醫(yī)學(xué)專題-第五章-酶與細胞的固定化不考

第五章酶與細胞(xìbāo)的固定化游離(yóulí)酶使用中的局限性:1.提取純化繁瑣(fánsuǒ),價格昂貴2.難以重復(fù)使用3.穩(wěn)定性差第一頁，共三十二頁。編輯課件克服(kèfú)游離酶缺點的方法:1.人工(réngōng)合成酶

使用有機合成(yǒujīhéchéng)以及聚合物化學(xué)中的最新技術(shù)來合成具有像酶那樣活性的催化劑。2.酶的改性、修飾凡限制在一定的空間范圍內(nèi)并能連續(xù)反復(fù)地使用的酶都稱為固定化酶。通過適當(dāng)方法制成的不溶于水的酶都能滿足這一定義。固定化酶的優(yōu)點：可連續(xù)重復(fù)使用穩(wěn)定性高第二頁，共三十二頁。編輯課件第一節(jié)酶與細胞(xìbāo)的固定化方法一.固定化酶與細胞(xìbāo)定義：固定化酶或細胞是被限制或固定在某一局部的空間或特定的固體載體(zàitǐ)上并能發(fā)揮作用的一類酶或細胞。第三頁，共三十二頁。編輯課件(1)氨基酸生產(chǎn)，利用固定化細胞生產(chǎn)L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸。(2)抗生素生產(chǎn)，用固定化細胞生產(chǎn)桿菌素、四環(huán)素、頭孢菌素(tóubāojūnsù)等。(3)利用固定化細胞生產(chǎn)單克隆抗體、生長因子等、活性蛋白質(zhì)藥物、還可生產(chǎn)維生素B、維生素C中間體、山梨糖、氫化可的松等維生素和甾體激素系物質(zhì)。應(yīng)用(yìngyòng)：第四頁，共三十二頁。編輯課件二固定化方法(fāngfǎ)酶的催化活性主要依賴于它的特殊的高級結(jié)構(gòu)——活性中心。因此在制備固定化酶時必須嚴格操作條件(tiáojiàn)，盡可能避免酶的高級結(jié)構(gòu)受到損害。酶的固定化方法(fāngfǎ)：

吸附法、包埋法、交聯(lián)法、化學(xué)共價法以及酶的逆膠束包囊法。第五頁，共三十二頁。編輯課件吸附(xīfù)法原理(yuánlǐ)：將酶液或細胞懸浮液吸附結(jié)合到吸附劑表面。蛋白質(zhì)與載體之間的結(jié)合力相當(dāng)弱。而且在很多情況下、酶的非特異性吸附常常會引起(yǐnqǐ)部分或全部失活，高濃度的鹽溶液或底物溶液又將加速蛋白質(zhì)的脫附。因此，當(dāng)要求的固定絕對牢固時，采用吸附法是很不可靠的?？煞譃槲锢砦椒ê碗x子交換吸附法。第六頁，共三十二頁。編輯課件酶的吸附劑各種礦物質(zhì)和其他(qítā)無機載體（如：高嶺土、皂土、氧化鋁、氧化鐵,氧化鈦、磷酸鈣凝膠）纖維素粉例如．高嶺土能吸附胰凝乳蛋白酶，皂土能吸附過氧化氫酶和а-淀粉酶，磷酸鈣凝膠能吸附亮氨酸氨肽酶、淀粉酶，多孔玻璃能吸附胰蛋白酶，核糖核酸酶，能吸附葡萄糖氧化酶，覆蓋有卵磷脂或腦磷脂的二氧化硅(èryǎnghuàguī)能吸附酸性磷酸酯酶、磷酸葡萄糖變位酶等。纖維素粉也可以作為吸附劑，酶蛋白主要吸附在纖維素微晶結(jié)構(gòu)發(fā)生部分斷裂的表面(biǎomiàn)處。糖苷水解酶在纖維素上有較強的吸附，這可能是由于纖維素的多糖結(jié)構(gòu)與這些水解酶的底物(糖類物質(zhì))結(jié)構(gòu)有些相似的緣故。

