酶工程考試重點(diǎn)

酶：是由活細(xì)胞產(chǎn)生的，具有高效、專一催化功能的生物大分子。分為蛋白類酶（P酶）和核酸類酶（R酶）酶工程：是生物技術(shù)的重要分支，它是酶學(xué)和微生物學(xué)的基本原理與化學(xué)工程有機(jī)結(jié)合而產(chǎn)生的交叉科學(xué)技術(shù)，他是從應(yīng)用的目的出發(fā)，研究酶的生產(chǎn)與應(yīng)用的一門技術(shù)性科學(xué)。可分為化學(xué)酶工程和生物酶工程?；瘜W(xué)酶工程主要指天然酶、化學(xué)修飾酶、固定化酶及化學(xué)人工酶的研究與應(yīng)用；生物酶工程是酶學(xué)和以基因重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，主要包括①用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（克隆酶）②修改酶基因產(chǎn)生遺傳修飾酶（突變酶）③設(shè)計(jì)新的酶基因，合成自然界不曾有的新酶。酶工程的主要任務(wù)是經(jīng)過預(yù)先設(shè)計(jì)，通過人為操作，獲得人們所需要的酶，并通過各種方法使酶充分發(fā)揮其催化功能。食品酶工程是將酶工程的理論與技術(shù)應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域，將酶學(xué)基本原理與食品工程相結(jié)合，為新型食品及食品原料的發(fā)展提供技術(shù)支持。鎖鑰學(xué)說：當(dāng)?shù)孜锲鹾系矫傅鞍椎幕钚灾行臅r(shí)，很像一把鑰匙插入到一把鎖中，因而使底物發(fā)生催化反應(yīng)。 中間產(chǎn)物學(xué)說：第五必須首先與酶形成中間復(fù)合物，然后再轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，并重新釋放出游離的酶。 誘導(dǎo)契合學(xué)說：酶分子的構(gòu)象與底物原來并非恰當(dāng)吻合，只有當(dāng)?shù)孜锓肿优c酶分子相碰撞時(shí)，可誘導(dǎo)酶蛋白的構(gòu)象變得能與底物配合，才結(jié)合形成中間絡(luò)合物，進(jìn)而引起第五份子發(fā)生相應(yīng)的化學(xué)變化。核酸類酶：具有催化活性的RNA酶催化作用的特點(diǎn)：①酶的溫和性②專一性③高效性④可調(diào)性機(jī)理：降低反應(yīng)活化能。酶活性的調(diào)節(jié)：《1》酶的可逆共價(jià)調(diào)節(jié)：指酶蛋白分子上的某些殘基在另一種酶的催化下進(jìn)行可逆的共價(jià)修飾，從而使酶在活性形式與非活性形式之間相互轉(zhuǎn)變的過程；《2》酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)：指某些化合物（成為配給或效應(yīng)物）與酶的活性中心以外的位點(diǎn)結(jié)合后，引起酶蛋白構(gòu)象的變化，從而改變酶活性的方式，能發(fā)生別構(gòu)效應(yīng)的酶稱為別構(gòu)酶。別構(gòu)酶有多亞基，兩中心（活性中心（負(fù)責(zé)對(duì)底物的結(jié)合與催化）、別構(gòu)中心（可結(jié)合效應(yīng)物，負(fù)責(zé)調(diào)解酶促反應(yīng)的速率））協(xié)同效應(yīng)：指蛋白質(zhì)和一個(gè)配體（包括底物和效應(yīng)物）結(jié)合之后，可以影響蛋白質(zhì)和另一個(gè)配體之間的結(jié)合能力。同工酶：指能催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不同的一組酶。沒作用的高效性機(jī)制：①鄰位效應(yīng)及定位效應(yīng)②底物分子形變③酸堿催化④共價(jià)催化⑤金屬離子催化⑥活性部位微環(huán)境的影響⑦協(xié)同催化雙底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：（一）順序機(jī)制：主要特征：酶結(jié)合底物和釋放產(chǎn)物是按一定順序進(jìn)行。