第三章細(xì)胞分離技術(shù)

第三章細(xì)胞分離技術(shù)第一頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一部分微生物胞內(nèi)酶第一節(jié)細(xì)胞分離第二頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一胞內(nèi)重組藥物

設(shè)計(jì)試驗(yàn)，請(qǐng)用生物工程學(xué)的原理和方法生產(chǎn)治療糖尿病的胰島素？第三頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一

分離胞內(nèi)產(chǎn)物與胞外產(chǎn)物的差別是什么？為回收和提純胞內(nèi)產(chǎn)品,必須先將它們從胞內(nèi)釋放到胞外,然后進(jìn)行分離純化?？梢圆捎梅置谛运拗魇拱麅?nèi)產(chǎn)物直接分泌到胞外;也可用破碎細(xì)胞的方法使其釋放出來(lái)。第四頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一細(xì)胞與液體物質(zhì)的分離又稱為固液分離，固液分離方法包括過(guò)濾與離心沉降。一、過(guò)濾指利用多孔性介質(zhì)截流固體懸浮液中的固體顆粒，進(jìn)行固液分離的方法。過(guò)濾不但是傳統(tǒng)的化工單元，而且是目前工業(yè)生產(chǎn)中用于分離細(xì)胞和不溶性物質(zhì)的主要方法。第五頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一過(guò)濾一般過(guò)濾：微生物、動(dòng)植物細(xì)胞膜過(guò)濾：蛋白質(zhì)等物質(zhì)的選擇性分離一般過(guò)濾：以壓力差作為推動(dòng)力。第六頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、離心沉降沉降法：指固體顆粒在外力作用下與液體物質(zhì)做相對(duì)運(yùn)動(dòng)最終實(shí)現(xiàn)固液分離的技術(shù)。沉降法根據(jù)作用外力的不同，可分為重力沉降和離心沉降。第七頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一離心沉降是利用慣性離心力和物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的不同而進(jìn)行的一項(xiàng)分離、濃縮或提取條件。1）離心沉降的原理：固體和液體之間存在一定的密度差，且固體密度大于液體的密度。2）影響離心沉降速度的因素密度差、顆粒大小、液體粘度、離心力大小第八頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一斯托克斯公式：u=d2(ρs－ρ)rω2/18μ1)密度差越大(ρs－ρ)，離心沉降速度越快；2)固體顆粒尺寸越大，越容易離心;3)液體粘度μ越大，越不容易離心；4)離心力rω2的大小對(duì)固液分離影響很大。第九頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一3）離心機(jī)的分類(lèi)分離因數(shù)Fr＝rω2／g分離因數(shù)Fr的大小分為1)Fr＜3000常速離心機(jī)2)Fr＝3000～5000中速離心機(jī)3)Fr≥5000高速離心機(jī)4)Fr=2×104～106超速離心機(jī)第十頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一離心分離法根據(jù)其操作方式的不同，又可分為差速離心和密度梯度離心。1)差速離心法如果所要的蛋白質(zhì)(或生物大分子)主要集中在某一細(xì)胞組分，如細(xì)胞核、染色體、核糖體或可溶性的細(xì)胞質(zhì)等；則可利用差速離心（differentialcentrifugation）方法將它們分開(kāi)收集，該細(xì)胞組分作為下步純化的材料。第十一頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一優(yōu)點(diǎn)：可以一下子除去很多雜蛋白質(zhì)，使純化工作容易得多。如果碰上所要蛋白質(zhì)是與細(xì)胞膜或膜質(zhì)細(xì)胞器結(jié)合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。第十二頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一差速離心法的原理差速離心是利用不同離心速度產(chǎn)生不同離心力，將各種亞細(xì)胞組分和各種顆粒分別分開(kāi)。不同物質(zhì)有不同的形狀、大小、質(zhì)量和密度，當(dāng)在介質(zhì)中離心時(shí)，它們的沉降速度各有差異。第十三頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一大的顆粒碎片在低速時(shí)很快沉降，被分離的物質(zhì)留在上清液中;逐步增加離心力，進(jìn)一步離心上清液，使中等顆粒沉降，最后是大小和密度最小的顆粒沉降。注意：每次得到的沉淀，必須經(jīng)過(guò)幾次洗滌后，反復(fù)懸浮和離心，才能得到比較純的部分。第十四頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一差速離心圖示第十五頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一差速離心的方法為了將細(xì)胞中各種組分純化分離，首先要在等滲緩沖液中把細(xì)胞破碎勻漿;然后用差速離心的方法，把勻漿液中的各種組分分離;在離心場(chǎng)中，不同大小的顆粒沉向離心管底部的速率不同。第十六頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一差速離心的方法當(dāng)離心力低，離心時(shí)間短時(shí)，細(xì)胞核即可沉到管底；加大離心力后，又可分離出線粒體；離心力再加大，才能分離出微粒體和核糖體。