細胞生物學(xué)的研究思路詳解演示文稿

細胞生物學(xué)的研究思路詳解演示文稿當(dāng)前第1頁\共有73頁\編于星期四\21點（優(yōu)選）細胞生物學(xué)的研究思路當(dāng)前第2頁\共有73頁\編于星期四\21點研究背景Waardenburg綜合征（Waardenburgsyndrome，WS）是最常見的綜合征型遺傳性耳聾，主要遺傳方式是單基因致病的常染色體顯性遺傳伴不全外顯。主要臨床特征：耳聾與著色異常（虹膜、皮膚、毛發(fā)）分型致病基因臨床表型特征WS1PAX3耳聾、著色異常、眼距增寬WS2MITF、SOX10、SNAI2耳聾、著色異常WS3PAX3耳聾、著色異常、上肢發(fā)育異常(Klein-Waardenburg綜合征)WS4SOX10、END3、ENDBR耳聾、著色異常、巨結(jié)腸(Shah-Waardenburg綜合征)當(dāng)前第3頁\共有73頁\編于星期四\21點神經(jīng)嵴發(fā)育不全：由于神經(jīng)嵴細胞（neuralcrestcells，NCC）發(fā)育缺陷或障礙而導(dǎo)致神經(jīng)嵴出現(xiàn)異常的增殖、生存、遷徙和分化。由于NCC發(fā)育不良導(dǎo)致的這些組織和細胞的病變統(tǒng)稱為神經(jīng)嵴病。研究背景當(dāng)前第4頁\共有73頁\編于星期四\21點研究背景當(dāng)前第5頁\共有73頁\編于星期四\21點分型致病基因氨基酸改變耳聾虹膜異色皮膚色素改變內(nèi)眥異位巨結(jié)腸WS2MITFR217I先天性亮藍色虹膜面部大量雀斑——WS2MITFT192fs先天性完全性虹膜異色———WS1PAX3H80D先天性完全性虹膜異色—+—WS1PAX3H186fs先天性亮藍色虹膜—+—WS2SOX10E248fs先天性亮藍色虹膜———WS2SOX10G37fs先天性亮藍色虹膜———WS2SOX10G38fs先天性亮藍色虹膜———WS2SOX10R43X先天性完全性虹膜異色面部少量雀斑——WS4SOX10W85X先天性完全性虹膜異色——+研究背景本研究Waardenburg綜合征病例基因型和表型特征當(dāng)前第6頁\共有73頁\編于星期四\21點研究背景當(dāng)前第7頁\共有73頁\編于星期四\21點基因組水平：WS致病基因突變檢測后基因組水平：WS致病基因功能檢測分子水平：WS發(fā)病機制臨床水平：WS基因型如何導(dǎo)致表型研究目的前期研究本文研究表型基因型基因型表型？當(dāng)前第8頁\共有73頁\編于星期四\21點研究內(nèi)容蛋白表達水平PAX3與SOX10相互作用活性檢測蛋白亞細胞定位蛋白與DNA的結(jié)合MITFPAX3SOX1012345invitro當(dāng)前第9頁\共有73頁\編于星期四\21點

課程提綱蛋白質(zhì)加標(biāo)簽(Tag);定點突變；轉(zhuǎn)染亞細胞定位；Reporterassay；DNA-蛋白質(zhì)相互作用；蛋白質(zhì)相互作用；蛋白質(zhì)半衰期。當(dāng)前第10頁\共有73頁\編于星期四\21點蛋白質(zhì)加上標(biāo)簽(Tag)Why：便于檢測；市場上有很好的針對標(biāo)簽蛋白的抗體。What：Flag:DYKDDDDK；HA：YPYDVPDYA；

c-Myc：EQKLISEEDL；V5：GKPIPNPLLGLDSTHow：前提是不能影響蛋白質(zhì)的功能當(dāng)前第11頁\共有73頁\編于星期四\21點

課程提綱蛋白質(zhì)加標(biāo)簽(Tag);定點突變；轉(zhuǎn)染亞細胞定位；Reporterassay；DNA-蛋白質(zhì)相互作用；蛋白質(zhì)相互作用；蛋白質(zhì)半衰期。當(dāng)前第12頁\共有73頁\編于星期四\21點定點突變site-directedmutagenesisQuikChange?Site-DirectedMutagenesisKit(Stratagene公司)當(dāng)前第13頁\共有73頁\編于星期四\21點突變引物設(shè)計GoogleSearch“Quikchangeprimerdesign”當(dāng)前第14頁\共有73頁\編于星期四\21點

