氨基酸分析基本原理與應(yīng)用

目錄一、氨基酸分析儀二、基本原理及特點(diǎn)三、樣品的制備四、影響氨基酸分析的各種因素五、應(yīng)用當(dāng)前第1頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)日立L-8900氨基酸分析儀當(dāng)前第2頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)（一）氨基酸分析儀的構(gòu)成1、輸液?jiǎn)卧ū门c管路）2、進(jìn)樣單元（自動(dòng)進(jìn)樣器）3、分離單元（離子交換柱、柱溫箱）4、反應(yīng)單元（反應(yīng)柱、反應(yīng)溫度加熱設(shè)備）5、檢測(cè)單元（分光光度計(jì)）6、程序控制、數(shù)據(jù)處理（工作站）當(dāng)前第3頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)（二）氨基酸分析儀的特點(diǎn)1、高靈敏度：以蛋白水解液標(biāo)準(zhǔn)為例可檢測(cè)到3pmoL。2、快速、高分辨率：水解氨基酸分析時(shí)間只有30分鐘，生理體液110分鐘。3、柱后衍生技術(shù)（實(shí)時(shí)混合）：與氨基酸反應(yīng)前才將兩種反應(yīng)液進(jìn)行實(shí)時(shí)混合，有效的延長(zhǎng)了反應(yīng)液的使用期限、且不需要額外的制冷裝置存放。4、氨氣排除系統(tǒng)：增加了除氨柱，能很好的排除氨在分析過(guò)程中對(duì)基線(xiàn)及峰形的干擾。當(dāng)前第4頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)二、基本原理氨基酸RHCCOOH__NH2__組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸除甘氨酸外、都有一個(gè)不對(duì)稱(chēng)碳原子，即а-碳原子。а-碳原子有四個(gè)不同取代基：羧基、氨基、氫原子和R基團(tuán)，不同氨基酸的R基團(tuán)不同。每種氨基酸有D-構(gòu)型和L-構(gòu)型，蛋白質(zhì)中的氨基酸都是L-構(gòu)型。當(dāng)前第5頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)（一）氨基酸的分類(lèi)它的分類(lèi)有兩種：1、按氨基酸具有的酸性和堿性基團(tuán)的多少分類(lèi)：中性氨基酸、酸性氨基酸和堿性氨基酸。2、按人體營(yíng)養(yǎng)的需求又可分為必需氨基酸、半必需氨基酸及非必需氨基酸。當(dāng)前第6頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)（二）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)與茚三酮反應(yīng)：茚三酮與氨基酸一起加熱，形成深蘭紫色復(fù)合物，最大吸收波長(zhǎng)為570nm。茚三酮與羥脯氨酸反應(yīng)不釋放NH3，直接生成黃色化合物，吸收波長(zhǎng)在440nm。當(dāng)前第7頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)（三）氨基酸分析儀基本分析原理1、離子交換柱2、離子交換樹(shù)脂3、離子交換原理當(dāng)前第8頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)1、離子交換柱氨基酸分析儀的中心部件就是離子交換柱，主要靠它把具有共性而又有差別的各種氨基酸混合物分離開(kāi)來(lái)進(jìn)行定量。日立氨基酸分析儀交換柱為磺酸型陽(yáng)離子樹(shù)脂分離柱。當(dāng)前第9頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)2、離子交換樹(shù)脂用作氨基酸分離柱的固定相一般都是固體的合成離子交換劑。一般氨基酸分析儀所用的離子交換樹(shù)脂是強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，它是由苯乙烯和二乙烯聚合而成的。作為理想的離子交換劑應(yīng)符合下列要求：機(jī)械強(qiáng)度好不溶解且具有很好的化學(xué)穩(wěn)定性均勻球狀顆粒當(dāng)裝入柱子后應(yīng)有良好的通透性交換容量大離子交換基應(yīng)是單一的官能性的當(dāng)前第10頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)3、離子交換原理緩沖液（流動(dòng)相）中的樣品離子與離子交換劑（固定相）間離子交換過(guò)程可分為以下幾步：首先離子通過(guò)擴(kuò)散作用，到達(dá)分離柱樹(shù)脂的表面。（這個(gè)過(guò)程進(jìn)行的非常快）離子進(jìn)一步擴(kuò)散到交換位置以致進(jìn)入樹(shù)脂內(nèi)部交換位置。這決定于樹(shù)脂的交聯(lián)度和溶液的深度。這個(gè)過(guò)程是整個(gè)離子交換反應(yīng)的關(guān)鍵。當(dāng)前第11頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)在交換位置上進(jìn)行離子交換，這個(gè)平衡是瞬間的。被交換的離子帶的電荷越多，它與樹(shù)脂的結(jié)合越緊密，被其它離子取代就越困難。被交換的離子通過(guò)樹(shù)脂擴(kuò)散到表面。用洗脫液洗脫，被交換的離子擴(kuò)散到溶液中去。當(dāng)前第12頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)氨基酸與樹(shù)脂間的交換主要決定于帶有相反電荷之間的引力作用。陽(yáng)離子樹(shù)脂本身帶有負(fù)電荷，兩者正負(fù)吸引而結(jié)合，并且氨基酸所帶正電荷越多，結(jié)合得越緊密，被Na離子置換就越困難。所以，堿性氨基酸結(jié)合力最強(qiáng)，其次為芳香族氨基酸、中性氨基酸、酸性氨基酸結(jié)合力最弱。當(dāng)前第13頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)所以，用不同離子強(qiáng)度、PH值的緩沖液依次將氨基酸按吸附力的不同洗脫下來(lái)，被洗脫下來(lái)的氨基酸與茚三酮反應(yīng)液在加熱條件下反應(yīng)（135℃），生成可在分光光度計(jì)中570nm的藍(lán)紫色物質(zhì)（仲氨生成淺黃色物質(zhì)，440nm檢測(cè)）外標(biāo)法定量。當(dāng)前第14頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)（四）氨基酸分析儀與HPLC法的比較當(dāng)前第15頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)三、樣品的制備（一）蛋白質(zhì)的水解（二）游離氨基酸樣品的制備（三）生理體液樣品的前處理當(dāng)前第16頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)（一）蛋白質(zhì)的水解