①有序順序機(jī)制（底物與酶的結(jié)合以及產(chǎn)物的釋放有嚴(yán)格的順序）②隨機(jī)順序機(jī)制（兩個(gè)底物與酶的結(jié)合順序是隨機(jī)的）（二）乒乓反應(yīng)機(jī)制：反應(yīng)過程中底物與產(chǎn)物是交替的與酶結(jié)合?！鶎儆谄古覚C(jī)制的酶大多是具有輔酶的。PH影響酶促反應(yīng)速率的原因：①影響酶分子的構(gòu)象②影響酶和底物的解離③影響酶活性中心基因解離④影響中間復(fù)合物的解離抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)的影響：（一） 不可逆的抑制作用①專一性不可逆抑制：KS型、Kcat型②非專一性不可逆抑制（二） 可逆的抑制作用①競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用（抑制劑通常與底物結(jié)構(gòu)類似，與底物競(jìng)爭(zhēng)酶的結(jié)合部位，并與酶形成可逆的復(fù)合物）抑制程度取決于底物和抑制劑的相對(duì)濃度，且這種抑制作用可以通過提高底物濃度的方法來解除※特點(diǎn)：Vm不變Kmf②非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用：底物，抑制劑與酶的結(jié)合互不相干，二者可獨(dú)立地與酶結(jié)合※特點(diǎn)：Km不變Vm；③反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用：抑制劑必須在酶與底物結(jié)合后才能與之結(jié)合※特點(diǎn)：Km；Vm；酶的比活力（比活性）：指每克酶蛋白所含的酶活力單位數(shù)對(duì)同一種酶來說，酶的比活力越高，純度越高。別構(gòu)酶：又稱變構(gòu)酶，多為較復(fù)雜的寡聚糖，含有兩個(gè)或多個(gè)亞基修飾酶：某些酶蛋白肽鏈上的側(cè)鏈基團(tuán)在另一酶的催化下可與某些化學(xué)基團(tuán)發(fā)生共價(jià)結(jié)合或解離，從而改變酶的活性，這一調(diào)節(jié)酶活性的方式稱為酶的共價(jià)修飾調(diào)節(jié)，酶稱為~~結(jié)構(gòu)酶：也稱組成酶，是細(xì)胞內(nèi)天然存在的酶，以恒定速率和恒定數(shù)量生成，含量較為未定，受外界影響很小。誘導(dǎo)酶：指當(dāng)細(xì)胞中加入特定誘導(dǎo)物后，誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶，其含量在誘導(dǎo)物存在下顯著提高，這種誘導(dǎo)物往往是該酶底物的類似物或底物本身。現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)：①分批發(fā)酵②補(bǔ)料--分批發(fā)酵③半連續(xù)發(fā)酵④連續(xù)發(fā)酵⑤高細(xì)胞密度培養(yǎng)提高酶發(fā)酵產(chǎn)量的方法：.《1》酶的合成調(diào)控機(jī)制：（一）酶生物合成的誘導(dǎo)（能夠誘導(dǎo)某些酶合成的化合物稱為酶的誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)劑的使用可以顯著提高酶產(chǎn)量，分三類：①酶的作用底物②酶的底物類似物酶的反應(yīng)產(chǎn)物）（二）酶生物合成的阻礙（為避免分解代謝阻礙①采用難以利用的碳源②采用分次添加碳源的培養(yǎng)方法③添加一定量的CAMP）可通過控制末端產(chǎn)物濃度接觸阻礙《2》控制發(fā)酵條件提高酶產(chǎn)量《3》通過基因突變??《4》通過基因重組??《5》添加表面活性劑，添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑，添加誘導(dǎo)物，控制阻礙物※酶生物合成的模式：①同步合成型②延續(xù)合成型③中期合成型④滯后合成型首選是②延續(xù)合成型。為提高產(chǎn)酶率和縮短發(fā)酵周期，它屬于延續(xù)合成型的酶，在發(fā)酵過程中沒有生長(zhǎng)期和產(chǎn)酶期的明顯差別）酶分離純化的一般原則：①減少或防止酶的變性失活②酶的提?