第一章細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的基本理論知識_第1頁
第一章細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的基本理論知識_第2頁
第一章細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的基本理論知識_第3頁
第一章細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的基本理論知識_第4頁
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文檔簡介

第一章細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的基本理論知識第一頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一細(xì)胞培養(yǎng)(CellCulture)培養(yǎng)物是單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞群。組織培養(yǎng)(TissueCulture)指的是從體內(nèi)取出組織,使之生存和生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。器官培養(yǎng)(OrganCulture)培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個(gè)器官,使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法。第二頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一三種培養(yǎng)方式的來源廣泛,既可以是胚胎和成體的組織和器官,亦可是活檢或手術(shù)取下組織或器官。組織或器官去除筋膜,脂肪組織后進(jìn)行粗切器官培養(yǎng)組織培養(yǎng)(1mm3)細(xì)胞培養(yǎng)(單細(xì)胞)細(xì)切酶消化第三頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一二、細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):

1.能長時(shí)間、直接觀察、研究活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動(dòng)等。2.選擇對象均一,重復(fù);物理、化學(xué)、生物等因素可控;可采用各種研究技術(shù)、記錄方法。3.可提供大量、同時(shí)、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的實(shí)驗(yàn)對象。4.可作為制備生物制品、單克隆抗體生產(chǎn)和基因工程制品等的生產(chǎn)手段。第四頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一缺點(diǎn):人工所模擬的條件與體內(nèi)實(shí)際相比仍有很大差異,當(dāng)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后,生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境中久了,必然發(fā)生變化。體外培養(yǎng)相對孤立、相對單一,缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響,導(dǎo)致原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)變化,分化減弱或不顯,細(xì)胞趨向單一化。注意:體外培養(yǎng)細(xì)胞是一種特定條件下生長的細(xì)胞群體,體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全等同!!第五頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一

第二節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)一、體內(nèi)外細(xì)胞分化的差異1.細(xì)胞增殖和分化:增殖使細(xì)胞數(shù)量增多;分化使機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能多樣化,最后演變成完整的有機(jī)體.接觸抑制和密度抑制2.體內(nèi)外細(xì)胞的差異:細(xì)胞在體外培養(yǎng)后,一旦失去神經(jīng)體液調(diào)節(jié)和細(xì)胞間相互影響,生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境中,發(fā)生變化則是必然。細(xì)胞最多見的表現(xiàn)是:返祖(Atavism)現(xiàn)象,即失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài);分化減弱或不顯、細(xì)胞趨單一化、不死性、惡性狀。。

第六頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一第七頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一二、培養(yǎng)細(xì)胞的分化不適應(yīng)(Deadaption)細(xì)胞在體內(nèi)時(shí)所擁有的分化特性減弱或不顯。例如肝細(xì)胞在體外喪失了產(chǎn)生酪氨酸轉(zhuǎn)移酶的特性。脫分化(去分化)(Dedifferentiation)由于基因變異而使細(xì)胞失去分化能力。如肝細(xì)胞失掉產(chǎn)生精氨酸酶及氨基酸轉(zhuǎn)移酶的特性后,儲存肝糖元的能力喪失,并很難再現(xiàn)。第八頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一三、體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)1.貼壁型

2.懸浮型上皮型細(xì)胞成纖維細(xì)胞型游走細(xì)胞型多形型細(xì)胞絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞屬粘附型細(xì)胞。

第九頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一(1)上皮型細(xì)胞(2)成纖維型細(xì)胞(3)游走型細(xì)胞(4)多形型細(xì)胞

1234第十頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一貼壁型細(xì)胞:必須貼附于底物才能生長的細(xì)胞稱為貼壁型細(xì)胞貼壁是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式,細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長,因而屬于貼壁型細(xì)胞。目前已有很多種細(xì)胞能在體外培養(yǎng)生長,包括正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。例如:成纖維細(xì)胞、骨骼組織(骨及軟骨)、心肌與平滑肌、肝、肺、腎、乳腺、皮胺、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、黑色素細(xì)胞及各種腫瘤細(xì)胞等。第十一頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一

