芒果細菌性角斑病菌對芒果酚類代謝的影響

芒果細菌性角斑病菌對芒果酚類代謝的影響李國平,鄭磊,柳收稿日期：收稿日期：修回日期：基金項目：國家重點研發(fā)計劃（No.2019YFD1001100）；中央非盈利性研究機構基本科研業(yè)務費專項（No.1630062020014）。作者簡介：李國平(1968-)，男，農藝師，從事熱帶果樹病蟲害綜合防控研究。E-mail：guopinli@163.com。*通信作者：柳鳳（1984-），女，副研究員，從事植物病害防治工作，E-mail：liufengneau@163.com。（中國熱帶農業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所農業(yè)部熱帶果樹生物學重點實驗室,廣東湛江,524091）摘要由柑橘黃單胞菌芒果致病變種引起的芒果細菌性角斑病是芒果生產上的重要病害，為探討芒果感染細菌性角斑病過程中芒果葉片內酚類代謝的變化規(guī)律，以細菌性角斑病高抗品種紅芒6號和高感品種貴妃芒為試驗材料，測定了接種病菌（Xanthomonascitripv.mangiferaeindicae，Xcm）后芒果葉片內總酚、類黃酮、阿魏酸、木質素含量及酚類代謝相關酶（PPO和PAL）活性的變化趨勢。接種病菌后，感（貴妃芒）、抗（紅芒6號）芒果品種體內酚類物質均發(fā)生明顯的變化。總酚、類黃酮、阿魏酸、木質素含量、PAL和PPO活性在接種病菌后均直線上升，但總酚、類黃酮、阿魏酸、木質素含量增幅抗病品種較高，且感病品種在侵染后期總酚和類黃酮均迅速降低；而PAL、PPO活性感病品種增幅較高。相關性分析表明芒果葉片的總酚、類黃酮、阿魏酸、木質素含量與芒果抗性呈正相關，而PAL、PPO活性與抗病性呈負相關。關鍵詞芒果；細菌性角斑病菌；酚類代謝芒果細菌性角斑病又名芒果細菌性黑斑病、芒果細菌性潰瘍病，是由柑橘黃單胞菌芒果致病變種（Xanthomonascitripv.mangiferaeindicae，Xcm）引起的芒果生產上的主要病害，該病可危害芒果的葉、莖、花和果實等大部分芒果組織，如遇到高溫高濕或者臺風雨天氣，病害發(fā)生尤為嚴重。該病的最大特點是果實染病后，果面布滿斑點，失去商品價值，嚴重時可造成落果失收，且該病一旦發(fā)生后即使利用化學農藥控制住其進一步蔓延，但染病的果面上的斑點卻無法去除，因而果實商品價值大打折扣，因此預防該病的發(fā)生是芒果生產保駕護航的唯一手段[1]。次生代謝在寄主植物抵御微生物侵染過程中發(fā)揮著至關重要的作用，酚類物質是植物抗病反應的主要次生代謝生化物質。植物體內酚類物質的代謝是一個復雜過程，主要通過苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶等酶類催化苯丙烷代謝途徑合成木質素、類黃酮、植保素、醌類等物質[2-3]，這些物質參與殺死植物自身細胞引起過敏性反應、氧化還原反應、木質化形成和對毒素的應激活性等生理過程[4-5]。研究表明，酚類物質的升高降低與植物抗性無明顯相關性，各種物質之間通過相關轉化從而協(xié)調作用[6-7]。本研究以細菌性角斑病高抗品種紅芒6號和高感品種貴妃芒為試驗材料，通過比較人工接種Xcm后感病和抗病品種芒果內酚類代謝的差異，旨在闡明Xcm侵染對芒果酚類代謝的影響，豐富芒果細菌性角斑病病理的基礎理論，為進一步研究病害發(fā)生的內在機制以及芒果細菌性角斑病的防控提供有價值的理論依據。1材料與方法1.1供試菌株供試病原菌編號為Xcm003，由本實驗室分離自典型芒果細菌性角斑病癥狀的芒果果實，致病性測定具有強致病力，經形態(tài)學觀察、生理生化測定及全基因組測序鑒定為柑橘黃單胞菌芒果致病變種Xanthomonascitripv．mangiferaeindicae[8]。1.2供試芒果品種根據田間表型和室內離體接種病菌觀察的結果，選擇細菌性角斑病高抗品種紅芒6號和高感品種貴妃芒為試驗芒果品種。