實(shí)驗(yàn)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化

實(shí)驗(yàn)二大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的

制備及轉(zhuǎn)化當(dāng)前第1頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)內(nèi)容一：大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)儀器、材料、試劑實(shí)驗(yàn)步驟

1

2

3

4注意事項(xiàng)思考題

5

6當(dāng)前第2頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握感受態(tài)細(xì)胞的概念及其意義。

掌握感受態(tài)細(xì)胞的制備原理與操作方法。當(dāng)前第3頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)實(shí)驗(yàn)原理感受態(tài)：受體（或者宿主）最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時(shí)也受菌齡、外界環(huán)境因子的影響。制備感受態(tài)的細(xì)胞一般選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。常用的感受態(tài)制備方法包括KCl、CaCl2等方法；后者因?yàn)椴僮骱?jiǎn)便且符合大多數(shù)的分子克隆要求，因而被廣泛采用。當(dāng)前第4頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)

CaCl2

法的基本原理：細(xì)菌處于低溫（0℃）和低滲的CaCl2溶液中，菌體膨脹，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物黏附于菌體表面，在42℃進(jìn)行短時(shí)間的熱激處理，促進(jìn)DNA的吸收。實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)前第5頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)CaCl2

法簡(jiǎn)便易行，用CaCl2法制備的感受態(tài)細(xì)胞，可使每微克超螺旋質(zhì)粒DNA產(chǎn)生5106-2107個(gè)轉(zhuǎn)化菌落。在實(shí)際工作中，每微克有105以上的轉(zhuǎn)化菌落足以滿足一般的克隆實(shí)驗(yàn)。

制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，加入占總體積15％的無(wú)菌甘油于-70℃，可以保存半年。實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)前第6頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)提高轉(zhuǎn)化效率要考慮幾個(gè)重要因素：實(shí)驗(yàn)原理

1、細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于4℃的培養(yǎng)菌，最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。

細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600

來(lái)控制。DH5α菌株的OD600

為0.5時(shí)，細(xì)胞密度在5×107

個(gè)/ml左右。當(dāng)前第7頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)2、質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度：用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。

1ng的超螺旋態(tài)DNA即可使50μl的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)前第8頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)

3、試劑的質(zhì)量：所用的試劑，如CaCl2

等均需是最高純度的，并用超純水配制，并用微孔濾膜過(guò)濾滅菌，最好分裝保存于干燥的冷暗處。實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)前第9頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)4、防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，tip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入，為以后的篩選、鑒定帶來(lái)不必要的麻煩。實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)前第10頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)實(shí)驗(yàn)儀器、材料、試劑1、儀器：高壓滅菌鍋、恒溫水浴鍋、臺(tái)式

離心機(jī)、無(wú)菌操作臺(tái)、微量移液

器、恒溫?fù)u床；2、材料：菌種E.coliDH5α；3、試劑：LB液體培養(yǎng)基、0.1MCaCl2。當(dāng)前第11頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)

1、將E.coliDH5α單菌落接種于3mlLB培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2、取30μl液體培養(yǎng)液加入3mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃下震蕩培養(yǎng)，至光密度值OD600在0.5~0.6之間（5×107

個(gè)/ml）。

3、取1mlE.coli液體培養(yǎng)液于1.5ml的離心管中，4000rpm，4℃離心3min。實(shí)驗(yàn)步驟當(dāng)前第12頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)4、快速的吸除上清，向沉淀中加入1ml冰

冷的0.1MCaCl2溶液，使沉淀充分懸浮，動(dòng)

作要輕柔，置于冰上30min，4000rpm，4℃離心3min。5、棄上清，加入lml凍存液（含15%甘油的0.1MCaCl2溶液）溶液，使沉淀充分懸浮，以每管0.1ml的規(guī)格分裝3管，凍存于-80℃，可保存4~6個(gè)月。實(shí)驗(yàn)步驟當(dāng)前第13頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)注意事項(xiàng)1、不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)存與4℃的培養(yǎng)菌，最好從-80℃甘油保存的菌種中直接

轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。2、細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為宜，可以通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600控制。DH5α菌株的OD600為0.5時(shí)，細(xì)胞密度比

較合適。密度過(guò)高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化

效率。當(dāng)前第14頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)注意事項(xiàng)3、進(jìn)行熱激制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)要控制好

時(shí)間。4、懸浮細(xì)胞時(shí)動(dòng)作要輕柔，以免造成菌

體破裂，影響轉(zhuǎn)化。當(dāng)前第15頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)思考題1、影響感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的因素有哪

些？當(dāng)前第16頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)內(nèi)容二：質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化體篩選實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)儀器、材料、試劑實(shí)驗(yàn)步驟

1

2

3

4注意事項(xiàng)思考題

5

6當(dāng)前第17頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私廪D(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中

的意義。學(xué)習(xí)將外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞及篩

選重組子的方法。當(dāng)前第18頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)實(shí)驗(yàn)原理轉(zhuǎn)化：指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞，并使其生物學(xué)特性發(fā)生可遺傳的變化的過(guò)程，是基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

當(dāng)前第19頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)轉(zhuǎn)化的方法：

(1)化學(xué)的方法(熱激法)：使用化學(xué)試劑(如CaCl2)制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)熱激處理將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞；

(2)電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)前第20頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)用CaCl2處理大腸桿菌細(xì)胞使其處于感受態(tài)后，通過(guò)熱激處理可將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)菌中。進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞的質(zhì)粒能夠自主復(fù)制并在宿主中實(shí)現(xiàn)其攜帶基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)前第21頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)前第22頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)轉(zhuǎn)化體的篩選方法：主要用不同抗生素基因篩選。

常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等。實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)前第23頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)如果將轉(zhuǎn)化后的菌液涂在無(wú)選擇性抗生素的培養(yǎng)基平板上，會(huì)出現(xiàn)成千上萬(wàn)的細(xì)菌菌落，將難以確認(rèn)哪一個(gè)克隆含有轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒。將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)，才能較容易地篩選出轉(zhuǎn)化體，即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)前第24頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)本實(shí)驗(yàn)使用的pGEX-4T-2質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Amp)，理論上只有轉(zhuǎn)入了質(zhì)粒的大腸桿菌才能在含Amp的培養(yǎng)基生長(zhǎng)。但抗性篩選只是初步的篩選，可能仍有部分未轉(zhuǎn)進(jìn)質(zhì)粒的細(xì)菌能在抗性培養(yǎng)基上生存（假陽(yáng)性），因此還需要通過(guò)提取質(zhì)粒酶切、電泳作進(jìn)一步的鑒定。實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)前第25頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)實(shí)驗(yàn)儀器、材料、試劑1、儀器：恒溫?fù)u床，恒溫水浴鍋，電熱恒溫培養(yǎng)箱，無(wú)菌工作臺(tái)，微量移液槍。2、材料：DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒pGEX-4T23、試劑：LB液體及固體培養(yǎng)基、氨芐青霉

素Amp（50mg/ml）。當(dāng)前第26頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)實(shí)驗(yàn)步驟1、每100ul感受態(tài)細(xì)胞加入1ul質(zhì)粒DNA，

同時(shí)做一個(gè)空白對(duì)照（由第一組完成）。轉(zhuǎn)化體系100ul1ul空白對(duì)照100ul1ul感受態(tài)細(xì)胞質(zhì)粒DNA蒸餾水當(dāng)前第27頁(yè)\共有28頁(yè)\編于星期四\17點(diǎn)

2、輕輕混勻，立即放在冰上30min；