最后幾步的超離心力，可超過(guò)地心引力的10萬(wàn)倍以上，懸液經(jīng)離心分離出核糖體以后所剩的上清液，則是由細(xì)胞原生質(zhì)的可溶性部分和極微小的顆粒所組成，這些組分則需要更嚴(yán)格的離心方法才能分離出來(lái)第十七頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一2)一般密度梯度離心法也稱分級(jí)區(qū)帶離心，有：1）蔗糖密度梯度離心2）氯化銫密度梯度離心用于RNA-DNA混合物、核蛋白體亞單位和其他細(xì)胞成分的分離第十八頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一一般密度梯度離心法：把樣品鋪放在一個(gè)連續(xù)的液體密度梯度上，然后進(jìn)行離心，并控制離心分離的時(shí)間，使得粒子完全沉降之前，在液體梯度中移動(dòng)而形成不連續(xù)的分離區(qū)帶。第十九頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一一般密度梯度離心圖示第二十頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一3)等密度梯度離心法等密度梯度離心法：不同粒子存在密度差時(shí)，在離心力場(chǎng)作用下，粒子或向下沉降，或向上浮起，一直移動(dòng)到與它們密度恰好相等的位置上（即等密度點(diǎn)）并形成區(qū)帶，此即等密度梯度離心法。第二十一頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一等密度梯度離心法第二十二頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一三、離心過(guò)濾 1）離心過(guò)濾的原理以離心力作為推動(dòng)力完成過(guò)濾操作,具有離心和過(guò)濾的雙重作用。2）影響離心過(guò)濾速度的因素過(guò)濾面積和離心力第二十三頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一離心過(guò)濾機(jī)可分離固體密度大于或小于液體密度的懸浮液?？煞譃?連續(xù)式離心機(jī)和間歇式離心機(jī)。第二十四頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一第二節(jié)細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎：指選用物理，化學(xué)，酶或機(jī)械的方法來(lái)破壞細(xì)胞壁或細(xì)胞膜。第二十五頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一一、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁化學(xué)組成非常復(fù)雜,取決于微生物類(lèi)型細(xì)胞的年齡細(xì)胞的生長(zhǎng)生理學(xué)多糖，脂質(zhì)，蛋白質(zhì)在三維結(jié)構(gòu)上的排列方式第二十六頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)第二十七頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、細(xì)胞破碎率破碎率：被破碎細(xì)胞的數(shù)量占原始細(xì)胞數(shù)量的百分?jǐn)?shù)。1）直接記數(shù)法2）間接記數(shù)法第二十八頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一1）直接記數(shù)法平板計(jì)數(shù)技術(shù)需時(shí)長(zhǎng)；只有活細(xì)胞才能計(jì)數(shù)；會(huì)產(chǎn)生誤差血球細(xì)胞器上用顯微鏡計(jì)數(shù)快速而簡(jiǎn)單，但細(xì)胞小計(jì)數(shù)困難第二十九頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一2）間接記數(shù)法在細(xì)胞破碎后，測(cè)定懸浮液中細(xì)胞釋放出來(lái)的化合物的量（如可溶性蛋白，酶等）。將破碎后的細(xì)胞懸液離心去掉固體（完整細(xì)胞和碎片），然后對(duì)上清液進(jìn)行含量或活性分析。酶活性是破碎程度的很好指示參數(shù)。第三十頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一三、細(xì)胞破碎的方法破碎方法機(jī)械法非機(jī)械法固體剪切作用液體剪切作用珠磨法壓榨法高壓勻漿超聲破碎酶溶法化學(xué)法物理法第三十一頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一1）珠磨法（圖3-6）作用機(jī)理：微生物細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的研磨劑在攪拌漿作用下充分混勻，珠子之間及珠子與細(xì)胞之間相互剪切、碰撞，促使細(xì)胞壁破裂，釋放出內(nèi)含物。第三十二頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一影響因素：①轉(zhuǎn)盤(pán)轉(zhuǎn)速：破碎比速度與轉(zhuǎn)盤(pán)速度成正比。②細(xì)胞濃度：最佳濃度應(yīng)由實(shí)驗(yàn)確定。濃度大，產(chǎn)生的熱量大，但單位細(xì)胞重量所消耗的功率小。③珠粒大?。涸谝欢ǚ秶鷥?nèi)，磨珠越小，破碎速度越快，但也不能過(guò)小。第三十三頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一④溫度：將溫度控制在5～40℃對(duì)破碎物影響較小。⑤流量：流量大，加工單位質(zhì)量細(xì)胞消耗的能量減小，但細(xì)胞的破碎程度和蛋白質(zhì)的釋放量會(huì)降低。第三十四頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一