目前最常用的吸附劑是離子交換劑。如，羧甲基纖維素、DEAE—纖維素，DEAE葡聚糖以及合成的陰離子和陽離子交換劑。多糖類離子交換劑的蛋白質(zhì)結(jié)合量很高，達到50—150mg酶蛋白/g載體。離子交換劑對酶的吸附主要靠靜電吸引力。缺點是當(dāng)離子強度增加或介質(zhì)的pH、溫度變化時,這種結(jié)合發(fā)生分解。考慮到生物體內(nèi)酶的天然環(huán)境主要是由蛋白質(zhì)組成，因此，人們嘗試用蛋白質(zhì)做載體固定所需的酶。最常用的蛋白質(zhì)載體是膠原蛋白。第七頁，共三十二頁。編輯課件一般膠原蛋白載體預(yù)先制成膜狀(膠原膜)，膠原膜溶脹、然后浸入酶溶液，酶滲入(shènrù)膜內(nèi)并被吸附，制成酶膜。也可以通過含有酶的膠原分散液進行電沉積制得。由這些方法制得的兩膜每克膠原可含有5—50mg酶。具體方法第八頁，共三十二頁。編輯課件2.包埋法原理：將酶包裹于凝膠格子或聚合物半透膜微膠囊中的方法稱為(chēnɡwéi)包埋法。酶被包埋后不再擴散到周圍介質(zhì)中去而底物和產(chǎn)物卻能自由擴散。優(yōu)點(yōudiǎn):具有普適性,酶在包埋過程中其分子(fēnzǐ)本身并不直接參加反應(yīng)，除了包埋過程中的化學(xué)反應(yīng)可能對酶有不利影響或者作為包埋材料的聚合物會引起酶的變性外，基本上大多數(shù)酶都能用包埋法固定。條件較溫和、酶活力回收較高。第九頁，共三十二頁。編輯課件缺點:包埋法對底物分子和產(chǎn)物分于的大小有所限制。當(dāng)?shù)孜锖彤a(chǎn)物的相對分子質(zhì)量(zhìliàng)小時，則擴散阻力小。常用的格子型包埋法載體有：海藻酸鹽、K—角叉菜、瓊脂(qióngzhī)、三醋酸纖維素和聚丙烯酰胺凝膠等。第十頁，共三十二頁。編輯課件海藻(hǎizǎo)酸鹽包埋酶或細胞的一般操作方法先將海藻酸鹽溶于水中，使其具有一定黏度，然后加入一定量的細胞菌體達到0.3克濕菌體／毫升左右，并且充分攪拌，使之分散均勻，通過注射器或毛細管將此菌體懸浮液注入含有Ca2+、Zn2+、Al3+等多價離子的溶液中，由于(yóuyú)離子轉(zhuǎn)移的膠凝作用．海藻酸鹽液滴便形成珠狀的固定化細胞顆粒。待顆粒經(jīng)過一定時間的硬化后洗凈，即可用于催化反應(yīng)。第十一頁，共三十二頁。編輯課件缺點(quēdiǎn):其一,在高濃度的電介質(zhì)(K+、Na+)等溶液中，固定化顆粒會變得不穩(wěn)定；其二,Ca+等多價離子在磷酸緩沖液中會沉淀，固定化顆粒的機械強度將降低，最后重新溶解。因此，用海藻酸鹽包埋的固定化酶或細胞(xìbāo)不能用于磷酸緩沖溶液中。優(yōu)點(yōudiǎn)：

海藻酸鹽價格便宜、來源豐富又無毒性，且操作簡便、條件溫和，目前仍是應(yīng)用較廣的包埋載體之一。第十二頁，共三十二頁。編輯課件（2）K-角叉菜糖包埋法K-角叉菜是一種含有許多硫酸根基團的多糖化合物.在K+離子存在(cúnzài)下，它能立即生成凝膠.缺點(quēdiǎn)：對高濃度的Na+離子敏感(mǐngǎn)固定化溫度高,需要在37℃~55℃。第十三頁，共三十二頁。編輯課件（3）聚丙烯酰胺凝膠

方法：在含酶(或細胞)的水溶液中，加入一定比例的單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N’甲撐雙丙烯酰胺。然后在催化劑(二甲(èrjiǎ)氨基丙腈)和引發(fā)劑(過硫酸鉀)的作用下低溫(冰浴)聚合。產(chǎn)生的聚合物凝膠便是固定化酶，它可通過機械方法分散成一定大小的粒子以供應(yīng)用。優(yōu)點(yōudiǎn)：用聚丙烯胺凝膠包埋酶，其蛋白質(zhì)的固定量較高，可達10-100mg／g單體。缺點(quēdiǎn):丙烯酰胺對酶具有變性作用第十四頁，共三十二頁。編輯課件

