DNA提取的基本步驟課件

DNA提取的基本步驟I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）組培細(xì)胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取細(xì)胞裂解材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨動物組織－－勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞－－蛋白酶K細(xì)菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩基因組DNA的提取核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間針對不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。核酸分離、純化多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：β-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合核酸分離、純化鹽離子的去除：70％的乙醇洗滌核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見前）重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。

原因?qū)Σ卟牧喜恍迈r或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融DNA提取常見問題問題二：DNA降解。對策

原因?qū)嶒?yàn)材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時DNA丟失盡量選用新鮮（幼嫩）的材料動植物要勻漿研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁高溫裂解時，時間適當(dāng)延長（對于動物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量）低溫沉淀，延長沉淀時間加輔助物，促進(jìn)沉淀洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒DNA提取常見問題問題三：DNA提取量少。對策

原因PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系

DNA模板引物反應(yīng)緩沖液

dNTP

ddH2O

耐熱聚合酶反應(yīng)體系對PCR擴(kuò)增的影響DNA模板純度

蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)會抑制PCR反應(yīng)完整性

模板降解會導(dǎo)致PCR擴(kuò)增無產(chǎn)物濃度

加量過多導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加特異性

長度適當(dāng)、避免二級結(jié)構(gòu)和二聚體完整性

避免反復(fù)凍融濃度

應(yīng)適當(dāng),過高導(dǎo)致非特異性增加,過低則引物擴(kuò)增產(chǎn)物太少反應(yīng)體系對PCR擴(kuò)增的影響反應(yīng)Buffer

pH值,鹽離子濃度穩(wěn)定劑,增強(qiáng)劑Mg2＋濃度過高非特異性嚴(yán)重過低無擴(kuò)增產(chǎn)物dNTPMixture濃度適當(dāng)避免反復(fù)凍融ddH2OpH值適當(dāng)避免污染PCR

MasterMix原理預(yù)配好的PCR反應(yīng)液

DNA聚合酶

反應(yīng)緩沖液

dNTP

PCR增強(qiáng)劑

PCR

MasterMix特點(diǎn)

快速簡便減少加樣誤差和污染

靈敏度高

可擴(kuò)增低至2個拷貝的目的模板

特異性強(qiáng)降低PCR反應(yīng)的要求，增強(qiáng)特異性

穩(wěn)定性好長期放置活性無改變PCR常見問題無擴(kuò)增產(chǎn)物非特異性擴(kuò)增拖尾假陽性PCR常見問題之一無擴(kuò)增產(chǎn)物模板:含有抑制物，含量低Buffer對樣品不合適引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時間太短

原因?qū)Σ呒兓０寤蛘呤褂迷噭┖刑崛∧０錎NA或加大模板的用量更換Buffer或調(diào)整濃度重新設(shè)計(jì)引物,或者換一管新引物降低退火溫度、延長延伸時間現(xiàn)象：正對照有條帶，而樣品則無；PCR常見問題之二

非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。PCR常見問題之二引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多

原因?qū)Σ咧匦略O(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)減少酶量降低鎂離子濃度適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)

非特異性擴(kuò)增PCR常見問題之三

拖尾現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。M12PCR常見問題之三模板不純Buffer不合適退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+濃度偏高循環(huán)次數(shù)過多

原因?qū)Σ呒兓０甯鼡QBuffer適當(dāng)提高退火溫度適量用酶適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度減少循環(huán)次數(shù)

拖尾PCR常見問題之四假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達(dá)情況)原因：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染

現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物

對策：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存。謝謝！酚/氯仿/異戊醇的作用：酚可以使蛋白質(zhì)變性，作用大于氯仿，但水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液，離心后酚相會跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收。加入氯仿后可以增加其比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收。還有，酚與水有很大的互溶性，如果單獨(dú)用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)），因此如果單獨(dú)用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除。而用酚/氯仿混合液進(jìn)行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必?fù)?dān)心酶切等反應(yīng)不能正常進(jìn)行。異戊醇的添加，主要可以使離心后上下層的界面更加清晰，方便水相的回收。酚/氯仿/異戊醇Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)

標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：

10×擴(kuò)增緩沖液

10ul

4種dNTP混合物

各200umol/L

引物

各10～100pmol

模板DNA

0.1～2ug

TaqDNA聚合酶

2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加雙或三蒸水至

100ul

10×擴(kuò)增緩沖液

2.5ul

4種dNTP混合物