1.3試驗設計試驗在本單位農業(yè)部隔離檢驗檢疫室內進行，選取健康生長的紅芒6號和貴妃芒的一年實生苗為材料，每個品種5棵，選取嫩葉（黃轉綠）采用刺傷接種法接種，以搖床培養(yǎng)48h后濃度約為4×106cfu/mL的Xcm懸浮液作為接種體，接種后保濕培養(yǎng)，分別在接種后12、24、48、96、144、192h取樣，每次取樣隨機選取5個葉片，重復測定3次，以相同處理的無菌水為對照。1.4酚類物質的測定多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測定參照李榮花等（2005）的方法加以改進[9]?？偡印㈩慄S酮含量測定參照PirieandMullins（1976）的方法，總酚含量表示為OD280/gFW，類黃酮含量用OD325/gFW表示[10]。阿魏酸含量參考邱永祥的方法并略有改進[11]。木質素的方法參照翟艷霞（2006）的方法[12]。1.5數(shù)據處理數(shù)據的處理和分析均采用MicrosoftExcel2007軟件及SPSS10.0forWindows統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析和Duncan's（鄧肯氏）多重差異比較，P<0.05為差異具有顯著性。2結果與分析2.1多酚氧化酶（PPO）的變化接種Xcm后，芒果抗感品種的PPO酶活性變化如圖1所示。無論是抗病品種還是感病品種，接種病菌后PPO活性均明顯高于清水處理。感病品種貴妃芒接種48h就達到頂峰，是清水對著的1.8倍，隨后一直保持較高水平，紅芒6號接種病菌96h前變化不明顯，與清水對著之前無顯著差異，但在接種病菌144h后上升3-4倍，比清水對照高2.5倍。綜合比較芒果抗感品種在接種Xcm后PPO酶活性可以看出，感病品種應激反應較快，但是上升幅度低于抗病品種。圖1芒果接種Xcm后PPO活性的變化2.2苯丙氨酸解氨酶（PAL）的變化芒果抗感品種接種細菌性角斑病病菌后，葉片內PAL酶活性變化如圖2所示?？垢衅贩N葉片PAL酶活性均有所提高，在接種病菌48h和144h時達到頂峰，分別為4371U/(g·min)和8837.5U/(g·min)，是相應清水對著的2和6.2倍。綜合比較發(fā)現(xiàn)，接種病菌后抗感病品種PAL活性變化速度基本一致，但感病品種貴妃芒PAL活性升高的幅度較大。圖2芒果接種Xcm后PAL活性的變化2.3總酚含量的變化從圖3中可以看出，接種Xcm后芒果抗感病品種葉片內總酚含量較對照發(fā)生明顯變化，感病品種紅芒6號總酚含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但是總體水平明顯高于清水對照處理。感病品種貴妃芒接種病菌后前期（96h）與清水對照之前無明顯差異，總酚含量呈下降趨勢，綜合抗感品種結果可以初步推斷，總酚含量與芒果的抗性呈正相關。圖3芒果接種Xcm后總酚含量的變化2.4類黃酮含量的變化類黃酮因其具有殺菌和抑菌作用，因而在植物抗病反應中被廣泛關注。由表1可以看出，抗感品種清水對照處理的芒果葉片類黃酮的含量始終保持在一個穩(wěn)定狀態(tài)，其中感病品種中類黃酮含量高于抗病品種，取樣階段的平均值分別為99.46OD325/g和76.78OD325/g。接種Xcm后，類黃酮在抗感品種中均發(fā)生明顯變化?？共∑贩N紅芒6號葉片中類黃酮的含量迅速上升，12h增幅約40%，24-96h期間增幅在1-1.5倍之間。144-192h趨于穩(wěn)定，但仍顯著高于清水處理。感病品種貴妃芒的增幅不明顯，且后期顯著低于清水處理。綜合抗感品種類黃酮含量變化的結果可以推斷，類黃酮含量變化與芒果的抗性呈正相關。