調(diào)節(jié)單體和交聯(lián)劑的用量可以改善聚丙烯酰胺凝膠的滲透性。在單體丙烯酰胺濃度不變時，交聯(lián)劑用量以5％為最好。此時，凝膠的有效孔徑最小，因而滲透性最小。如交聯(lián)劑含量高于5％，滲透性反而增加，不利于酶的固定。這現(xiàn)象可能(kěnéng)是由于聚合時一些線性纖維被堆積成為一股股的纖維束，因而纖維束之間的距離變寬。如果單體濃度增加．則被包埋的蛋白質(zhì)的量將增加。但是，當(dāng)單體濃度高于15％時，被包埋的酶的活性卻急劇下降。這顯然是因為丙烯酰胺對酶起著變性劑的作用。第十五頁，共三十二頁。編輯課件3.交聯(lián)法原理：交聯(lián)法是利用雙功能基團(jītuán)試劑或多功能基團(jītuán)試劑使酶發(fā)生分子間交聯(lián)因而得到固定的方法。常用的試劑：戊二醛、1．6—亞己基二異氰酸酯、雙重氮聯(lián)苯胺和乙烯(yǐxī)—馬來酸酐共聚物等。

例如：戊二醛可直接參與酶蛋白的文聯(lián)(wénlián)或者酶蛋白分子與其他惰性蛋白分子的交聯(lián)，便形成酶的蛋白質(zhì)聚結(jié)態(tài)。戊二醛也可以先與含伯胺的聚合物縮合形成多醛基聚合物載體。缺點：雙功能基團試劑與菌蛋白的交聯(lián)作用，常引起蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的改變，使酶失活。常在被交聯(lián)的酶蛋白溶液中添加一定量的輔助蛋白，避免或減少菌在交聯(lián)過程中因化學(xué)修飾造成的失活。例如牛血清蛋白和明膠等蛋白質(zhì)的加人往往能夠提高固定化酶的穩(wěn)定性。

第十六頁，共三十二頁。編輯課件4.化學(xué)(huàxué)共價法原理(yuánlǐ)：共價法就是使非水溶性載體與酶以共價鍵的形式結(jié)合。優(yōu)點：用共價法固定酶，載體(zàitǐ)與酶的結(jié)合牢固、半衰期較長。缺點：由于化學(xué)共價法結(jié)合時反應(yīng)劇烈，常常引起酶蛋白高級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此一般活性回收較低。第十七頁，共三十二頁。編輯課件能夠(nénggòu)用于共價法固定的酶蛋白上的功能基團有：1.氨基-賴氨酸上的ε-氨基以及多肽鏈N末端氨基酸上的α-氨基;2.羧基-雙羧基氨基酸:門冬氨基酸和谷氨酸上的游離羧基,以及多肽鏈末端的α-羧基;3.酪氨酸上的苯酚環(huán);4.半胱氨酸上的巰基;5.羥基(qiǎngjī)-絲氨酸,蘇氨酸以及酪氨酸上的羥基(qiǎngjī)6.組氨酸上的咪唑基;7.色氨酸上的吲哚基其中以氨基和羧基為最常用第十八頁，共三十二頁。編輯課件對于共價偶聯(lián)反應(yīng)的選擇一般應(yīng)考慮到酶蛋白上供共價結(jié)合的功能基團必須不影響酶的催化活性；反應(yīng)條件必須盡可能溫和；而且最好能在水溶液中進行反應(yīng)。偶聯(lián)反應(yīng)應(yīng)該(yīnggāi)對酶蛋白上某一類功能基團有很高的專一性，而對其他功能基團或水溶液幾乎無副反應(yīng)。共價法的主要(zhǔyào)方法：酰化反應(yīng)、芳化和烷基化反應(yīng)、溴化氰法、重氮化反應(yīng)以及硅烷基化法等。第十九頁，共三十二頁。編輯課件A?；磻?yīng)(fǎnyìng)酶蛋白上的氨基能夠與含有酰化基團，如酰化疊氮、酸酐等聚合物發(fā)生(fāshēng)偶聯(lián)，從而使酶固定。第二十頁，共三十二頁。編輯課件B芳化和烷基化反應(yīng)(fǎnyìng)酶蛋白與某些含有鹵代芳環(huán)或者鹵代雜環(huán)的聚合物相互作用，酶蛋白上的氨基通過芳化而偶聯(lián)。芳化聚合物為3—氟-4，6—二硝基苯基時第二十一頁，共三十二頁。編輯課件C溴化氫法在堿性(PH10.0一11.5）下用溴化氰使多糖類物質(zhì)(wùzhì)活化形成環(huán)化的亞氨碳酸鹽，然后此活性聚合物能在溫和的PH下與酶蛋白中氨基偶聯(lián)并使酶固定；偶聯(lián)反應(yīng)通常產(chǎn)生三種不同(bùtónɡ)的結(jié)構(gòu)1)在N位與酶偶聯(lián)的氨基甲酸酯，2)N位與酶偶聯(lián)的亞氨碳酸(tànsuān)酯，3)N位與酶偶聯(lián)的異脲。