溫控與能耗珠磨機(jī)是采用夾套冷卻的方式實(shí)現(xiàn)溫度控制的，一般情況下能將溫度控制在要求的范圍內(nèi)；珠磨機(jī)的能耗與細(xì)胞破碎率成正比；高的破碎率會(huì)提高分離的成本。第三十五頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一2)高壓勻漿法（圖3-8）作用機(jī)理從高壓室壓出的細(xì)胞懸浮液，經(jīng)過(guò)閥座的中心孔道從閥座和閥桿之間的小環(huán)隙中噴出，速度可達(dá)幾百米每秒。這種高速噴出的懸液又射擊到靜止的碰撞環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。第三十六頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一

溫控與能耗活性物質(zhì)在破碎過(guò)程中的失活問(wèn)題。蛋白質(zhì)和酶的失活主要由勻漿過(guò)程中產(chǎn)生的熱引起。如果能將溫度控制在35oC以下，酶失活的損失可以忽略。提高壓力有利于細(xì)胞破碎，但需增加能耗。機(jī)械破碎的能耗主要包括提供動(dòng)力消耗的能量及低溫操作消耗的能量。第三十七頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一3)超聲波法作用機(jī)理聲頻高于15～20KHz的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入可以引起空化現(xiàn)象，使氣泡形成、脹大和破碎的現(xiàn)象。第三十八頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一此法多適用于微生物材料、細(xì)胞培養(yǎng)材料的破碎；因超聲波處理時(shí)產(chǎn)熱較多，故應(yīng)用此法時(shí)，需要采取降溫措施；另外，某些核酸及酶對(duì)超聲波敏感，慎用此法。第三十九頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一超聲波破碎過(guò)程效率的影響因素：①聲頻②聲能③處理時(shí)間④細(xì)胞濃度⑤菌種類(lèi)型第四十頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一四)化學(xué)滲透法

用化學(xué)藥品改變細(xì)胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇地滲透出來(lái)，這種處理方式稱為化學(xué)滲透法。作用機(jī)理化學(xué)滲透取決于化學(xué)試劑的類(lèi)型及細(xì)胞壁和膜的結(jié)構(gòu)與組成。不同試劑對(duì)各種微生物細(xì)胞作用的部位和方式有所差異。第四十一頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一有機(jī)溶劑（苯、甲苯）表面活性劑有些動(dòng)物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）表面活性劑處理法使細(xì)胞膜破壞。金屬螯合劑（EDTA）變性劑（鹽酸胍、脲）第四十二頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一五)酶溶法