上皮樣細(xì)胞型名稱:僅形態(tài)上似體內(nèi),實(shí)際上不完全等于來源:來源于外胚層,內(nèi)胚層細(xì)胞(個(gè)別例外)如:皮膚及其衍生物,消化道,乳腺,肺泡,上皮性腫瘤形態(tài):類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞扁平,不規(guī)則,多角形中有圓形核第十二頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一生長特點(diǎn)易相連成片相靠—緊密相連—成薄層—鋪路石狀生長時(shí)呈膜狀移動(dòng),很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)

第十三頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一

成纖維細(xì)胞型名稱:凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的來源:由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如:真正的成纖維細(xì)胞,心肌,平滑肌,成骨細(xì)胞形態(tài):似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)

胞體梭形或不規(guī)則三角形胞質(zhì)向外伸出2—3個(gè)長短不等的突起,中有卵圓形核第十四頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一

生長特點(diǎn)排列成放射狀,漩渦狀并不緊靠連成片,細(xì)胞—細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動(dòng)游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞,常有幾個(gè)伸長的細(xì)胞突起

第十五頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一體外培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞第十六頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一

體外培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞(免疫組織化學(xué)染色顯示肌動(dòng)蛋白)第十七頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一游走型細(xì)胞本型細(xì)胞在支持物上散在生長,一般不連成片。細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起,呈活躍的游走或變形運(yùn)動(dòng),速度快且不規(guī)則。第十八頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一多形型細(xì)胞多形型細(xì)胞是一些形態(tài)上不規(guī)則的細(xì)胞。其細(xì)胞一般分胞體和胞突兩部分。胞突為細(xì)長形,似絲狀偽足。胞體雖略呈多角形,但沒有成纖維細(xì)胞型那樣規(guī)則。體外培養(yǎng)中呈現(xiàn)多形型的細(xì)胞最常見的類型是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞

。第十九頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一注意:細(xì)胞形態(tài)并非固定不變,可隨培養(yǎng)條件、生長時(shí)期、細(xì)胞數(shù)量等而變化,細(xì)胞形態(tài)只是對培養(yǎng)物判斷或識別的參考指標(biāo)。

血清

Hela高血清低血清

成纖維細(xì)胞樣上皮樣細(xì)胞

pHHela太酸或太堿標(biāo)準(zhǔn)pH

成纖維細(xì)胞樣上皮樣細(xì)胞

細(xì)胞密度

3T3低密度高密度

成纖維細(xì)胞樣上皮樣細(xì)胞第二十頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一懸浮型細(xì)胞:培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長來源:來自血,脾或骨髓,尤以血中白細(xì)胞腫瘤細(xì)胞也可能特點(diǎn):在懸浮中生長良好細(xì)胞圓形,單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)優(yōu)點(diǎn):生存空間大,提供數(shù)量大,傳代方便(不需消化),易于收獲缺點(diǎn):觀察不方便,純化不方便,不能通過離心將死、活細(xì)胞分離第二十一頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一四、細(xì)胞的生長和增殖過程培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間,這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法,它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。細(xì)胞傳一代有可能倍增3-6代。傳代是將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶皿轉(zhuǎn)移到另一培養(yǎng)瓶皿內(nèi)生長的過程。第二十二頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一1.原代培養(yǎng)(PrimaryCulture)階段或稱初代培養(yǎng)。從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代,隨不同的組織時(shí)間長短不一,一般為1-4w。細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)與體內(nèi)最接近、細(xì)胞群異質(zhì),細(xì)胞分裂但不旺盛,克隆形成率差。第二十三頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一2.傳代培養(yǎng)(Subculture)階段或稱繼代培養(yǎng)。也就是細(xì)胞系(Cellline)階段,細(xì)胞增殖旺盛,一般細(xì)胞可傳代10-50代。應(yīng)在初代培養(yǎng)后期或傳代早期對細(xì)胞進(jìn)行凍存。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)基的性質(zhì)。接種數(shù)量的多少和細(xì)胞的增值速度相關(guān)。第二十四頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期停止期(平臺期)每代貼壁細(xì)胞的生長過程第二十五頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一游離期:細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài),也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮,胞體呈圓球形。時(shí)間:10分鐘一4小時(shí)貼壁期:細(xì)胞附著于底物上,游離期結(jié)束。底物:玻璃、塑料、膠原、其它細(xì)胞等第二十六頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一潛伏期:細(xì)胞有生長活動(dòng),而無細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6~24小時(shí)。對數(shù)生長期:細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長,活力最佳,最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停滯期(平臺期):細(xì)胞長滿瓶壁后,細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制:接觸抑制、密度限制第二十七頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)選取生長良好的細(xì)胞加入胰蛋白酶消化液鏡下觀察倒去酶液,加入培養(yǎng)液反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液按比例分裝后培養(yǎng)第二十八頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一3.衰退期此期細(xì)胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖,細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng),最后衰退凋亡。第二十九頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一第三節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境與條件1.細(xì)胞的營養(yǎng)需要:1)基本營養(yǎng)物質(zhì):

