些單抗也會(huì)在純化過(guò)程中從樹(shù)脂上解離下來(lái)混入產(chǎn)物中，也需要從終產(chǎn)物中去除。親和柱通常在純化過(guò)程的后期應(yīng)用，此時(shí)標(biāo)本體積已縮小，大部分的雜質(zhì)已經(jīng)去除。谷胱甘肽S一轉(zhuǎn)移酶(GlutathioneS—transferase，GST)是最常用的親和層析純化標(biāo)簽之一，帶有此標(biāo)簽的重組蛋白可用交聯(lián)谷胱甘肽的層析介質(zhì)純化，但本方法有以下缺點(diǎn)：首先，蛋白上的GST必須能合適地折疊，形成與谷胱甘肽結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)才能用此方法純化；其次，GST標(biāo)簽多達(dá)220個(gè)氨基酸，如此大的標(biāo)簽可能會(huì)影響表達(dá)蛋白的可溶性，使形成包涵體，這會(huì)破壞蛋白的天然結(jié)構(gòu)，難于進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，有時(shí)即便純化后再酶切去除GST標(biāo)簽也不一定能解決問(wèn)題。另一種可應(yīng)用的親和純化標(biāo)簽是6組氨酸標(biāo)簽，組氨酸的咪唑側(cè)鏈可親和結(jié)合鎳、鋅和鉆等金屬離子，在中性和弱堿性條件下帶組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白與鎳柱結(jié)合，在低pH下用咪唑競(jìng)爭(zhēng)洗脫。組氨酸標(biāo)簽與GST相比有許多優(yōu)點(diǎn)，首先，由于只有6個(gè)氨基酸，分子量很小，一般需要酶切去除：其次，可以在變性條件下純化蛋白，在高濃度的尿素和胍中仍能保持結(jié)合力；另外6組氨酸標(biāo)簽無(wú)免疫原性，重組蛋白可直接用來(lái)注射動(dòng)物，也不影響免疫學(xué)分析。雖然有這么多的優(yōu)點(diǎn)，但此標(biāo)簽仍有不足，如目的蛋白易形成包涵體、難以溶解、穩(wěn)定性差及錯(cuò)誤折疊等。鎳柱純化時(shí)金屬鎳離子容易脫落漏出混入蛋白溶液，不但會(huì)通過(guò)氧化破壞目的蛋白的氨基酸側(cè)鏈，而且柱子也會(huì)非特異吸附蛋白質(zhì)，影響純化效果。若目的蛋白可與某種碳水化合物特異結(jié)合，或者需要某種特殊的輔因子，可將該碳水化合物或輔因子固相化制成親和柱，結(jié)合后目的蛋白可用高濃度的碳水化合物或輔因子洗脫。2.5疏水作用層析蛋白是由疏水性和親水性氨基酸組成'的。疏水性氨基酸位于蛋白空間結(jié)構(gòu)的中心部位，遠(yuǎn)離表面的水分子。親水性氨基酸殘基則位于蛋白表面。由于親水性氨基酸吸引了許多的水分子，所以通常情況下整個(gè)蛋白分子被水分子包圍著，疏水性氨基酸不會(huì)暴露在外。在高鹽濃度的環(huán)境中蛋白的疏水性區(qū)域則會(huì)暴露并與疏水性介質(zhì)表面的疏水性配基結(jié)合。不同的蛋白疏水性不同，與疏水作用力大小也不同，通過(guò)逐漸降低緩沖液中鹽濃度沖洗柱子，在鹽濃度很低時(shí)，蛋白恢復(fù)自然狀態(tài)，疏水作用力減弱被洗脫出來(lái)。疏水性樹(shù)脂的選擇性是由疏水性配基的結(jié)構(gòu)決定的，常用的直鏈配體為烷基配體(alkylligands)和芳基配體(arylligands)，鏈越長(zhǎng)結(jié)合蛋白的能力也越強(qiáng)。理想樹(shù)脂種類(lèi)的選擇應(yīng)根據(jù)目的蛋白的化學(xué)性質(zhì)而定，不能選擇結(jié)合力太強(qiáng)的樹(shù)脂，結(jié)合力太強(qiáng)的樹(shù)脂會(huì)很難洗脫，所以開(kāi)始時(shí)應(yīng)選用中等結(jié)合力的苯基樹(shù)脂探討條件。為了使選擇合適的介質(zhì)更容易，AmershamBiosciences推出了疏水作用樹(shù)脂選擇試劑盒，里面包括5種不同的樹(shù)脂供比較。疏水層析很適合作為離子交換純化的下一個(gè)步驟，因?yàn)槭杷饔脤游鲈诟啕}濃度下上樣，從離子交換得到的產(chǎn)物不需更換緩沖液即可使用。蛋白又在低鹽緩沖液中洗脫，又省去了下一步純化前的更換緩沖液的步驟，既節(jié)約了時(shí)間，又減少了蛋白的丟失。2.6排阻層析也叫凝膠過(guò)濾或分子篩。排阻層析柱的填充顆粒是多孔的介質(zhì)，柱中圍繞著顆粒所能容納的液體量叫流動(dòng)相，也稱(chēng)無(wú)效體積。