原始質(zhì)粒

原始質(zhì)粒改造

突變質(zhì)粒構(gòu)建

DNA測序鑒定當(dāng)前第15頁\共有73頁\編于星期四\21點

課程提綱蛋白質(zhì)加標(biāo)簽(Tag);定點突變；轉(zhuǎn)染;亞細胞定位；Reporterassay；DNA-蛋白質(zhì)相互作用；蛋白質(zhì)相互作用；蛋白質(zhì)半衰期。當(dāng)前第16頁\共有73頁\編于星期四\21點轉(zhuǎn)染-transfection TransfectionisamethodoftransportingDNA,RNAand/orvariousmacromoleculesintoaneukaryoticcellbyusingchemical,lipidorphysicalbasedmethods.當(dāng)前第17頁\共有73頁\編于星期四\21點TransfectionmethodsDEAEdextranCationicpolymerCalciumphosphate磷酸鈣Electroporation電穿孔Microinjection顯微注射Cationicliposome當(dāng)前第18頁\共有73頁\編于星期四\21點DEAE-dextranDiethylaminoethyl(DEAE)-dextranisoneoftheoldestmethodsforintroducingnucleicacidsintoculturedmammaliancells.ThepositivelychargedDEAE-dextranmoleculeinteractswiththenegativelychargedphosphatebackboneofthenucleicacid.TheDNA–DEAEdextrancomplexesappeartoadsorbontothecellsurfaceandbetakenupbyendocytosis.優(yōu)缺點：僅適合瞬轉(zhuǎn)（transienttransfection），不適合穩(wěn)轉(zhuǎn)；細胞毒較高；重復(fù)性較好。當(dāng)前第19頁\共有73頁\編于星期四\21點CationicpolymerBranched(A)

andlinear(B)polyethyleneimine(PEI)商品名：ExGen500，Turbofect當(dāng)前第20頁\共有73頁\編于星期四\21點CalciumPhosphate磷酸鈣

TheprincipleinvolvesmixingDNAinaphosphatebufferwithcalciumchloride.Theresultingcalcium-phosphate–DNAcomplexesadheretothecellmembraneandenterthecytoplasmbyendocytosis.優(yōu)缺點：適合穩(wěn)轉(zhuǎn)；重復(fù)性較差，主要影響因素包括溶液的pH值；一些細胞不適合磷酸鈣轉(zhuǎn)染。當(dāng)前第21頁\共有73頁\編于星期四\21點CationicLiposome脂質(zhì)體Theliposomescurrentlyinusetypicallycontainamixtureofcationicandneutrallipidsorganizedintolipidbilayerstructures.Transfection-complexformationisbasedontheinteractionofthepositivelychargedliposomewiththenegativelychargedphosphategroupsofthenucleicacid.Theuptakeoftheliposome–DNAcomplexesmaybemediatedbyendocytosis.品牌：Lipofectamine(Invitrogen)。優(yōu)缺點：轉(zhuǎn)染效率高；重復(fù)性好；轉(zhuǎn)染時需降低血清濃度，從而提高了細胞毒性；當(dāng)前第22頁\共有73頁\編于星期四\21點當(dāng)前第23頁\共有73頁\編于星期四\21點ElectroporationCellsinasuitablecuvettearesubjectedtoashorthigh-voltagepulsethatcausesthemembranepotentialofthecellstobreakdown.Asaresult,poresareformedthroughwhichmacromoleculessuchasDNAcanenter.優(yōu)缺點：適合幾乎所有的細胞；瞬轉(zhuǎn)、穩(wěn)轉(zhuǎn)；需要DNA量大；高達50–70%細胞死亡；當(dāng)前第24頁\共有73頁\編于星期四\21點MicroinjectionDirectMicroinjection:Useofafineneedle.HasbeenusedfortransferofDNAintoembryonicstemcells.當(dāng)前第25頁\共有73頁\編于星期四\21點研究結(jié)果野生/突變PAX3蛋白表達野生/突變SOX10蛋白表達AB當(dāng)前第26頁\共有73頁\編于星期四\21點

課程提綱蛋白質(zhì)加標(biāo)簽(Tag);定點突變；轉(zhuǎn)染;亞細胞定位；Reporterassay；DNA-蛋白質(zhì)相互作用；蛋白質(zhì)相互作用；蛋白質(zhì)半衰期。當(dāng)前第27頁\共有73頁\編于星期四\21點ReporterAssay:

