實驗四 過碘酸雪夫反應

實驗四過碘酸-雪夫反應(糖原染色)

[目的要求]1．掌握本實驗的原理和臨床意義。2．熟悉本實驗的操作方法及注意事項。[實驗原理]糖原中的1，2-乙二醇基經(jīng)高碘酸氧化后產(chǎn)生醛基，此醛基進而與雪夫(Schiff)液作用，使無色品紅變?yōu)榧t色的化合物，定位于胞漿中。[實驗器材和試劑]1．10g／L高碘酸液2．雪夫(Schiff)染液3．亞硫酸液4．20g／L甲綠5．染色架、洗耳球、接水盤及吸水紙。6．光學顯微鏡、香柏油、乙醚和擦鏡紙。當前第1頁\共有28頁\編于星期四\17點當前第2頁\共有28頁\編于星期四\17點當前第3頁\共有28頁\編于星期四\17點當前第4頁\共有28頁\編于星期四\17點[實驗步驟]

1．新鮮血片或骨髓片用95％乙醇固定10min，蒸餾水沖洗，待干。2．10g／L高碘酸氧化15～20min，蒸餾水沖洗，待干。3．置雪夫試液室溫染色30～60min。4．用亞硫酸溶液沖洗3次后，以自來水沖洗2～3min，待干。5．20g／L甲綠復染10～20min。6．水洗，待干，鏡檢。7．結(jié)果(1)陽性反應：在細胞漿內(nèi)染紅色，呈彌漫狀、顆?；驂K狀。胞核染成綠色。陰性反應，胞漿無色。(2)反應強度判斷標準：①中性粒細胞的分級標準：(－)胞漿無紅色顆粒。(+)胞漿內(nèi)呈淡紅色有極少顆粒。(++)胞漿呈紅色，厚而不透明，或有較少顆粒。(+++)胞漿呈深紅色，顆粒緊密，但尚有空隙。(++++)胞漿呈深紫紅色，顆粒緊密，無空隙。

當前第5頁\共有28頁\編于星期四\17點②淋巴細胞分級標準：(－)胞漿內(nèi)無顆粒。(+)胞漿內(nèi)呈彌散淡紅或有少數(shù)細顆粒(<9個)。(++)胞漿內(nèi)呈彌散較深的紅色或有多數(shù)細顆粒(>10個)。(+++)胞漿內(nèi)有較粗顆?；蛏贁?shù)小塊狀。(++++)胞漿內(nèi)呈多數(shù)粗顆粒并有大塊紅色物質(zhì)。

③幼紅細胞的分級標準：(－)胞漿內(nèi)無顆粒。(+)胞漿內(nèi)有少數(shù)分散細小顆粒或淺紅色彌漫物質(zhì)。(++)胞漿內(nèi)有1～10個中等顆粒或彌漫的紅色。(+++)胞漿內(nèi)有11～20個較粗顆?；虺噬罴t色。(++++)胞漿顆粒較多，20個以上，并且粗，致密且呈紫紅色。當前第6頁\共有28頁\編于星期四\17點④巨核細胞的分級標準：(－)細胞內(nèi)沒有糖原，但細胞漿內(nèi)有彌散性著色，此系其它多糖類物質(zhì)。(+)含少量糖原，即含數(shù)小塊或一大塊糖原，糖原常定位于近核膜處。(++)胞漿內(nèi)含有中等糖原，即含許多小塊或少數(shù)大塊糖原，約占胞質(zhì)的1/3。(+++)胞漿內(nèi)含有大量糖原，呈大塊狀，其總面積約占胞漿面積的1/2以上。（＋＋＋＋）胞漿內(nèi)充滿糖原。(3)陽性率和陽性積分：根據(jù)不同情況的需要，觀察同一類細胞100個，求出陽性率的百分比，將百分率與分級數(shù)的積相加，其總和即為積分。當前第7頁\共有28頁\編于星期四\17點當前第8頁\共有28頁\編于星期四\17點當前第9頁\共有28頁\編于星期四\17點當前第10頁\共有28頁\編于星期四\17點當前第11頁\共有28頁\編于星期四\17點當前第12頁\共有28頁\編于星期四\17點當前第13頁\共有28頁\編于星期四\17點實驗五過氧化物酶(POX)染色[目的要求]1．

掌握本實驗的原理和臨床意義。2．

熟悉本實驗的操作方法及注意事項。[實驗原理]

細胞內(nèi)的過氧化物酶能將底物的過氧化氫分解，產(chǎn)生新生態(tài)氧。后者將試劑中的聯(lián)苯胺氧化為聯(lián)苯胺藍，它是一種不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，再與亞硝基鐵氰化鈉結(jié)合進而生成藍黑色化合物沉淀于酶的所在部位。當前第14頁\共有28頁\編于星期四\17點[實驗器材和試劑]1.0.3％聯(lián)苯胺乙醇溶液聯(lián)苯胺0.3g88％乙醇加至100ml2.360g／L亞硝基鐵氰化鈉飽和液

3.稀過氧化氫液（新鮮配制）3％過氧化氫0.3ml蒸餾水25ml

4.瑞氏染液、PH6.4～6.8磷酸鹽緩沖液。5.光學顯微鏡、香柏油、乙醚和擦鏡紙。6.染色架、洗耳球、接水盤及吸水紙。當前第15頁\共有28頁\編于星期四\17點[實驗步驟]