氨基酸(12種+谷氨酰胺)維生素葡萄糖、核糖、脫氧核糖等無機(jī)離子等2)促細(xì)胞生長因子:多由血清提供

第三十頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一2.細(xì)胞的生存環(huán)境1)溫度條件對細(xì)胞生長的影響不同生物來源的組織細(xì)胞培養(yǎng)溫度不同;體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞最常用的溫度是37℃。耐低溫不耐高溫!培養(yǎng)細(xì)胞對低溫的耐受力較對高溫強(qiáng);當(dāng)溫度在43℃以上1小時(shí),細(xì)胞全部死亡;相反,溫度不低于0℃時(shí),對細(xì)胞代謝雖有影響,但并無傷害作用。在生理溫度范圍內(nèi),溫度與細(xì)胞生長率之間存在正相關(guān)關(guān)系。第三十一頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一2)氣相環(huán)境對細(xì)胞生長的影響動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的氣相環(huán)境都是采用5%CO2與95%空氣(提供氧)的混合氣體。

O2參與細(xì)胞的能量代謝過程。CO2用于維持培養(yǎng)液的酸堿度。

一般多為開放式培養(yǎng)第三十二頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一3)滲透壓正常滲透壓維持細(xì)胞張力并調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝,一般細(xì)胞滲透壓為260~320mmol/L。4)培養(yǎng)液的酸堿度對細(xì)胞生長的影響大多數(shù)的有機(jī)體細(xì)胞能在pH6.0~8.0的環(huán)境中生存。最適宜的pH值范圍是7.2~7.4。體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞耐酸能力要強(qiáng)于耐堿能力5)無污染、無毒(前提條件?。?/p>

第三十三頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一3.細(xì)胞常用的培養(yǎng)液和試劑

培養(yǎng)用液是維護(hù)組織細(xì)胞生存、生長及進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)各項(xiàng)操作過程中所需的基本溶液。

平衡鹽溶液主要包括培養(yǎng)基

其他培養(yǎng)用液

天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基第三十四頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一1)平衡鹽溶液(BalancedSaltSo1ution:BSS)BSS又稱生理鹽水或鹽溶液,主要由無機(jī)鹽和葡萄糖組成。本身具有維持滲透壓,調(diào)控酸、堿度平衡的作用,同時(shí)能供給細(xì)胞生存所需的能量和無機(jī)離子成分;用作洗滌組織、細(xì)胞以及配制各種培養(yǎng)用液的基礎(chǔ)溶液。BSS內(nèi)含少量的酚紅,作為溶液酸堿度變化的指示劑;溶液變酸時(shí)呈黃色,變堿時(shí)呈紫紅色,中性時(shí)呈桃紅色,借此易于觀察到培養(yǎng)液pH的變化。第三十五頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一幾種常用的平衡鹽溶液:Ringer、PBS、Tyrode、Earle、Hank’s、D-Hank’s、Dulbecco(都有相應(yīng)配方)最簡單的BSS是Ringer。D-Hank’s與Hank’s的一個(gè)主要區(qū)別在于前者不含有Ca2+、Mg2+

