第二章細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)詳解演示文稿

第二章細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)詳解演示文稿當(dāng)前第1頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)優(yōu)選第二章細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)當(dāng)前第2頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)第一節(jié)顯微技術(shù)光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡當(dāng)前第3頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)—、光學(xué)顯微鏡當(dāng)前第4頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)（一）普通光學(xué)顯微鏡1.構(gòu)成：①照明系統(tǒng)②光學(xué)放大系統(tǒng)③機(jī)械裝置2.原理：經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡放大成虛像。當(dāng)前第5頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)StructureofMicroscope當(dāng)前第6頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)LightPathwayofMicroscope當(dāng)前第7頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)3.分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。光學(xué)顯微鏡的分辨力R=0.61λ/N．A．其中λ為入射光線波長(zhǎng)；N．A．為鏡口率

＝ｎsinα/2；n=介質(zhì)折射率；α=鏡口角（樣品對(duì)物鏡鏡口的張角）。當(dāng)前第8頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)表一、幾種介質(zhì)的折射率當(dāng)前第9頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)顯微鏡的幾個(gè)光學(xué)特點(diǎn)：介質(zhì)折射率越接近鏡頭玻璃的（1.7）越好；sinα/2的最大值小于1；鏡口率最大約1.6；普通光線的波長(zhǎng)為400~700nm，光鏡分辨力約為0.2μm，人眼的分辨力為0.2mm，因此顯微鏡的最大有效倍數(shù)為1000X。當(dāng)前第10頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)（二）熒光顯微鏡Fluorescencemicroscope特點(diǎn)：光源為短波光；有兩個(gè)特殊的濾光片；照明方式通常為落射式。當(dāng)前第11頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第12頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)Fluorescenceimage,DNAinblueandMicrotubulesingreen用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。當(dāng)前第13頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)（三）激光共聚焦掃描顯微境

Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描；能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)；分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍；用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。當(dāng)前第14頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)laserconfocalscanningmicroscope,LCSM當(dāng)前第15頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)激光共聚焦掃描顯微鏡光路圖當(dāng)前第16頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)LCSMImageofaXenopusMelanophore當(dāng)前第17頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)（四）暗視野顯微鏡darkfieldmicroscope聚光鏡中央有擋光片，視野背景是黑的，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，物體邊緣是亮的。可觀察4~200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。當(dāng)前第18頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)（五）相差顯微鏡把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處。環(huán)形光闌（annulardiaphragm）：位于光源與聚光器之間。相位板（annularphaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。當(dāng)前第19頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)原理當(dāng)前第20頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本。當(dāng)前第21頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)（六）偏光顯微鏡polarizingmicroscope用于檢測(cè)具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等。進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器（與起偏器方向垂直的偏振片）。載物臺(tái)可以旋轉(zhuǎn)。淀粉當(dāng)前第22頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)（七）微分干涉差顯微鏡Differentialinterferencecontrastmicroscope（DIC）1952年Nomarski發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，加強(qiáng)影像的明暗效果，能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。當(dāng)前第23頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)（八）倒置顯微鏡inversemicroscope物鏡與照明系統(tǒng)顛倒；用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，通常具有相差或DIC物鏡，有的還具有熒光裝置。當(dāng)前第24頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)（九）當(dāng)代顯微鏡的發(fā)展趨勢(shì)采用組合方式，集普通光鏡、相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體；自動(dòng)化與電子化。當(dāng)前第25頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)二、電子顯微鏡（一）透射電子顯微鏡transmissionelectronmicroscope,TEM當(dāng)前第26頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)1.原理以電子束作光源，電磁場(chǎng)作透鏡。電子束波長(zhǎng)與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比；由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成；分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍；用于觀察超微結(jié)構(gòu)（小于0.2μm）。當(dāng)前第27頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)表二、不同光線的波長(zhǎng)當(dāng)前第28頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)TEMLIGHTPATHWAY當(dāng)前第29頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE，TEM當(dāng)前第30頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)2.制樣技術(shù)1）超薄切片超薄切片厚度僅50nm左右，用超薄切片機(jī)（ultramicrotome）制作。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。當(dāng)前第31頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第32頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)2）負(fù)染技術(shù)用重金屬鹽(如磷鎢酸)染色；吸去染料干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右。NegativeStainedArchaebacteria當(dāng)前第33頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)3）冰凍蝕刻freeze-etching亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露斷面結(jié)構(gòu)。向斷面噴涂一層蒸汽鉑和碳。然后將組織溶掉，把鉑和碳的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replica）。當(dāng)前第34頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)anonionroottipcellwithnoetching.斷面的三種處理方法：蝕刻（etching）、不蝕刻（noetching）、深度蝕刻（deepetching）當(dāng)前第35頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)面的深度蝕刻電鏡照片，示