表1芒果接種Xcm后類黃酮含量的變化芒果品種接種時間紅芒6號（抗病品種）貴妃芒（感病品種）清水Xcm增幅1清水Xcm增幅1256.9180.4341.31c83.0090.468.98c2460.54108.8097.70b89.20102.8015.24b4867.70130.5092.70b106.00113.316.88c9683.55162.2094.10b87.30115.3032.07a144138.50140.201.20d168.82119.20-29.39d19253.54135.5150.01a62.4645.40-27.31d注：（1）增幅=（接菌類黃酮含量－對照類黃酮含量）/對照類黃酮含量*100%。（2）數(shù)字后的字母表示Duncan氏新復極差檢驗結果,不同小寫字母表示同列處理間差異達顯著水平(P<0.05)，下同。2.5阿魏酸含量的變化病菌的侵染對芒果葉片中阿魏酸含量有著明顯的影響（表2），在抗病品種紅芒6號中，阿魏酸含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，24h增幅最大為清水對照的34%。感病品種貴妃芒阿魏酸含量與清水對照相比，隨著時間的延長不斷的減少。從表3中還可以看出，未接種比較的抗病品種紅芒6號和感病品種貴妃芒阿魏酸含量較穩(wěn)定，且差異不顯著。由此推動，阿魏酸含量與芒果的抗性可能呈現(xiàn)正相關。表3芒果接種Xcm后阿魏酸含量的變化芒果品種接種時間紅芒6號（抗病品種）貴妃芒（感病品種）清水Xcm增幅清水Xcm增幅120.730.8414.75b0.960.84-12.50a240.921.2434.78a1.161-13.80a481.471.36-7.58c1.581.30-17.90b960.830.9311.06b1.441.20-16.70ab1441.121.2611.74b1.120.89-20.07c1921.231.05-14.61c1.2381.012-18.25bc2.6木質素含量的變化木質素作物植物細胞壁的主要成分，在植物抵御病菌侵染過程中起到重要作用。芒果接種Xcm后，抗感品種葉片中木質素含量變化如表3所示。從表3中可以看出，抗病品種紅芒6號接種病菌后木質素含量有所提高，增幅最大值出現(xiàn)在接種病菌24h，比對照高10%。感病品種貴妃芒在接種病菌后木質素含量變化緩慢，增長幅度約5%。綜合比較發(fā)現(xiàn)，病菌侵染后，抗病品種木質素含量提高幅度高于感病品種，可能通過增加細胞壁的厚度來抵御病菌的侵入，從而達到抗病效果。表4芒果接種Xcm后木質素含量的變化芒果品種接種時間紅芒6號（抗病品種）貴妃芒（感病品種）清水Xcm增幅清水Xcm增幅125.145.7812.45b6.106.425.20b245.726.3511.01b6.406.653.90c486.6946.832.03d6.656.873.40c966.547.037.50c6.396.836.80a1445.806.8417.90a6.196.667.60a1926.407.039.80c6.666.873.15c3結果與討論酚類化合物是植物體本身的固有成分，是植物體次生代謝產物中最重要的化合物之一，參與植物色素合成、生長發(fā)育、信號轉導、抗氧化機理和逆境防御等生化過程中。酚類化合物包括苯丙烷類、黃酮類、倍酸型、鞣花酸型、羥基芪類和單寧類等[3,13]。酚類化合物在植物抵御不良環(huán)境、病原物侵染的過程中起到重要的抗逆作用已引起研究者們的廣泛關注，其主要通過合成抗性物質、抑制或殺死病原細胞和刺激寄主細胞產生抗性反應等方式來提高寄主的抗病能力[14]?？Х仁芸Х忍烤也【秩竞?，抗性品種在早期發(fā)生黃酮類、羥基肉桂酸衍生物等酚類物質致使咖啡發(fā)生過敏性反應形成壞死斑和加速細胞壁的木質化增加細胞厚度，從而進一步阻礙病菌的蔓延[15]。唐永萍等以秦冠、富士、金冠蘋果果實為材料，通過損傷接種灰葡萄孢菌后發(fā)現(xiàn)，抗病蘋果品種通過調節(jié)果肉內酚類物質代謝，增強次生代謝能力，其中類黃酮和木質素含量的增加強化了果實的抗性反應，進而提高對灰霉病的抗性，但總酚含量與植物抗病性關系不大[16]。