用于全氨基酸測(cè)定的樣品，凡是以蛋白質(zhì)形式存在的都要進(jìn)行水解處理，水解方法有三種：1、酸水解法：標(biāo)準(zhǔn)水解法，水解徹底，但色氨酸被破壞。2、堿水解法：用NaOH作為水解劑，色氨酸不被破壞，但有消旋作用，絲氨酸、蘇氨酸等被破壞。3、酶水解法：水解條件溫和，無(wú)需特殊設(shè)備，氨基酸不受破環(huán)，但水解時(shí)間長(zhǎng)，而且不易水解完全。當(dāng)前第17頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)（二）游離氨基酸樣品的制備游離氨基酸的樣品在分析前必需進(jìn)行磨碎、脫脂、提取、脫鹽、去蛋白、脫色等處理。在進(jìn)行分析前建議使用C18小柱處理一下。當(dāng)前第18頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)（三）生理體液樣品的處理生理體液的樣品首先要除去樣品中的蛋白質(zhì)，獲得游離氨基酸。除去蛋白質(zhì)化學(xué)方法為：

1、苦味酸法2、三氯乙酸法3、乙醇沉淀法4、磺基水楊酸法（常用的方法）當(dāng)前第19頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)四、影響氨基酸分析的各種因素樣品中氨基酸濃度的影響緩沖液PH值、鈉離子濃度的影響柱溫的影響氨的影響氧的影響光源的影響（鎢燈）當(dāng)前第20頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)（一）樣品中氨基酸濃度的影響每種儀器都有其比較合適的進(jìn)樣量，進(jìn)樣濃度都有一定的范圍。濃度太大太小都不適宜，尤其是將高濃度的樣品注入儀器中會(huì)造成儀器管路的堵塞。最好進(jìn)樣分析前將樣品稀釋到比較合適的濃度。當(dāng)前第21頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)（二）緩沖液PH值與鈉離子濃度的影響色譜圖中各種氨基酸分離的特別好而沒(méi)有峰丟失，緩沖液的PH值和鈉離子起著重要的作用。如PH值和鈉離子濃度不當(dāng)會(huì)出現(xiàn)氨基酸出峰提前錯(cuò)后以及重疊現(xiàn)象。當(dāng)前第22頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)（三）柱溫的影響柱溫不穩(wěn)定或不準(zhǔn)確會(huì)出現(xiàn)基線(xiàn)漂移或分離度不好影響分離效果以及準(zhǔn)確定量。當(dāng)前第23頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)（四）氨的影響緩沖液、樣品、流路系統(tǒng)混入氨進(jìn)可使基線(xiàn)在堿性氨基酸出峰處將基線(xiàn)抬高，影響堿性氨基酸分離效果和準(zhǔn)確定量。當(dāng)前第24頁(yè)\共有26頁(yè)\編于星期五\19點(diǎn)（五）氧的影響反應(yīng)液中的茚三酮最忌氧，茚三酮氧化后