Clathrin衣被當(dāng)前第36頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)（二）掃描電子顯微鏡20世紀(jì)60年代問世，用來觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)；分辨力為6~10nm，因人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個(gè)光點(diǎn)的能力）為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。當(dāng)前第37頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)Scanningelectronmicroscope（SEM）當(dāng)前第38頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)工作原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級(jí)電子由探測(cè)器收集，信號(hào)經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。當(dāng)前第39頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)SEMLIGHTPATHWAY當(dāng)前第40頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)人類紅細(xì)胞當(dāng)前第41頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)酵母當(dāng)前第42頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)人類精子當(dāng)前第43頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)（三）掃描隧道顯微鏡

scanningtunnelingmicroscope，STM原理：根據(jù)隧道效應(yīng)設(shè)計(jì)，當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個(gè)納米的高度上掃描樣品時(shí)，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV~2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強(qiáng)度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。分辨率：橫向?yàn)?.1~0.2nm，縱向可達(dá)0.01nm。用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察。當(dāng)前第44頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)掃描隧道顯微鏡原理引自http://www.iap.tuwien.ac.at當(dāng)前第45頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)STMimageofaDNAmolecule當(dāng)前第46頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)SchematicdrawingofAFM當(dāng)前第47頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)三、顯微操作技術(shù)

micromanipulationtechnique是在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。包括細(xì)胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等。細(xì)胞核移植技術(shù)已有幾十年的歷史，1952年，Briggs和King等將不同階段的蛙胚細(xì)胞核注入去核的蛙卵，構(gòu)建核移植胚。Gordon（1962）證明原腸胚以后的細(xì)胞核移植能發(fā)育到成體。1997年，Wilmut等克隆了綿羊Dolly。當(dāng)前第48頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)顯微操作儀當(dāng)前第49頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)轉(zhuǎn)基因顯微操作過程