、勖傅募兌扰c保存酶的純化（鹽析法，等點(diǎn)沉淀法，有機(jī)溶劑沉淀法，共沉淀法，雙水相萃取法，反膠團(tuán)萃取法，凝膠層析法，透析法）酶的分離純化三個(gè)基本環(huán)節(jié)：①抽提（把酶從原料中抽提出來，并盡可能的減少雜質(zhì)引入，得到粗酶溶液）②純化（把雜質(zhì)從酶溶液中除掉或把酶從酶溶液中分離出來）③制劑（把分離純化后的酶制備成各種不同的劑型）細(xì)胞破碎分機(jī)械破碎法和非機(jī)械破碎法兩大類:①滲透壓法②酶溶法③化學(xué)法④勻漿法研磨法⑥凍融法⑦超聲波破碎法⑧壓榨法提取影響因素：①目的酶在提取溶劑中溶解度的大?、诿赣晒滔鄶U(kuò)散到液相的難易程度③溶劑的PH④提取時(shí)間⑤溫度（一般0-5°C；）⑥攪拌與氧化濃縮方法有①蒸發(fā)濃縮法②超濾濃縮法③冷凍濃縮法④凝膠過濾濃縮法⑤沉淀法⑥透析法⑦吸收濃縮法純化方法有①鹽析法②等點(diǎn)沉淀法③有機(jī)溶劑沉淀法④共沉淀法⑤雙水相萃取法⑥反膠團(tuán)萃取法⑦凝膠層析法⑧透析法結(jié)晶主要影響因素：①酶的純度（50%以上）②酶蛋白的濃度③晶種④溫度⑤合適的飽和度⑥PH⑦金屬離子⑧攪拌⑨重結(jié)晶⑩其他 主要方法：①鹽析法②有機(jī)溶劑法③微量蒸發(fā)擴(kuò)散法④透析平衡法⑤等電點(diǎn)法酶純度方法評(píng)析標(biāo)準(zhǔn)：一是酶活回收率；二是比活力提高的倍數(shù)；三是方法的重現(xiàn)性純化操作每一步都不可避免的造成活性損失，原因有二：一是由于部分酶變性失活；二是由于各種純化方法的分辨率有限，部分酶可能連同雜蛋白一起被除去。酶活回收率是純化后樣品的總酶活占純化前樣品的總酶活的百分比，它反映了純化過程中酶活力的損失情況，這一比值越高說明酶活的保存率越高，酶活的損失越少。比活力的提高倍數(shù)則反映了純化方法的效率。純化后比活力提高越多，總活力損失越少，純化效果就越好。 實(shí)際上，純化倍數(shù)與回收率不節(jié)能兼顧，兩者存在一定的矛盾，如鹽析操作時(shí)，沉淀范圍越寬，酶活回收率越高，但是純化倍數(shù)卻越低。在實(shí)際操作過程中應(yīng)根據(jù)具體情況選擇適宜的方法。較好的重現(xiàn)性是評(píng)價(jià)酶分離純化方法的必要條件，操作材料要有較好的穩(wěn)定性，操作條件要容易控制。酶分子的化學(xué)修飾：可以定義為在體外利用修飾劑所具有的的各類化學(xué)基團(tuán)的特性，直接或經(jīng)一定的活化步驟后與酶分子上的某種氨基酸殘基（一般盡可能選用非酶活必需基團(tuán)）產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，從而改造酶分子的結(jié)構(gòu)與功能。酶分子修飾：指通過對(duì)主鏈的剪接切割和側(cè)鏈的化學(xué)修飾對(duì)酶分子進(jìn)行改造。酶分子修飾方法：（一） 金屬離子置換修飾：過程①酶的分離純化②除去原有的金屬離子③加入置換離子（二） 大分子修飾（共價(jià)/非共價(jià)）采用水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的特性與功能的方法。過程：①修飾劑的選擇②修飾劑的活化③修飾④分離（三） 臺(tái)聯(lián)有限水解修飾 （四）分子側(cè)鏈的修飾 （五）氨基酸置換修飾（六）物理修飾（七）酶分子的親和修飾固定化酶：指在一定的空間范圍內(nèi)起催化作用，并能反復(fù)和連續(xù)使用的酶?！伴L(zhǎng)效的酶”優(yōu)點(diǎn)：①多數(shù)情況下，酶經(jīng)固定化后穩(wěn)定性提高②固定化酶催化的反應(yīng)過程更易控制③固定化酶具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，可以用攪拌或裝柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反應(yīng)的連續(xù)化和自動(dòng)化操作④固定化酶與游離酶相比更適于應(yīng)用多酶體系。“無公害催化劑”缺點(diǎn)：①固定化可能造成酶的部分失活，酶活力損失②酶催化微環(huán)境的改變可能導(dǎo)致反應(yīng)動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變③固定化使酶的使用成本增加，工廠的初始投資增大④固定化酶一般只適用于水溶性的小分子底物，不適宜大分子底物⑤固定化酶與完整菌體細(xì)胞相比，不適于多酶反應(yīng)，特別是需要輔助因子參加的反應(yīng)⑥胞內(nèi)酶進(jìn)行固定化時(shí)必須經(jīng)過酶的分離純化操作酶的固定方法：吸附法、包埋法、共價(jià)鍵結(jié)合法、交聯(lián)法固定化酶的形狀與性質(zhì) P195固定化酶（細(xì)胞）的活力酶反應(yīng)器：以酶或固定化酶作為催化劑進(jìn)行酶催化反應(yīng)的裝置。