太大的蛋白不能進(jìn)入顆粒的孔內(nèi)，只能存在于無(wú)效體積的溶液中，將會(huì)最早從柱中洗脫出來(lái)，對(duì)這部分蛋白無(wú)純化效果。由于各種蛋白的分子大小不同，擴(kuò)散進(jìn)入特定大小孔徑顆粒內(nèi)的能力也各異。大的蛋白分子會(huì)被先洗脫出來(lái)，分子越小，洗脫出來(lái)的越晚。為得到最佳的純化效果，應(yīng)將孔徑大小選在目的蛋白能在無(wú)效體積和總柱床體積的中點(diǎn)附近洗脫。排阻層析有其他方法所不具備的優(yōu)點(diǎn)，首先所能純化的蛋白分子量范圍寬，TosohBiosep公司的聚合物樹(shù)脂，排阻極限可達(dá)20o000kD；其次，樹(shù)脂微孔的形狀適合分離球形的蛋白質(zhì)，純化過(guò)程中也不需要能引起蛋白變性的有機(jī)溶劑。應(yīng)該注意的是某些蛋白不適合用凝膠過(guò)濾純化，因?yàn)楸炯夹g(shù)所用樹(shù)脂有輕度的親水性，電荷密度較高的蛋白容易吸附在上面。排阻層析從不用于純化過(guò)程的早期，因?yàn)檫@種方法要求標(biāo)本高度濃縮，上樣量只能在柱體積的1%--4%之間，柱子要細(xì)而長(zhǎng)才能得到好的分離效果，樹(shù)脂本身也比較昂貴，規(guī)?；墓I(yè)生產(chǎn)中不太適用。2.7丙烯酰胺凝膠電泳通常用來(lái)查看蛋白混合物樣品的復(fù)雜程度和監(jiān)測(cè)純化效果。這種方法分離效果極好，可惜很難在不喪失精度情況下放大到制備規(guī)模，因?yàn)殡S著膠厚度的增加，電泳時(shí)的熱效應(yīng)會(huì)嚴(yán)重干擾蛋白的泳動(dòng)。在基礎(chǔ)研究中，有時(shí)僅需要少量的純蛋白進(jìn)行研究，如蛋白質(zhì)測(cè)序等，此時(shí)電泳純化不失為一種簡(jiǎn)便快速的好方法。丙烯酰胺凝膠電泳也是蛋白純化過(guò)程中重要的分析工具，可以檢測(cè)目的蛋白是在哪個(gè)梯度的離子交換柱鹽洗脫液中；可用來(lái)判定近年來(lái)隨著各學(xué)科的迅猛發(fā)展，對(duì)蛋白純化技術(shù)的需求不斷增長(zhǎng)，已有的純化方法被日益改進(jìn)，新型的純化方法也相繼涌現(xiàn)。羥磷灰石是磷酸鈣的結(jié)晶，由于其理化性質(zhì)不夠穩(wěn)定，結(jié)合能力差，很難用于層析。進(jìn)來(lái)Bio-Rad公司對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)，提高了鈣和磷的比例，使形成球形、多孔、性質(zhì)穩(wěn)定的陶瓷羥磷灰石顆粒，其帶正電的鈣離子和負(fù)電性的磷酸根離子可分別與蛋白的羧基及氨基結(jié)合。通過(guò)調(diào)整緩沖液的pH值，酸性及堿性氨基酸可選擇性地與此樹(shù)脂結(jié)合，改變緩沖液的鹽濃度可將蛋白洗脫分離。資料顯示，使用這種方法能使兩種等電點(diǎn)、分子量和疏水性相同的蛋白很好分離。親和純化方面，Sigma發(fā)展了利用FLAG標(biāo)簽的純化方法，F(xiàn)LAG序列為N—AspTyrLysAspAspAspAsp-Lys-G分子量小且親水性，與其融合表達(dá)的蛋白不易形成包涵體，活性也不受影響，用該公司抗FLAG抗體親和樹(shù)脂即可純化目的蛋白。蛋白質(zhì)分離純化的一般程序蛋白質(zhì)純化技術(shù)指南蛋白質(zhì)分離純化的一般程序可分為以下幾個(gè)步驟：材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎分離提純某一種蛋白質(zhì)時(shí)，首先要把蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中釋放出來(lái)并保持原來(lái)的天然狀態(tài)，不喪失活性。所以要采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。常用的破碎組織細(xì)胞的方法有：機(jī)械破碎法這種方法是利用機(jī)械力的剪切作用，使細(xì)胞破碎。常用設(shè)備有，高速組織搗碎機(jī)、勻漿器、研缽等。滲透破碎法這種方法是在低滲條件使細(xì)胞溶脹而破碎。反復(fù)凍融法生物組織經(jīng)凍結(jié)后，細(xì)胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細(xì)胞脹破。