張云霞等為探尋甘藍抗黑腐病的生理生化機制，以抗病材料C7和感病材料C26為試驗材料，在甘藍幼苗期，噴施病菌懸浮液發(fā)現(xiàn)，抗病品種和感病品種PAL活性均先顯著增加后迅速下降，但抗病品種的酚類物質和木質素含量后期無明顯變化[17]。本研究以芒果細菌性角斑病不同抗性芒果品種為材料，研究了接種病菌后芒果葉片內總酚、類黃酮、木質素含量及酚類代謝相關酶（PPO和PAL）活性的變化趨勢。結果表明，接種病菌后，感病品種貴妃芒、抗病品種紅芒6號內總酚、類黃酮、阿魏酸、木質素含量、PAL和PPO活性在接種病菌后均直線上升，其中總酚、類黃酮、阿魏酸、木質素含量增幅在抗病品種中高于感病品種，且感病品種在侵染后期總酚和類黃酮含量均迅速降低；PAL、PPO活性感病品種增幅較高。Xcm侵染對芒果酚類代謝產生顯著影響，相關性分析表明芒果葉片的總酚、類黃酮、阿魏酸、木質素含量與芒果抗性呈正相關，而PAL、PPO活性與抗病性呈負相關。然而，由于植物的抗病體系是一個多體系混合作用的復雜機制，酚類物質代謝途徑與其他抗病機制如何協(xié)調互作尚有待進一步研究。參考文獻張大智.芒果細菌性角斑病菌致病因子研究[D].海南:海南大學,2015PETKOVSEKMM,SLATNARA,?TAMPARF,etal.Phenoliccompoundsinappleleavesafterinfectionwithapplescab[J].BiologiaPlantarum,2011,55(4):725-730華曉雨,陶爽,孫盛楠,等.植物次生代謝產物-酚類化合物的研究進展[J].生物技術通報,2017,33(12):22-29EHLTINGJ,HAMBERGERB,MILLIONRR,etal.CytochromesPphenolicmetabolism[J].PhytochemistryReviews,2006,5:239-270AHUJAI,KISSENR,BINESAM.Phytoalexinsindefenseagainstpathogens[J].TrendsinPlantScience,2012,17(2):73-90SANTIAGOR,DEARMASR,LEGAZME,etal.Changesinphenolicacidscontent,phenylalanineammonia-lyaseandperoxidaseactivitiesinsugarcaneleavesinducedbyelicitorsisolatedfromXanthomonasalbilineans[J].AustralasianPlantPathology,2009,38:357-365李嘉,徐德林,龍海,等.禾谷孢囊線蟲侵染對小麥根部防御酶的影響[J].應用與環(huán)境生物學報,2012,18(3):359-363LIUF,OUXC,ZHANRL.Whole-genomesequenceandgenomeannotationofXanthomonascitripv.mangiferaeindicae,causalagentofbacterialblackspotonMangiferaindica[J].ArchivesofMicrobiology,2018,200:835-840李榮花,陳捷,高增貴,等.玉米紋枯病抗性與防御酶關系的研究[J].天津師范大學學報:自然科學版,2005,25(4):32-36PIREA,MULLINSMG.Changesinanthocyaninandphenolicscontentofgrapevineleafandfruittissuestreatedwithsucrose,nitrate,andabscisicAcid.Plantphysiology,1976,58(4):46