細(xì)胞培養(yǎng)基的質(zhì)量控制定稿

細(xì)胞培養(yǎng)基的質(zhì)量控制定稿第一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一前言細(xì)胞培養(yǎng)基在生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用國內(nèi)外對細(xì)胞培養(yǎng)基的管理細(xì)胞培養(yǎng)基的質(zhì)量控制報(bào)告內(nèi)容第二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一前言

?細(xì)胞培養(yǎng)基從1903年開始發(fā)展?最初：天然組織液血液血清組織提取物體液的化學(xué)分析?1950年，199培養(yǎng)基?上世紀(jì)60年代，設(shè)計(jì)出無血清培養(yǎng)基第三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一簡單基礎(chǔ)培養(yǎng)基–BME(Eagle’s基礎(chǔ)培養(yǎng)基)–EMEM(Eagle’s最低必需培養(yǎng)基)–GMEM(Glasgow’s改良Eagle’s培養(yǎng)基)–DMEM(Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基)–RPMI(RoswellParkMemorialInstitute洛斯維公園紀(jì)念研究所培養(yǎng)基)第四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一BME(Eagle’s基礎(chǔ)培養(yǎng)基)

?最初為培養(yǎng)mouse‐L和HeLa細(xì)胞而設(shè)計(jì)?在所有合成細(xì)胞培養(yǎng)基中使用最廣泛的一種?可用于測定正常(WI‐38)和轉(zhuǎn)化(鼠‐L和HeLa)細(xì)胞單層的生長反應(yīng)?BME是Eagle’s最低必需培養(yǎng)基(EMEMorMEM)和Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)的前身第五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一EMEM(Eagle’s最低必需培養(yǎng)基)

?13種氨基酸?8種維生素?6種離子?可補(bǔ)充血清（提供必要的不明成分）必需氨基酸組氨酸

異亮氨酸亮氨酸賴氨酸甲硫氨酸(和/或

半胱氨酸)苯丙氨酸(和/或

酪氨酸)蘇氨酸色氨酸纈氨酸第六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一GMEM(Glasgow’s改良Eagle’s培養(yǎng)基)

?由lanMacPherson和MichaelStoker發(fā)明，以改良EAGLE‘S培養(yǎng)基?該培養(yǎng)基用于研究遺傳因子對細(xì)胞特性的影響。?該培養(yǎng)基是中BME的基礎(chǔ)上，添加10%胰蛋白示磷酸鹽和兩倍常規(guī)濃度的氨基酸和維生素。第七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一DMEM(Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基)

?DMEM最應(yīng)用最廣泛的改良Eagle‘s培養(yǎng)基。?DMEM是由基礎(chǔ)Eagle培養(yǎng)基(BME)改良而來，含有4倍濃度的氨酸酸和維生素，以及其它補(bǔ)充成分?最初的DMEM含有1000mg/L的葡萄糖，最初用于培養(yǎng)鼠胚胎細(xì)胞?為培養(yǎng)特定細(xì)胞，可將葡萄糖濃度優(yōu)化為4500。RenatoDulbecco,因1955年發(fā)明DMEM，于1975年獲諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)第八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一RPMI

(RoswellParkMemorialInstitute)

?由lanMacPherson和MichaelStoker發(fā)明，以改良EAGLE‘S培養(yǎng)基?該培養(yǎng)基用于研究遺傳因子對細(xì)胞特性的影響。?該培養(yǎng)基是中BME的基礎(chǔ)上，添加10%胰蛋白示磷酸鹽和兩倍常規(guī)濃度的氨基酸和維生素。第九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一細(xì)胞培養(yǎng)基在生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)基是以動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)為技術(shù)平臺，研發(fā)及生產(chǎn)生物藥品的關(guān)鍵原材料之一蛋白藥物抗體藥物人用疫苗獸用疫苗其它新藥研發(fā)和科學(xué)實(shí)驗(yàn)等“培養(yǎng)基雖不是細(xì)胞培養(yǎng)中唯一重要因素，但確實(shí)是最重要的一種”