這種方法簡(jiǎn)單方便，但要注意那些對(duì)溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法。超聲波法使用超聲波震蕩器使細(xì)胞膜上所受張力不均而使細(xì)胞破碎。酶法如用溶菌酶破壞微生物細(xì)胞等。蛋白質(zhì)的抽提通常選擇適當(dāng)?shù)木彌_液溶劑把蛋白質(zhì)提取出來(lái)。抽提所用緩沖液的pH、離子強(qiáng)度、組成成分等條件的選擇應(yīng)根據(jù)欲制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等），使膜結(jié)構(gòu)破壞，利于蛋白質(zhì)與膜分離。在抽提過(guò)程中，應(yīng)注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質(zhì)的變性。蛋白質(zhì)粗制品的獲得選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分離開(kāi)來(lái)。比較方便的有效方法是根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進(jìn)行的分離。常用的有下列幾種方法：等電點(diǎn)沉淀法不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，可用等電點(diǎn)沉淀法使它們相互分離。鹽析法不同蛋白質(zhì)鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過(guò)調(diào)節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來(lái)的蛋白質(zhì)仍保持其天然性質(zhì)，并能再度溶解而不變性。有機(jī)溶劑沉淀法中性有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮，它們的介電常數(shù)比水低。能使大多數(shù)球狀蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度降低，進(jìn)而從溶液中沉淀出來(lái)，因此可用來(lái)沉淀蛋白質(zhì)。此外，有機(jī)溶劑會(huì)破壞蛋白質(zhì)表面的水化層，促使蛋白質(zhì)分子變得不穩(wěn)定而析出。由于有機(jī)溶劑會(huì)使蛋白質(zhì)變性，使用該法時(shí)，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機(jī)溶劑濃度。樣品的進(jìn)一步分離純化用等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質(zhì)一般含有其他蛋白質(zhì)雜質(zhì)，須進(jìn)一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過(guò)濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時(shí)還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品。蛋白質(zhì)純化常用方法蛋白質(zhì)純化技術(shù)指南蛋白質(zhì)純化親和層析法若表達(dá)蛋白質(zhì)上含有一段六個(gè)His的片段，而親和吸附膠上接有鎳離子，此蛋白質(zhì)會(huì)特異性地結(jié)合到吸著膠體；洗去雜質(zhì)后可imidazole洗脫目標(biāo)蛋白質(zhì)。（Pharmacia操作手冊(cè)，AffinityChromatography）o儀器設(shè)備：親和層析管柱（Bio-Rad731-1550Poly-Prepcolumn,0.8X4cm）部分收集器（另需準(zhǔn)備干凈試管約25支）藥品試劑：金屬螯合親和層析膠體（Ni-NTAagarose,QIAGEN30210）1mL?在交聯(lián)瓊脂糖凝膠上接有nitrilotriaceticacid（NTA）官能基，可以螯合鎳離子；使用前先以鎳離子飽和的。BufferB-300/0（50mMNa3PO4,pH8.0;0.3MNaCl）?使用前才添加成10mM8-mercaptoethanol.BufferB-300/20:BufferB-300/0加有20mMimidazoleBufferB-300/250:BufferB-300/0加有250mMimidazole方法步驟：1） 親和層析膠體1mL已經(jīng)裝填在管柱內(nèi)，成為一淡藍(lán)色膠柱。