,因此D-Hank’s常用于配制胰酶溶液。配制平衡鹽溶液也應(yīng)當(dāng)用新鮮的三蒸水。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫高壓滅菌。有渾濁或沉淀時(shí),應(yīng)重新配制第三十六頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一PBS(Phosphate-BufferedSallines)KCl0.20gKH2PO40.20gNaCl8.00gNa2HPO4·7H2O2.16gDPBS(Dulbecco’sPhosphate-BufferedSallines)標(biāo)準(zhǔn)型CaCl2(anhyd.)(無水氯化鈣)0.10gKCl0.20gKH2PO40.20gMgCl2·6H2O0.10gNaCl8.00gNa2HPO4·7H2O2.16g第三十七頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一D-Hanks’

平衡鹽溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions,D-HBSS)KCl0.40gKH2PO40.06gNaCl8.00gNaCO30.35gNa2HPO40.048gD-Glucose1.00gPhenolRed0.01g

第三十八頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一2)培養(yǎng)基培養(yǎng)基就是人工模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長的營養(yǎng)環(huán)境,維持細(xì)胞生長的營養(yǎng)物質(zhì),它是提供細(xì)胞營養(yǎng)和促進(jìn)細(xì)胞生長增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求:體外培養(yǎng)的細(xì)胞直接生活在培養(yǎng)基中,因此培養(yǎng)基應(yīng)能滿足細(xì)胞對營養(yǎng)成分、促生長因子、激素、滲透壓、pH等諸多方面的要求。培養(yǎng)基可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基。第三十九頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量,用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基,如MEM、RPMI-1640、DMEM等。主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。目前常用的MEMEagle培養(yǎng)液,僅含有12種必需氨基酸、谷氨酰胺和八種維生素,成分簡單,可廣泛適應(yīng)各種已建成細(xì)胞系的培養(yǎng)。在它們的基礎(chǔ)上,后又改良成BME(BasalMediumEagle:BME)和DMEM(DulbeccoMEM)二種培養(yǎng)液,應(yīng)用也十分廣泛。

第四十頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一

人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存,要想使細(xì)胞生長和繁殖,還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基(如血清)。合成培養(yǎng)基優(yōu)點(diǎn):標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn),組分和含量相對固定,成本低。

缺點(diǎn):缺少某些成分,不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。第四十一頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一市場上可提供干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基需使用者自己配制并滅菌,其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格便宜。缺點(diǎn)是配制過程比較繁瑣,質(zhì)量不易控制液體培養(yǎng)基是由專業(yè)廠家按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)?;a(chǎn),不僅質(zhì)量得到保證,而且使用十分方便,但比較昂貴。第四十二頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一如何選擇培養(yǎng)基?(1)建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基。(2)本實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基(3)根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來選擇培養(yǎng)基(4)用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞,觀察其生長狀態(tài),可用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷,根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基第四十三頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一第四十四頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一培養(yǎng)基的配制(針對干粉培養(yǎng)基)1.認(rèn)真閱讀說明書。2.配制時(shí)要保證充分溶解,NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要在培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。3.配制所用的水應(yīng)為三蒸水,離子濃度很低,水電阻達(dá)30萬Ω以上。4.所用器皿應(yīng)十分潔凈。5.配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾,無菌保存于4℃。第四十五頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一

DMEM培養(yǎng)液的配制(舉例):(溶解)900mLddH2O于1000mL燒杯中,將DMEM粉1包倒入其中,盛粉袋用50mLddH2O分次沖洗,也倒入容器,磁力(或玻棒)攪拌溶解。(調(diào)PH)用5%-10%的NaHCO3調(diào)pH至7.2(加抗生素)加青、鏈霉素至終濃度100u/mL和100ug/mL(過濾除菌)用0.22um的濾膜過濾除菌。(分裝保存)分裝(200mL左右)后4℃冰箱保存。第四十六頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一天然培養(yǎng)基有血清(牛、馬血清)、血漿、和組織提取液(如雞胚和牛胚浸液)、鼠尾膠原。優(yōu)點(diǎn):營養(yǎng)成分豐富,培養(yǎng)效果好缺點(diǎn):來源受限。成分復(fù)雜,影響對某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染細(xì)胞在單純的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不能長期存活,基礎(chǔ)培養(yǎng)基中常常要添加血清,添加血清后的培養(yǎng)基被稱為“完全培養(yǎng)基”。第四十七頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一