分罐式、管式和膜式。根據(jù)反應(yīng)物狀態(tài)分為均相酶反應(yīng)器和固定酶反應(yīng)器；按操作方式分批式/連續(xù)/流加式操作。參數(shù)logP:該參數(shù)用以描述有機(jī)溶劑的極性與酶活力之間的關(guān)系，其中P值為溶劑在正辛醇和水腫的分配系數(shù)，logP越大，溶劑的疏水性越強(qiáng)，logP越小，溶劑親水性越強(qiáng)PH記憶：酶的反應(yīng)速度與其冷凍干燥前水溶液的PH密切相關(guān)，反應(yīng)得最適PH接近于水溶液中的最適PH，即有機(jī)溶液中的酶能夠記憶它冷凍干燥或丙酮沉淀前所在緩沖液PH酶合成調(diào)節(jié)的機(jī)制：①單一效應(yīng)物調(diào)節(jié)②兩種效應(yīng)物的共同調(diào)節(jié)③弱化調(diào)節(jié)金屬離子在酶調(diào)節(jié)中的作用：酶活性中心的組成部分②金屬離子在酶與底物間起橋梁作用③維持酶的空間構(gòu)象46.酶的成產(chǎn)方法？（一） 提取分離法特點(diǎn)：自然界生物材料多樣且十分廣泛，價(jià)格也相對(duì)便宜該生產(chǎn)方法受制與生物資源、地理環(huán)境、氣候條件等因素，產(chǎn)量低，難以滿足實(shí)際生產(chǎn)的需要，價(jià)格成本也較生物合成法高，適用于目前還難以實(shí)現(xiàn)生物合成或化學(xué)合成的酶（二） 生物合成法（三） 化學(xué)合成法特點(diǎn):化學(xué)合成的成本高，而且只能合成那些化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)清楚的酶，使化學(xué)合成法受到限制，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，可生產(chǎn)既有酶的催化特點(diǎn)，又克服酶化不足的高效非酶催化劑等。發(fā)酵產(chǎn)酶的主要方法？各有何特點(diǎn)？（一） 分批發(fā)酵：指經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基在接種后開始培養(yǎng)直到結(jié)束。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，周期短，染菌的機(jī)會(huì)減少，生產(chǎn)過程、產(chǎn)品質(zhì)量易掌握。缺點(diǎn)：對(duì)基質(zhì)濃度敏感的產(chǎn)物或次級(jí)代謝物，采用分批發(fā)酵不合適，因其周期較短，一般在1-3d，產(chǎn)率較低。（二） 補(bǔ)料--分批發(fā)酵：在分批發(fā)酵過程中，補(bǔ)充因維持聲場(chǎng)或產(chǎn)物合成所需的養(yǎng)分和前體優(yōu)點(diǎn)：它能在這樣一種系統(tǒng)中維持很低的基質(zhì)濃度，從而避免快速利用碳源的阻遏效應(yīng)和能夠按設(shè)備的通氣能力去維持適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵條件，有利于次生代謝產(chǎn)物的累積，并減緩有害代謝物的不利影響 缺點(diǎn)：只有料液的輸入，沒有輸出，發(fā)酵液的體積在增加（三） 半連續(xù)發(fā)酵：指過程中除了補(bǔ)料，還間歇排放部分發(fā)酵液。優(yōu)點(diǎn)：克服補(bǔ)料帶來的體積增加的問題，可減少有害代謝物的不斷累積，盡可能延長(zhǎng)產(chǎn)物合成的時(shí)間。缺點(diǎn)：其在放掉發(fā)酵液的同時(shí)，也損失了未利用的養(yǎng)分和處于生產(chǎn)旺盛的菌體，定期補(bǔ)充和放液會(huì)使發(fā)酵液稀釋，送去提煉的發(fā)酵液體積更大，提取工藝的負(fù)荷會(huì)增加，可能產(chǎn)生更多的代謝有害物。.（四） 連續(xù)發(fā)酵：經(jīng)一段時(shí)間的分批培養(yǎng)后，發(fā)酵過程中一面不斷地補(bǔ)入新鮮的料液，一面以詳盡的流速去除發(fā)酵液，基本維持發(fā)酵液體積不變。 