請(qǐng)把管柱架直在鐵架上，去除下方的填塞物，用bufferB-300/0流洗20mL后塞住出口，準(zhǔn)備注入樣本。2） 除去膠面上方的緩沖液，并取出樣本（IEX）使其回到室溫，慢慢用滴管加到親和膠體上，小心勿弄亂膠體表面；讓樣本沒(méi)入膠體中，同時(shí)收集流出液每管2.5mL.3） 待樣本全部進(jìn)入膠體后，關(guān)閉出口，再慢慢加入bufferB-300/20,打開(kāi)出口收集流出液；bufferB-300/20共流洗30mL.4） 接著以bufferB-300/250流洗30mL,方法同上，收集。5） 所有收集均定量蛋白質(zhì)并測(cè)定酶活性，取收集酶活性最高的數(shù)個(gè)，保留100pL以供分析。蛋白質(zhì)純化離子交換法各種蛋白質(zhì)分子上可能帶有不同的電性，經(jīng)過(guò)離子交換管柱，可依其分子帶電性的差異而分離開(kāi)來(lái)（Pharmacia操作手冊(cè)，IonExchange）o儀器設(shè)備：塑料管柱（Bio-RadEcono-Paccolumn732-1010,1.5X12cm）部分收集器（fractioncollector,另需準(zhǔn)備干凈試管約60支）濃縮用離心機(jī)（低速5,000rpm）及濃縮離心管Centriplus藥品試劑：DEAESephacel（膠體體積約15mL,預(yù)先以緩沖液BufferA-0平衡好）BufferA-0（如上述配法）BufferA-300溶離液：BufferA-0加有0.3MNaClBufferA-500溶離液：BufferA-0加有0.5MNaCl方法步驟：1）將Econo-Pac管柱架好，并將三向閥及軟管等組合完成。2） 震蕩DEAESephacel膠體使的懸浮，小心倒入管柱中，讓膠體慢慢沈降，在沈降過(guò)程中隨時(shí)加入bufferA-0,勿使膠體干掉。3） 待膠體沈降完全后，高度應(yīng)在15cm左右。膠柱以bufferA-0一直流洗，流速快慢可以不考慮；連接好收集器，每試管收2.5mL.離子交換法的膠體平衡極為重要，可測(cè)流出液的pH或離子濃度，看是否與bufferA-0相同，若不一樣則需要再流洗的。4） 樣本的添加方法同上述膠體過(guò)濾法，并啟動(dòng)部分收集器開(kāi)始收集，當(dāng)樣本全部沒(méi)入膠體后，再加入同體積bufferA-0.以bufferA-0流洗50mL后，去除膠體上方的緩沖液，但勿使膠體干掉。5） 然后依序以bufferA-300,bufferA-500溶離的，每批次流洗各50mL,注意更換濃度時(shí)，膠體上方勿殘存上一種溶液。6） 收集后，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析以及GUS活性測(cè)定，結(jié)果作圖。7） 收集GUS活性區(qū)，并以Centriprep-30濃縮，記得要保留100以L.8） 離子交換膠體以bufferA-0洗過(guò)50mL后，收起來(lái)交回。蛋白質(zhì)純化膠體過(guò)濾法不同大小的蛋白質(zhì)分子進(jìn)入膠體過(guò)濾管柱，可依其分子量差異分離；是一種廣泛應(yīng)用的partition色析法（Pharmacia操作手冊(cè)，GelFiltration）。儀器設(shè)備：色析管柱（PharmaciaCcolumn,1.6X100cm）、鐵架、鐵夾及水平儀；部分收集器（fractioncollector,需準(zhǔn)備干凈試管約100支）；濃縮用離心機(jī)（低速5,000rpm）；濃縮用離心管Centriprep-30（Amicon4322）請(qǐng)注意其使用方法藥品試劑：膠體SephacrylS-300（Pharmacia）：a.預(yù)先以緩沖液bufferA-150平衡好，并且使完全沈降后的膠體體積，占全部體積的七至八成；要先預(yù)估好膠體的使用量。b.膠體溫度要與操作場(chǎng)所的溫度一致，否則溫度變化會(huì)產(chǎn)生氣泡。c.Sephacryl系列膠體有相當(dāng)大的吸附力，因此要在緩沖液加入0.15M以上的NaCl以除去非專(zhuān)一性吸附。BufferA-150:注意使用時(shí)的溫度要與管柱膠體的溫度一致標(biāo)準(zhǔn)分子量組合（Bio-Rad151-1901）：溶于1mL后每組取0.4mL.含有thyroglobulin（670kD），bovinegammaglobulin（158kD），chickenovalbumin（44kD），e