血清的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)血清中含有多種蛋白質(zhì)(白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等);多種金屬離子、激素;促貼附物質(zhì),如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等;各種生長因子;轉(zhuǎn)移蛋白;不明成分的物質(zhì),促進(jìn)細(xì)胞貼壁生長。血清中含有一些有毒性的物質(zhì),例如:多胺氧化酶,補(bǔ)體,抗體,細(xì)菌毒素等都會(huì)影響細(xì)胞的生長,甚至造成細(xì)胞死亡;每批血清之間成分不能保持一致;取材過程可能帶入支原體、病毒,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或結(jié)果的不可靠。第四十八頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用牛血清胎牛血清(fetalbovineserum,FBS或fetalcalfserum,FCS)

新生牛血清(newborncalfserum,NBCF):小于24h小牛血清(calfserum,CS):10~30D其中以胎牛血清質(zhì)量最好優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn):透明,淡黃色,無沉淀物,無細(xì)菌、支原體、病毒污染。第四十九頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一血清的使用與儲存

使用前的處理:血清在使用前通常在56℃加熱30分鐘,這一過程稱為滅活。

熱滅活目的:滅活血清中的補(bǔ)體成分。對于一些品質(zhì)高的胎牛血清和新生牛血清可以考慮不經(jīng)滅活直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。第五十頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一血清的儲存條件:血清一般儲存于-20℃,同時(shí)應(yīng)避免反復(fù)凍融。大包裝的血清,首先將血清滅活處理,然后分裝為小包裝,如10ml、20ml、50ml,儲存于-20℃,使用前融化。融化后的血清在4℃不宜長時(shí)間存放,應(yīng)盡快使用。第五十一頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一血清中的沉淀物絮狀物:血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成,這些絮狀物不會(huì)影響血清本身的質(zhì)量。可用離心3000rpm,5分鐘去除,也可不用處理顯微鏡下“小黑點(diǎn)”:經(jīng)過熱處理過的血清,沉淀物的形成會(huì)顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點(diǎn)”,常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下,此小黑點(diǎn)不會(huì)影響細(xì)胞生長,但如果懷疑血清質(zhì)量,則應(yīng)立即停止使用,更換另一批號的血清第五十二頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一一般說來,含5%小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死,但支持細(xì)胞生長一般需加10%血清。對于血清支持細(xì)胞生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明,但對血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚。完全培養(yǎng)基成分基礎(chǔ)培養(yǎng)基80%一95%血清5%一20%碳酸氫鈉3.7g/L青、鏈霉素各100單位/毫升第五十三頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一其他培養(yǎng)用液

3)、消化液

(1)胰酶(trypsin)溶液:濃度一般為0.1%~0.25%配制時(shí)要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液

第五十四頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一(2)EDTA溶液:一種化學(xué)螯合劑,對細(xì)胞有一定的離散作用,而且毒性小,價(jià)格低廉,使用方便,使用濃度為0.02%;可與胰酶的混合使用。EDTA溶液配制:用D-Hanks’平衡鹽溶液溶解后,高壓蒸汽滅菌,分裝成小瓶,4℃冰箱保存注意:使用EDTA處理細(xì)胞后,要用平衡鹽液沖洗干凈,因殘留的EDTA會(huì)影響細(xì)胞生長第五十五頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一(3)膠原酶(collagenase)溶液:使用濃度為0.1~0.3mg/L或200000U/L,作用的最佳pH為6.5。膠原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制,配制時(shí)可用PBS。

膠原酶作用溫和,不易對細(xì)胞產(chǎn)生損傷,在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用缺點(diǎn):價(jià)格昂貴

第五十六頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一4、谷氨酰胺補(bǔ)充液合成培養(yǎng)基中必需成分,但容易降解,所以都是在使用前添加。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配制為100倍濃縮液,配制時(shí)應(yīng)加溫至30℃,完全溶解后過濾除菌,分裝至小瓶,儲存于-20℃。

第五十七頁,共六十四頁,編輯于2023年,星期一

5、pH調(diào)整液

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