1ml，360g／L亞硝基鐵氰化鈉飽和液10μl，混勻。2.于新鮮干燥血涂片或骨髓片上滴加上述混合液0.5ml，使蓋滿整個血膜，作用1～2min。3.滴加等量的稀過氧化氫液，混勻，染4～8min。4.勿傾去染液，直接用水沖洗。5.干燥后再用瑞氏染液復染。6.結(jié)果在細胞的胞漿中出現(xiàn)藍色或藍黑色顆粒為陽性反應。

陽性反應強度的判斷：陰性：無顆粒。弱陽性：顆粒小，分布稀疏。陽性：顆粒略粗，分布較密集。強陽性：顆粒粗大。當前第16頁\共有28頁\編于星期四\17點當前第17頁\共有28頁\編于星期四\17點實驗六堿性磷酸酶（NAP）染色

[目的要求]1．

掌握本實驗的原理和臨床意義。2．

熟悉本實驗的操作方法及注意事項。[實驗原理]中性粒細胞胞質(zhì)內(nèi)的堿性磷酸酶在PH9.6的堿性條件下能水解磷酸萘酚，生成萘酚，后者與重氮鹽偶聯(lián)形成不溶性的有色沉淀定位于胞漿中的酶活性處。當前第18頁\共有28頁\編于星期四\17點[實驗步驟]

1．取新鮮血片自然干燥后放入95％乙醇液固定10min，用流水沖洗，待干。2．取基質(zhì)液，預溫至37℃，將血片置入，繼續(xù)溫育4～6h。3．滴加20g／L硝酸鈷，作用5min，蒸餾水沖洗。4．滴加20g／L硫化銨，作用5min，蒸餾水沖洗。5．用20g／L甲綠水溶液復染2～3min或用10g／L伊紅復染3～5min。6．水洗，待干，鏡檢。7．結(jié)果(1)正常人的血細胞堿性磷酸酶除中性成熟粒細胞(桿狀核及分葉核)可見陽性外，其它細胞均呈陰性。(2)判斷標準及分級：(-)0分：胞漿呈淡紅色，無任何棕黑色顆粒。(+)1分：胞漿呈均勻淺色，無顆?；蛴猩倭孔睾谏w粒，但不超過胞漿總面積的1／4。(++)2分：全部胞漿呈均勻棕黑色或出現(xiàn)較粗的黑色顆粒，不超過胞漿1／2。(+++)3分：胞漿中已基本充滿棕黑色顆粒，但密度較低。(++++)4分：全部胞漿充滿粗大棕黑色顆粒而呈深黑色甚至掩蓋其胞核。(3)計算積分值：油鏡下計數(shù)100個中性桿狀核、分葉核粒細胞，分別記錄其分級情況，全部陽性反應細胞之和即陽性率。將得出各種積分的百分率乘以該積分數(shù)，然后相加即為總積分。當前第19頁\共有28頁\編于星期四\17點實驗七鐵染色

[目的要求]1．掌握本實驗的原理和臨床意義。2．熟悉本實驗的操作方法及注意事項。[實驗原理]

骨髓小粒中的含鐵血黃素稱細胞外鐵，其中的三價鐵與分子中的蛋白質(zhì)結(jié)合不牢，經(jīng)稀鹽酸處理后而游離，并能在酸性亞鐵氰化鉀溶液中產(chǎn)生普魯士藍反應。細胞內(nèi)鐵也可用此法顯示。根據(jù)反應的強弱了解骨髓中鐵的含量。[實驗器材和試劑]1.甲醇2．200g/L亞鐵氰化鉀溶液3．濃鹽酸4.2g/L核固紅-硫酸鋁溶液當前第20頁\共有28頁\編于星期四\17點[實驗步驟]1．選髓粒豐富的骨髓片，用甲醇固定10min。配制酸性亞鐵氰化鉀溶液：200g/L亞鐵氰化鉀溶液5份濃鹽酸1份3．玻片上滴滿酸性亞鐵氰化鉀溶液，染色30min。4．用蒸餾水沖洗后用2g/L核固紅-硫酸鋁溶液復染10～15min。5．流水沖洗、待干、鏡檢。6．結(jié)果(1)在紅色背景下鐵粒呈藍綠色。(2)細胞外鐵：用低倍鏡觀察涂片，特別是涂片尾部和髓粒附近，注意翠藍色顆粒的存在，可分五級標準。(-)：無顆粒所見。(+)：有少數(shù)鐵顆?；蚺家婅F小珠。(++)：有較多的鐵顆粒和小珠。(+++)：有很多的鐵顆粒、小珠和少數(shù)小塊狀。(++++)：有極多鐵顆粒、小珠，有很多的小塊，密集成堆。當前第21頁\共有28頁\編于星期四\17點當前第22頁\共有28頁\編于星期四\17點當前第23頁\共有28頁\編于星期四\17點當前第24頁\共有28頁\編于星期四\17點當前第25頁\共有28頁\編于星期四\17點當前第26頁\共有28頁\編于星期四\17點(3)細胞內(nèi)鐵：用油鏡計數(shù)100個中、晚幼紅細胞，記錄胞漿中含有藍色鐵粒的細胞(鐵粒幼紅細胞)的百分率。并根據(jù)細胞內(nèi)