用生物酶將細(xì)胞壁和細(xì)胞膜消化溶解的方法。溶菌酶、?-1，3-葡聚糖酶、?-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鏈內(nèi)切酶等。第四十三頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一作用機(jī)理溶酶具有高度專一性，蛋白酶只能水解蛋白質(zhì)，葡聚糖酶只能水解葡聚糖，因此，利用溶酶系統(tǒng)處理細(xì)胞必須根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿福⒋_定相應(yīng)的使用次序。第四十四頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一酶溶法的優(yōu)點(diǎn)：①產(chǎn)品釋放的選擇性高②抽提的速率和收率高③產(chǎn)品的破壞最少④對(duì)pH和溫度等外界條件要求低⑤不殘留細(xì)胞碎片第四十五頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一六)物理法①滲透壓沖擊法②反復(fù)凍融法多用于動(dòng)物細(xì)胞。將細(xì)胞在-20℃以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。③低溫玻璃化法指從超微結(jié)構(gòu)上損傷細(xì)胞，使細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等成分遭受破壞。第四十六頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一各種破碎方法的比較及選擇分類(lèi)具體方法優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍機(jī)械破碎法珠磨法破碎率高，適用范圍廣，但后處理復(fù)雜高壓均漿法破碎率高，可大規(guī)模操作，適用范圍小超聲波破碎適用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模操作物理破碎法凍融法操作簡(jiǎn)便，但不適用于對(duì)冷凍敏感的細(xì)胞低溫玻璃化成本高，適用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模生產(chǎn)化學(xué)滲透法加入特定化學(xué)試劑選擇性高，細(xì)胞碎片大，后處理容易；但作用時(shí)間長(zhǎng)，適用范圍小酶溶法加入酶選擇性高，細(xì)胞碎片大，后處理容易；但成本高，適用范圍小第四十七頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一細(xì)胞破碎技術(shù)的發(fā)展方向①多種破碎方法相結(jié)合②與下游過(guò)程相結(jié)合破碎過(guò)程要易于細(xì)胞碎片的除凈。③與上游過(guò)程相結(jié)合培養(yǎng)基、生長(zhǎng)期、操作參數(shù)等。第四十八頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一第三節(jié)胞內(nèi)產(chǎn)物的溶解及復(fù)性一、包含體及其形成二、包含體的分離和溶解三、蛋白質(zhì)復(fù)性第四十九頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一（一）包含體及其形成

1)包含體的概念在基因工程菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組蛋白，常?；ハ嘟宦?lián)在一起，形成不溶性的聚積物，通常稱為包含體。第五十頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一包含體在相差顯微鏡下呈現(xiàn)為許多個(gè)高度折光的顆粒，含有這些包含體的大腸桿菌的菌體變大，并出現(xiàn)突起部分。在電鏡下，包含體是無(wú)明顯的膜存在，大致為圓形，直徑可達(dá)1微米。包含體第五十一頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一包涵體存在于包含體內(nèi)的重組蛋白通常無(wú)生物活性，其形成與否取決于蛋白質(zhì)的類(lèi)型。含有二硫鍵的真核生物蛋白質(zhì)，在原核生物中進(jìn)行表達(dá)，常常因重組蛋白內(nèi)及分子間二硫鍵的錯(cuò)配，而產(chǎn)生無(wú)活性的蛋白質(zhì)，成為不溶性的物質(zhì)。第五十二頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一包含體形成的原因①產(chǎn)生少量蛋白時(shí)，可溶，量過(guò)多時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)超過(guò)其溶解度而沉淀；②蛋白質(zhì)合成速度太快，肽鏈來(lái)不及形成正常的折疊構(gòu)象，導(dǎo)致分子間因疏水作用聚合而不溶，生物活性受影響；第五十三頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一③高表達(dá)的蛋白沒(méi)有形成正常的二硫鍵，或宿主細(xì)胞內(nèi)氧化還原等條件不同而生成不同的-S-S-；④蛋白的溶解需要與其他成分結(jié)合或經(jīng)其他成分誘導(dǎo)形成適當(dāng)?shù)目扇苄詷?gòu)象，當(dāng)產(chǎn)生的蛋白量過(guò)多，所需其他成分相對(duì)不足，如折疊酶，分子伴侶等。第五十四頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一⑤包含體的形成亦與蛋白質(zhì)自身穩(wěn)定性有關(guān)。第五十五頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、包含體的分離和