第二十二頁，共三十二頁。編輯課件D重氮化反應(yīng)帶有芳氨基側(cè)鏈的聚合物用亞硝酸處理后可以(kěyǐ)得到含芳香族重氮化基團的活性載體當(dāng)這種活性載體與酶在pH8—9下作用時，通過酶蛋白酪氨酸殘基上的酚羥基以及組氨酸殘基上的咪唑基發(fā)生偶聯(lián)，形成相應(yīng)的偶聯(lián)化合物，從而使酶固定。第二十三頁，共三十二頁。編輯課件5.逆膠束酶反應(yīng)(fǎnyìng)系統(tǒng)

除了用固體作載體將沒固定外，近來利用逆膠束菌沒沒酶反應(yīng)系統(tǒng)進行有機相合成反應(yīng)生產(chǎn)具有工業(yè)意義的有機化合物已成為一種重要的酶技術(shù)。在這種系統(tǒng)中，酶以逆膠束的形式被“固定”，并在有機溶劑中參與反應(yīng)。因此與過去認為(rènwéi)酶只能在水溶液中進行反應(yīng)的傳統(tǒng)觀點相反，逆膠束酶作為有機相反應(yīng)的催化劑大大擴大了酶的工業(yè)應(yīng)用。1969年日本千煙一郎等通過離子交換法將氨基?；腹潭ㄔ贒EAE—葡聚糖載體上，從而制得了世界上第一個適用于工業(yè)生產(chǎn)的固定化酶。他們制得的固定化氨基酰化酶活性高，穩(wěn)定性好，可用于連續(xù)拆分?；疍L—氨基酸。第二十四頁，共三十二頁。編輯課件第二節(jié)固定化酶和固定化細胞(xìbāo)的應(yīng)用一.利用(lìyòng)固定化氨基?；干a(chǎn)L—氨基酸1.氨基酸的應(yīng)用(yìngyòng)：目前氨基酸在醫(yī)藥、食品以及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越廣。以適當(dāng)比例配成的混合液可以直接注射到人體內(nèi)，用以補充營養(yǎng)，各種“必需氨基酸”對人體的正常發(fā)育有保健作用。有些氨基酸可以作為藥物治療某些特殊疾病。氨基酸可用作增昧劑，增加香味，促進食欲；可用作禽蓄的飼料；可用來制造人造纖維、塑料等。因此氨基酸的生產(chǎn)對人類的生活具有重要意義。2.工業(yè)上用化學(xué)合成法生產(chǎn)L-氨基酸工業(yè)上生產(chǎn)L—氨基酸的一種方法是化學(xué)合成法。但是由化學(xué)合成法得到的氨基酸都是天光學(xué)活性的DL型外消旋混合物，所以必須將它進行光學(xué)拆分，以獲得L型氨基酸。外消旋氨基酸拆分的方法有物理化學(xué)法、酶法等，其中以酶法最有效，能夠產(chǎn)生純度較高的L—氨基酸。第二十五頁，共三十二頁。編輯課件3.游離酶進行分批式水解在工業(yè)(gōngyè)上的缺點：1)溶液中游離酶的存在給產(chǎn)物L(fēng)—氨基酸的分離帶來困難因此L—氨基酸的得率較低。2)反應(yīng)后的酶難以回收使用。3)分批式操作(cāozuò)勞動強度大。第二十六頁，共三十二頁。編輯課件4.固定化酶的應(yīng)用(yìngyòng)利用(lìyòng)固定氨基?；覆鸱諨L-氨基酸是固定化酶在工業(yè)上的第一項應(yīng)用，我國研制的固定化酶不僅可拆分天然蛋白組分а-氨基酸、而且還可拆分其他а-氨基酸，例如可拆分乙酰-DL-а-氨基丁為生產(chǎn)乙胺丁酸酸。第二十七頁，共三十二頁。編輯課件二.在抗生素生產(chǎn)方面(fāngmiàn)的應(yīng)用1.生產(chǎn)(shēngchǎn)青霉素G將青霉素G?；覆捎?cǎiyòng)包埋法或交聯(lián)法進行固定來生產(chǎn)青霉素G。也可將含有青霉素G?；傅拇竽c桿菌細胞直接固定在載體上來生產(chǎn)青霉素G。2.生產(chǎn)頭孢菌素第二十八頁，共三十二頁。編輯課件三.生產(chǎn)(shēngchǎn)葡萄糖和果葡糖漿固定淀粉酶、糖化酶來生產(chǎn)(shēngchǎn)葡萄糖（用于醫(yī)藥）葡萄糖的甜度僅有蔗糖(zhètáng)的74%，但其異構(gòu)體果糖的甜度為蔗糖(zhètáng)的173.3