當(dāng)前第50頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)第二節(jié)生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)一、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)當(dāng)前第51頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色方法用于對(duì)某些細(xì)胞成分進(jìn)行定性和定位研究。（一）固定物理固定：血膜空氣干燥、冷凍干燥?；瘜W(xué)固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定，顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。當(dāng)前第52頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)（二）顯示方法金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。Schiff反應(yīng)：醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應(yīng)）。聯(lián)苯胺反應(yīng)：過氧化酶分解H202。產(chǎn)生新生氧，后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變成棕色化合物。脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì)。當(dāng)前第53頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)二、免疫細(xì)胞化學(xué)immunocytochemistry是利用抗體同特定抗原專一結(jié)合的原理，對(duì)抗原進(jìn)行定位測(cè)定的技術(shù)。常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。免疫熒光法（immunofluorescenttechnique）：如異硫氰酸熒光素、羅丹明等。酶標(biāo)免疫法（enzyme-labeledantibodymethod）：如辣根過氧化物酶。當(dāng)前第54頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)三、放射自顯影術(shù)用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。原理：將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時(shí)間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。一般用14C和3H標(biāo)記。常用3H-TDR來顯示DNA，用3H-UDR顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。14C半衰期為5730年，3H為12.5年。當(dāng)前第55頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)四、分子雜交技術(shù)具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測(cè)定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補(bǔ)關(guān)系。（一）原位雜交（insituhybridization）。用于檢測(cè)染色體上的特殊DNA序列。最初是使用放射性DNA探針，后來又發(fā)明了免疫探針法。當(dāng)前第56頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片當(dāng)前第57頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)（二）Southern雜交是體外分析特異DNA序列的方法，操作時(shí)先用限制性內(nèi)切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，通過放射自顯影，即可辨認(rèn)出與探針互補(bǔ)的特殊核苷序列。將RNA轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交，則稱為Northern雜交。當(dāng)前第58頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)六、PCR技術(shù)PCR即：polymerasechainreaction。反應(yīng)體系：①樣品DNA；②引物（primer），約15-20個(gè)核苷酸；③4種dNTP；④TagDNA聚合酶，來自于嗜熱水生菌Thermusaquaticus，最適作用溫度75~80℃，短時(shí)間在95℃下不失活。⑤緩沖體系和Mg2+。反應(yīng)過程：①變性：約90-95℃；②復(fù)性：約60℃左右；③延伸：70-75℃；④重復(fù)“變性——復(fù)性——延伸”過程20-30次循環(huán)。當(dāng)前第59頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)PCR原理當(dāng)前第60頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)第三節(jié)細(xì)胞分離技術(shù)當(dāng)前第61頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)一、離心技術(shù)是分離細(xì)胞器及各種大分子基本手段。轉(zhuǎn)速10~25kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。轉(zhuǎn)速>25kr/min，離心力>89Kg者稱為超速離心機(jī)。超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100000r/min，離心力超過500kg。當(dāng)前第62頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)（一）差速離心Differentialcentrifugation特點(diǎn)：介質(zhì)密度均一；速度由低向高，逐級(jí)離心。用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。沉降順序：核——線粒體——溶酶體與過氧化物酶體——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體——核蛋白體?？蓪⒓?xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過密度梯離心再行分離純化。當(dāng)前第63頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation當(dāng)前第64頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)（二）密度梯度離心用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞和細(xì)胞成分分層、分離。類型：速度沉降、等密度沉降。常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時(shí)，粘度不高；2）PH中性或易調(diào)為中性；3）濃度大時(shí)滲透壓不大；4）對(duì)細(xì)胞無毒。當(dāng)前第65頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)1.速度沉降velocitysedimentation用途：分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。特點(diǎn)：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。當(dāng)前第66頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)2.等密度沉降isopycnicsedimentation用途：分離密度不等的顆粒。特點(diǎn)：介質(zhì)密度高，陡度大，介質(zhì)最高密度大于被分離組分的最大密度。力場(chǎng)比速率沉降法大10~100倍，需要高速或超速離心。原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時(shí)間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的成分分離。當(dāng)前第67頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation當(dāng)前第68頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)二、流式細(xì)胞術(shù)用途：對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測(cè)器檢測(cè)，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計(jì)（flowcytometer）。當(dāng)前第69頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第70頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)三、細(xì)胞電泳原理：在一定PH值下細(xì)胞表面帶有凈的正或負(fù)電荷，能在外加電場(chǎng)的作用下發(fā)生泳動(dòng)。各種細(xì)胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細(xì)胞荷電量有所不同，故在一定的電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度不同。用途：檢測(cè)細(xì)胞生理狀態(tài)、分離不同種類的細(xì)胞。當(dāng)前第71頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)第四節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交一、細(xì)胞培養(yǎng)當(dāng)前第72頁\共有78頁\編于星期五\22點(diǎn)（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)群體培養(yǎng)（massculture）：將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，匯合（confluence）后形成均勻的單細(xì)胞層；克隆培養(yǎng)（clonalculture）：培養(yǎng)高度稀釋的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，稱為克隆。當(dāng)前第73頁\共