優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)酶效率高，生產(chǎn)穩(wěn)定性好，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化 缺點(diǎn)：污染雜菌機(jī)會(huì)大，菌種退化可能性大（五） 高細(xì)胞密度培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)酶的優(yōu)點(diǎn)：①微生物種類繁多，可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行優(yōu)選，滿足不同生產(chǎn)微生物極易誘變，篩選，為優(yōu)良菌株的選育提供捷徑③微生物容易培養(yǎng)，培養(yǎng)基來源廣，成本低④私產(chǎn)酶活力高，繁殖快，周期短⑤利用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、連續(xù)化、規(guī)?；a(chǎn)⑥微生物的基因組較小，進(jìn)行基因操作相對(duì)容易，為現(xiàn)代分子生物學(xué)在食品酶生產(chǎn)的應(yīng)用提供了良好的平臺(tái)發(fā)酵產(chǎn)酶的三大步驟：①產(chǎn)菌酶活細(xì)胞的獲得②控制發(fā)酵③分離提取優(yōu)良產(chǎn)酶菌的特點(diǎn)：①產(chǎn)酶效率和產(chǎn)酶量高 ②容易培養(yǎng)和管理，適合高密度發(fā)酵目的酶的活性高④產(chǎn)酶穩(wěn)定性好，不易退化⑤利于酶的分離純化⑥安全可靠無毒性產(chǎn)菌酶的獲得：①自然界中分離②產(chǎn)酶菌的誘變育種③產(chǎn)酶菌的雜交育種④基因工程菌酶生物合成的模式？有何特點(diǎn)？每個(gè)模式可通過哪些措施提高酶產(chǎn)量？（一） 同步合成型：指酶的生物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同步進(jìn)行的生物合成模式特點(diǎn)：該合成型的酶，其生物合成伴隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)而開始；在細(xì)胞進(jìn)入旺盛生長(zhǎng)期時(shí)，酶大量生成，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的合成隨著停止。※※提高酶產(chǎn)量措施：必須提高培養(yǎng)體系中高活力細(xì)胞的數(shù)量，采用最適宜的培養(yǎng)基，建立最合適產(chǎn)酶菌生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)條件，并在細(xì)胞進(jìn)入平衡期后及時(shí)終止發(fā)酵，進(jìn)行酶的分離提純（盡量提高對(duì)應(yīng)mRNA的穩(wěn)定性）（二） 延續(xù)合成型：酶的生物合成從細(xì)胞的生長(zhǎng)階段開始，進(jìn)入平衡期后，還可延續(xù)合成較長(zhǎng)時(shí)間特點(diǎn)：延續(xù)合成型的酶，其生物合成可以受誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)，一般不受分解代謝物阻遏，酶在生長(zhǎng)達(dá)到平衡期后，仍可延續(xù)合成。mRNA相當(dāng)穩(wěn)定措施：不僅要提高產(chǎn)酶菌的生長(zhǎng)狀況，獲得更多的高活力的細(xì)胞數(shù)量，還要防止阻遏物的影響，在進(jìn)入平衡期后，盡量延長(zhǎng)產(chǎn)酶時(shí)間和產(chǎn)酶效率（三） 中期合成型：酶一般在C生長(zhǎng)一段時(shí)間后開始合成，進(jìn)入平衡期后，酶合成停止。特點(diǎn)：酶的生物合成受到產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒糇饔没蚍纸獯x物阻遏作用，且編碼酶的mRNA穩(wěn)定性較差 ※※提高產(chǎn)酶量的措施：注意選育抗反饋?zhàn)瓒艋蚩狗纸獯x的變異菌株，要注意控制反饋?zhàn)瓒艋蛘叻纸獯x阻遏（提高mRNA穩(wěn)定性及接觸阻遏）（四） 滯后合成型：酶在C生長(zhǎng)一段時(shí)間或進(jìn)入平衡期