fortranscriptionalfactors(TF)PromoterGeneofinterestTFDBDADPromoterReportergeneTFDBDADTF:transcriptionalfactorAD:activationdomainDBD:DNA-bindingdomainReporterGene:Agenewithareadilymeasurablephenotypethatcanbeeasilydistinguishedoverabackgroundofendogenousproteins.當(dāng)前第28頁\共有73頁\編于星期四\21點ReportergenesCAT：chloramphenicolacetyltransferase-gal：(-galactosidase)SEAP：(secretedalkalinephosphatase)LuciferaseGFP：GreenFluorescentProtein……當(dāng)前第29頁\共有73頁\編于星期四\21點CAT：chloramphenicolacetyltransferase氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶1streportergeneusedtomonitortranscriptionalactivityincells;：Bacterialenzymethattransfersacetylgroupsfromacetyl-CoAtochloramphenicol,detoxifyingit;Reactionquantifiedusingradiolabeledsubstrates(14C-chloramphenicol)orbyELISA(non-radioactive).當(dāng)前第30頁\共有73頁\編于星期四\21點CATassay：acetylated&non-acetylatedchloremphenicolarechechedbyTLC當(dāng)前第31頁\共有73頁\編于星期四\21點CATassay：

ELISA當(dāng)前第32頁\共有73頁\編于星期四\21點-gal(-galactosidase):E.colienzyme(encodedbylacZ)thathydrolyzessugarssuchaslactoseManyassayformats:colorimetric,fluorescent,chemiluminescent當(dāng)前第33頁\共有73頁\編于星期四\21點SEAP

(secretedalkalinephosphatase):Secretedoutsidethecell(canassaysamplerepeatedly andnon-destructivelybysamplingculturemedium)Thisproteinisquantifieddirectlybymeasuringtheenzymeactivityinthesupernatantoftheculturemedium.Fluorescenceandchemiluminescenceassaysareavailablefordetection.當(dāng)前第34頁\共有73頁\編于星期四\21點當(dāng)前第35頁\共有73頁\編于星期四\21點Luciferase:Firefly(Photinuspyralis)luciferaseSeapansy(Renillareniformis)luciferaseFireflyluciferaseproduceslightbyATP-dependent PhotinuspyralisRenillareniformis當(dāng)前第36頁\共有73頁\編于星期四\21點GFP:GreenFluorescentProteinDerivedfromjellyfishAequoreavictoriaAutofluorescentuponUVirradiation(doesn’trequirecofactorsorsubstrates)Retainsactivityinpresenceofheat,denaturants,detergents,mostproteasesAllowsfornon-invasivemonitoringofgeneexpressioninlivingtissues當(dāng)前第37頁\共有73頁\編于星期四\21點研究方法熒光素酶活性檢測（Luciferaseactivityassay）當(dāng)前第38頁\共有73頁\編于星期四\21點研究結(jié)果ABMITFpromoterMITFpromoterPAX3

SOX10

當(dāng)前第39頁\共有73頁\編于星期四\21點研究結(jié)果E248fs突變對野生SOX10蛋白產(chǎn)生顯性負效應(yīng)作用當(dāng)前第40頁\共有73頁\編于星期四\21點

課程提綱蛋白質(zhì)加標(biāo)簽(Tag);定點突變；轉(zhuǎn)染;亞細胞定位；Reporterassay；DNA-蛋白質(zhì)相互作用；蛋白質(zhì)相互作用；蛋白質(zhì)半衰期。當(dāng)前第41頁\共有73頁\編于星期四\21點亞細胞定位subcellularlocalization免疫熒光（immunofluorescence）；細胞器分離。當(dāng)前第42頁\共有73頁\編于星期四\21點Immunofluorescence利用免疫熒光（immunofluorescence）技術(shù)染色目標(biāo)蛋白；利用細胞器特異性抗體或者標(biāo)記物染色細胞器；激光共聚焦顯微鏡觀察，當(dāng)前第43頁\共有73頁\編于星期四\21點當(dāng)前第44頁\共有73頁\編于星期四\21點Subcellularfraction當(dāng)前第45頁\共有73頁\編于星期四\21點研究結(jié)果1.野生/突變PAX3蛋白亞細胞定位ZhangH,etal.HumGenet,2012,131:491-503.當(dāng)前第46頁\共有73頁\編于星期四\21點研究結(jié)果2.野生/突變SOX10蛋白亞細胞定位ZhangH,etal.HumGenet,2012,131:491-503.當(dāng)前第47頁\共有73頁\編于星期四\21點