——Wurm博士，瑞士聯(lián)邦科技學(xué)會(huì)生物工藝學(xué)教授

——2005，《GeneticEngineeringNews》細(xì)胞系/病毒株細(xì)胞培養(yǎng)基生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生物制藥核心要素第十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一細(xì)胞培養(yǎng)基在生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用2011年全球生物制藥市場銷售額為1600億，占據(jù)全球制藥份額的19%預(yù)計(jì)2015年生物制藥產(chǎn)品的銷售額將超過2400億生物制藥在制藥行業(yè)比重的增加決定著細(xì)胞培養(yǎng)基市場的不斷擴(kuò)大與發(fā)展，而生物制藥行業(yè)的發(fā)展趨勢也決定著細(xì)胞培養(yǎng)基市場的發(fā)展趨勢。全球利用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)生物制品的普及率到達(dá)80%，均使用個(gè)性化（或定制）的細(xì)胞培養(yǎng)基。個(gè)性化配方（屬于非公開、商業(yè)秘密）的細(xì)胞培養(yǎng)基占世界主要細(xì)胞培養(yǎng)基制造商銷售額的70-90%；無血清無動(dòng)物來源成分細(xì)胞培養(yǎng)有逐漸取代傳統(tǒng)的加血清培養(yǎng)方式的趨勢第十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一細(xì)胞培養(yǎng)基在生物制藥中的重要性細(xì)胞培養(yǎng)基實(shí)際上就是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的一個(gè)“菜籃子”工程，只要用到細(xì)胞來做生物技術(shù)產(chǎn)品就必須要用到細(xì)胞培養(yǎng)基。營養(yǎng)豐富的細(xì)胞培養(yǎng)基可以縮短細(xì)胞生長周期從而縮短生產(chǎn)周期，可以增加細(xì)胞密度、增加收獲次數(shù)、提高表達(dá)量，提高生物制品的產(chǎn)量培養(yǎng)基可能給生物制品帶來潛在污染，影響產(chǎn)品的分離純化，關(guān)系到生物制品的質(zhì)量安全第十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物疫苗疫苗細(xì)胞系疫苗細(xì)胞系口蹄疫病毒BHK-21牛副流感病毒3型MDBK豬繁殖與呼吸綜合征病毒(中國)Marc-145牛腹瀉病毒MDBK豬繁殖與呼吸綜合征病毒(美國)MA-104牛呼吸道合胞病毒MDBK狂犬病毒BHK-21牛鼻氣管炎病毒MDBK豬流感病毒MDCK犬腺病毒2型MDCK,VERO豬瘟活疫苗（暫行）ST犬細(xì)小病毒CrFK,F81豬回腸炎活疫苗（胞內(nèi)勞森氏菌）McCoy犬瘟熱病毒VERO,MA104豬偽狂犬病毒PK(15)犬副流感病毒2型MDCK,Vero豬細(xì)小病毒ST,PK(15),IBRS-2狗EHRLICHIA(一種立克次氏體病)DH82馬輪狀病毒MA104貓瘟病毒CRFK馬流感病毒MDCK貓腺病毒2型CRFK東方馬腦炎VERO貓白血病病毒FL72西方馬腦炎VERO馬病毒流產(chǎn)1型4型馬皮膚第十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一FDA對細(xì)胞培養(yǎng)基的管理FDA將細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品列為醫(yī)療器械中的Ⅱ類器械。大多數(shù)在美國進(jìn)行商業(yè)銷售的醫(yī)療器械都是通過上市前通告[510(k)]的形式得到批準(zhǔn)的，對Ⅱ類醫(yī)療器械產(chǎn)品（占46%左右），實(shí)行的是特殊控制，即企業(yè)在進(jìn)行注冊和列名后，還需實(shí)施GMP和遞交510（K）申請。FDAregardsCCMproductastypeIIapparatusinmedicalapparatus,mostmedicalapparatusesforcommercesalesareapprovedbyformofgivingpublicnotice[510(k)]beforetheycomeintothemarket,thetypeIImedicalapparatus(about46%)wasimplementedspecialcontrol,thattosayaftertheenterpriseregistereditstillalsoimplementGMPandsubmit510(K)application.第十四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一歐盟對細(xì)胞培養(yǎng)基的管理在歐盟，細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品作為一種由多種成分混合組成的物質(zhì)，必須向歐洲化學(xué)品管理局（ECHA）注冊，才能獲準(zhǔn)得進(jìn)入歐盟市場CCM,onematerialthatcomposedofvariousingredients,mustregisterinECHAcanbequalifiedtoenterintoEuropeanUnionmarket.第十五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一生物制藥企業(yè)對細(xì)胞培養(yǎng)基的要求臺灣生物制藥企業(yè)對細(xì)胞培養(yǎng)基生產(chǎn)企業(yè)的CGMP稽核依據(jù)臺灣《藥品優(yōu)良制造規(guī)范—原料藥作業(yè)基準(zhǔn)》以及國際醫(yī)藥品稽查協(xié)約組織（PIC/S）的規(guī)定對細(xì)胞培養(yǎng)基廠商進(jìn)行cGMP稽核，要求多達(dá)179項(xiàng)條款國內(nèi)抗體制藥企業(yè)向美國申報(bào)新藥的資料中，對細(xì)胞培養(yǎng)基的質(zhì)量要求：明確細(xì)胞培養(yǎng)基組分明確原輔料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)場質(zhì)量體系稽核報(bào)告第十六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一國內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)基行業(yè)的現(xiàn)狀生產(chǎn)企業(yè)國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)：8家左右在華銷售的國外企業(yè)（包括進(jìn)口分裝）：6家左右生產(chǎn)條件：相差較大市售產(chǎn)品有些產(chǎn)品沒有標(biāo)明組分添加動(dòng)物來源成分物質(zhì)某些進(jìn)口細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品無有效期進(jìn)口分裝培養(yǎng)基，分裝后未經(jīng)檢驗(yàn)就銷售第十七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一缺少相關(guān)專業(yè)學(xué)歷或資質(zhì)的生產(chǎn)和質(zhì)量管理人員生產(chǎn)環(huán)境簡陋檢驗(yàn)條件不足，不具備細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品全部質(zhì)量指標(biāo)的檢驗(yàn)條件，也不具備對原材料檢驗(yàn)的條件和能力無最終混合的批量概念沒有實(shí)行GMP管理國內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)基生產(chǎn)企業(yè)存在的問題第十八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一沒有實(shí)現(xiàn)行業(yè)管理目前，培養(yǎng)基即不屬于藥品，也不屬于按藥品管理的輔料，國家對細(xì)胞培養(yǎng)基沒有強(qiáng)制性質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，也未列入藥品生產(chǎn)管理范疇國內(nèi)監(jiān)管存在一定缺失第十九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一動(dòng)物細(xì)胞可以耐受的體外環(huán)境的各種成分的范圍比較窄（下表），所以對與之相關(guān)的培養(yǎng)基的質(zhì)量有必要進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量控制第二十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一細(xì)胞類型不同，采用的培養(yǎng)基類型也有差異一般要求?離子：Na,K,Ca,Mg,Cl,P,磷酸氫根?微量元素：鐵，鋅，