課程提綱蛋白質(zhì)加標(biāo)簽(Tag);定點突變；轉(zhuǎn)染;亞細胞定位；Reporterassay；DNA-蛋白質(zhì)相互作用；蛋白質(zhì)相互作用；蛋白質(zhì)半衰期。當(dāng)前第48頁\共有73頁\編于星期四\21點DNA-蛋白質(zhì)相互作用ElectroMobilityShiftAssay(EMSA)DNAprecipitationChIP:Chromatinimmunoprecipitation當(dāng)前第49頁\共有73頁\編于星期四\21點EMSA:PrincipleR.Voll09/01Adouble-strandedoligonucleotidecontainigaNF-B-bindingsiteislabeled

witharadioactiveisotopeandincubatedwithanuclearextract.Duringgel-electrophoresis,NF-Bboundtotheoligonucleotidecausesashiftcomparedtothefreeprobe.NF-BFreeProbeRadioaktivelylabeledoligonucleotidewithNF-B-bindingsite(probe)andboundNF-B

RadioactivelylabeledoligonucleotidewithNF-B-bindingsite(probe)Nuclearextract

ofnon-activated

cellsNuclearextractofactivatedcells當(dāng)前第50頁\共有73頁\編于星期四\21點R.Voll09/01SupershiftAdouble-strandedoligonucleotidecontainigaNF-B-bindingsiteislabelled

radioactiveandincubatedwithanuclearextract.Duringgel-electrophoresis,NF-Bboundtotheoligonucleotidecausesashiftcomparedtothefreeprobe.p50/p65FreeprobeRadioaktivlabelledoligonucleotidewithNF-B-bindingsite(probe)andboundNF-B

RadioactivlabelledoligonucleotidewithNF-B-bindingsite(probe)Nuclearextract

ofactivatedcellsNuclearextractofactivatedcellswithanti-p50antibodyp50/p65+anti-p50當(dāng)前第51頁\共有73頁\編于星期四\21點CompetitionwithUnlabeledOligosIncreasingamountsofunlabeledoligoscontainingtheNF-kBbindingsiteorunlabeledoligoswithamutatedbindingsitewereaddedtothereactionmixpriortogelelectrophoresis.Specificbindingisextinguishedonlybythenon-mutatedoligo.p50/p50Free

probep50/p65WildtypeoligoMutatedoligoGGGGACTTTCCCGGAGACTTTCCC當(dāng)前第52頁\共有73頁\編于星期四\21點BBBiotinylateddsDNACelllysateStreptavidin-agroseBDetectproteinlevelwithWesternblot當(dāng)前第53頁\共有73頁\編于星期四\21點MITFPAX3SOX10當(dāng)前第54頁\共有73頁\編于星期四\21點ChIP：染色體共沉淀當(dāng)前第55頁\共有73頁\編于星期四\21點NegativecontrolAmplifyDNAandLabelCross-linkwholecellswithformaldehydeIsolategenomicDNAAddprotein-specificantibodyImmunoprecipitateandpurifyimminocomplexesReversecross-linksandpurifyDNASonicateDNAtoproducesheared,solublechromtinChIP-PCRTargetgeneNoDNAInputDNAIgGSp1c-Fosc-JunPCRHybridizetoarraysChIP-chipsequencingRegionsequencedChIP-seq當(dāng)前第56頁\共有73頁\編于星期四\21點

課程提綱蛋白質(zhì)加標(biāo)簽(Tag);定點突變；轉(zhuǎn)染;亞細胞定位；Reporterassay；DNA-蛋白質(zhì)相互作用；蛋白質(zhì)相互作用；蛋白質(zhì)半衰期。當(dāng)前第57頁\共有73頁\編于星期四\21點ProteininteractionGlutathione-S-Transferase(GST)pulldownYeastTwo-hybridCo-ImmunoprecipitationFluorescenceResonanceEnergyTransfer(FRET)SurfacePlasmonResonance(SPR)當(dāng)前第58頁\共有73頁\編于星期四\21點融合蛋白pull-down實驗

融合蛋白pull-down技術(shù)基本原理是將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上(如Sepharose),當(dāng)細胞抽提液經(jīng)過該基質(zhì)時，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒有被吸附的“雜質(zhì)”則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過改變洗脫液或洗脫條件而回收下來。為了更有效地利用pull-down技術(shù)，可以將待純化的蛋白以融合蛋白地形式表達，即將“誘餌”蛋白與一種易于純化地配體蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase,GST）融合標(biāo)簽從細菌中一步純化出GST融合蛋白。GST融合蛋白在經(jīng)過固定有GSH(glutathione)的色譜柱時，就可以通過GST與GSH的相互作用而被吸附。當(dāng)再有細胞抽提物過柱，就可得到能夠與“誘餌”蛋白相互作用的興趣蛋白。當(dāng)前第59頁\共有73頁\編于星期四\21點洗脫（2）結(jié)合（3）檢測（6）收集（5）洗脫（4）固定誘餌蛋白（1）當(dāng)前第60頁\共有73頁\編于星期四\21點GSTpulldown當(dāng)前第61頁\共有73頁\編于星期四\21點免疫共沉淀當(dāng)