硒?糖，如葡萄糖?氨基酸?血清;含有激素和促生長因子同時(shí)，含抗生素，細(xì)胞生長不需要，但用于控制細(xì)菌污染此外，多數(shù)培養(yǎng)基含有pH指示劑，酚紅哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求第二十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一一、水二、低分子量營養(yǎng)物質(zhì)能量來源六碳糖丙酮酸鹽和核榶谷氨酰胺營養(yǎng)來源（氨基酸）維生素離子微量元素脂類和磷脂前體核酸（DNA和RNA）前體三、無營養(yǎng)物質(zhì)抗生素緩沖體系酚紅保護(hù)劑抗氧化劑還原劑哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分第二十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一一、水水質(zhì)是至關(guān)重要的水純化方法反滲透或蒸餾（去除主要的化學(xué)物質(zhì)）活性炭過濾（有機(jī)和無機(jī)雜質(zhì)）離子交換（微量的金屬或離子）微孔濾膜（微生物污染）評估水的純度電阻標(biāo)準(zhǔn)：25?C時(shí)，≥20MΩcm哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分第二十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一二、低分子量營養(yǎng)物質(zhì)1、能量來源6碳糖(5-20mM):除了glucose,也可以為細(xì)胞提供半乳糖和果糖等。在大多數(shù)細(xì)胞的膜上存在的是Glut1單糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體，同時(shí)也有一定數(shù)量的Glut2,Glut3等，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)其他不同種類的單糖，如果添加其他種類的單糖有助于調(diào)節(jié)glucose的轉(zhuǎn)運(yùn)速度，降低lactate的生成，維持pH穩(wěn)態(tài)。但是Glut5僅存在于一些特殊種類的細(xì)胞上，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)Fructose入胞。丙酮酸鹽,核榶哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分第二十四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一谷氨酰胺(1-20mM)，37度的半衰期t1/2=8days，終產(chǎn)物是游離的胺類物質(zhì)，具有細(xì)胞毒性;哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分L-Glutamine屬于溫度敏感性氨基酸，降解迅速第二十五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一2、營養(yǎng)來源（氨基酸）主要分為EAA，NEAA哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分第二十六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一3、維生素

哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分維生素包括：第二十七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一4、離子

哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分幾種常見培養(yǎng)基的離子濃度（μM）：第二十八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一5、微量元素

哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分第二十九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一6、脂肪酸

哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分無血清脂肪酸添加物組合預(yù)混試劑SupplementsSuppliersContentsNuserumCo.LabsSerumformulationreplacementCPSR-1SigmaSerumformulationreplacementCPSR-3SigmaSerumformulationreplacementCDGibcoMixtureofdefinedformulationoffattyacidLipidConsKabiBitrumInc.MixtureofLipidsLipidMix-1NeuronbcInc.MixtureoffattyacidLipidMix-2NeuronbcInc.Mixtureoffattyacid第三十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一7、核酸

哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分通常不是基礎(chǔ)培養(yǎng)基的必需成分當(dāng)葉酸不足時(shí)，可添加嘌呤和胸苷第三十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一三、無營養(yǎng)物質(zhì)1、抗生素細(xì)胞生長不需要，但用于控制細(xì)菌污染2、緩沖液一般采用碳酸氫根（HCO3‐），與培養(yǎng)環(huán)境中的CO2（5－10%）共同形成緩沖體系哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分第三十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一2、緩沖液通常會(huì)向培養(yǎng)基中添加有機(jī)緩沖劑HEPES（pH7.0）哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分第三十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一2、緩沖液哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分培養(yǎng)液pH值與培養(yǎng)環(huán)境中CO2壓力的關(guān)系第三十四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一3、酚紅用作pH指示劑會(huì)干擾純化哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分第三十五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一4、抗剪切力保護(hù)系統(tǒng)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分第三十六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一5、抗氧化保護(hù)劑

哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分6、還原劑

第三十七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一國家化工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《哺乳類動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基》（HG/T3935-2007）中的七項(xiàng)檢驗(yàn)指標(biāo):細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量指標(biāo)及檢測方法干燥減重的質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤5％Dryingloseweight≤5％pH滲透壓osmoticpressure微生物限度:Microbiallimit

細(xì)菌≤200CFU/gbacterium≤200CFU/g霉菌≤50CFU/gMould≤50CFU/g內(nèi)毒素＜10EU/mlEndomycin＜10EU/ml

細(xì)胞生長Cellgrowth澄清度Clarity細(xì)胞培養(yǎng)基CellCultureMedium第三十八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一哺乳細(xì)胞無血清培養(yǎng)基應(yīng)符合以下技術(shù)要求項(xiàng)目指標(biāo)澄清度澄清pH值（每升標(biāo)示量/L）3.0~7.0干燥減重的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）≤5.0滲透壓（mOsm/kgH2O）225~290細(xì)菌內(nèi)毒素（EU/ml）≤10微生物限度細(xì)菌數(shù)（CFU/g）≤200霉菌數(shù)（CFU/g）≤50細(xì)胞生長試驗(yàn)細(xì)胞形態(tài)正常細(xì)胞生長試驗(yàn)合格

細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量指標(biāo)及檢測方法第三十九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一考慮到生物制品的質(zhì)量和安全性對細(xì)胞培養(yǎng)基這種原材料的要求，個(gè)人認(rèn)為，若條件許可，應(yīng)增加了對細(xì)胞培養(yǎng)基中支原體污染、牛血清白蛋白殘留量、抗生素殘留量檢測。細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量指標(biāo)及檢測方法第四十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一1、澄清度檢查稱取每升標(biāo)示量的實(shí)驗(yàn)室樣品，置于1L燒杯中，加水1L，攪拌至溶解，按中華人民共和國藥典2010版二部附錄IXB澄清度檢查法進(jìn)行。2、pH值的測定稱取每升標(biāo)示量的實(shí)驗(yàn)室樣品，置于1L燒杯中，加水1L，攪拌至溶解，按中華人民共和國藥典2010版二部附錄VIHpH值測定法進(jìn)行。3、干燥減重的測定中華人民共和國藥典2010版二部附錄VIIIL干燥失重測定法進(jìn)行。取兩次平行測定結(jié)果的算術(shù)平均值為測定結(jié)果，兩次平行測定結(jié)果的絕對差值不大于這兩個(gè)測定值的算術(shù)平均值的10%。細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量指標(biāo)及檢測方法第四十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一4、滲透壓的測定稱取每升標(biāo)示量的實(shí)驗(yàn)室樣品，置于1L燒杯中，加水1L，攪拌至溶解，按中華人民共和國藥典2010版二部附錄IXG滲透壓摩爾濃度測定法進(jìn)行。取兩次平行測定結(jié)果的算術(shù)平均值為測定結(jié)果，兩次平行測定結(jié)果的絕對差值不大于這兩個(gè)測定值的算術(shù)平均值的5%。5、細(xì)菌內(nèi)毒素的測定按中華人民共和國藥典2010版二部附錄XIE細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的凝膠法進(jìn)行。稱取1/100每升標(biāo)示量的實(shí)驗(yàn)室樣品，精確至0.0001g，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（市售）10ml溶解，吸取該溶液0.1ml加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（市售）3.9ml，混勻即得試驗(yàn)溶液。細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量指標(biāo)及檢測方法第四十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一6、微生物限度的測定按中華人民共和國藥典2010版二部附錄XIJ微生物限度檢查法進(jìn)行，檢查項(xiàng)目為細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)。檢查法采用平皿法。稱取實(shí)驗(yàn)室樣品1g，精確至0.01g，