腫瘤藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)詳解演示文稿

腫瘤藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)詳解演示文稿當(dāng)前第1頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)（優(yōu)選）腫瘤藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)當(dāng)前第2頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)●細(xì)胞毒類藥物

●生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑

●分化誘導(dǎo)劑

●化學(xué)預(yù)防藥

●逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性藥物

●抗腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的藥物

●放療及化療增敏劑

抗腫瘤藥物

當(dāng)前第3頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)●細(xì)胞毒類藥物：體外實(shí)驗(yàn)方法；動(dòng)物腫瘤體內(nèi)篩選法；

抗癌藥作用機(jī)理研究方法

●生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑：體內(nèi)抗癌試驗(yàn)的方法；免疫功能的研究方法

●分化誘導(dǎo)劑：細(xì)胞形態(tài)學(xué)及組織化學(xué)研究方法；細(xì)胞功能的研

究方法；與分化有關(guān)的基因及其表達(dá)的研究方法

●化學(xué)預(yù)防藥：體外誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法；體內(nèi)誘癌試驗(yàn)；

化學(xué)預(yù)防劑作用機(jī)理的研究

●逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性藥物：腫瘤細(xì)胞耐藥表型和機(jī)制；

腫瘤耐藥細(xì)胞株的建立及鑒定；

尋找腫瘤耐藥性逆轉(zhuǎn)劑的方法

●抗腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的藥物：腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移與實(shí)驗(yàn)方法概述；

腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型；

腫瘤侵襲的體外模型及相關(guān)生物學(xué)特性研究

新血管生成的研究方法

●放療及化療增敏劑：放療增敏劑的正名、定義及其研究特點(diǎn)；

離體細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)；整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)各類抗腫瘤藥物所涉及到的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

當(dāng)前第4頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)●細(xì)胞毒類藥物：體外實(shí)驗(yàn)方法；動(dòng)物腫瘤體內(nèi)篩選法；

抗癌藥作用機(jī)理研究方法

●生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑：體內(nèi)抗癌試驗(yàn)的方法；免疫功能的研究方法。

●分化誘導(dǎo)劑：細(xì)胞形態(tài)學(xué)及組織化學(xué)研究方法；細(xì)胞功能的研

究方法；與分化有關(guān)的基因及其表達(dá)的研究方法

●化學(xué)預(yù)防藥：體外誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法；體內(nèi)誘癌試驗(yàn)；

化學(xué)預(yù)防劑作用機(jī)理的研究(附：胃癌變動(dòng)物模型)

●逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性藥物：腫瘤細(xì)胞耐藥表型和機(jī)制；

腫瘤耐藥細(xì)胞株的建立及鑒定；

尋找腫瘤耐藥性逆轉(zhuǎn)劑的方法

●抗腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的藥物：腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移與實(shí)驗(yàn)方法概述

腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

腫瘤侵襲的體外模型及相關(guān)生物學(xué)特性研究

心血管生成的研究方法

附：LA－795自發(fā)肺癌實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)移模型

●放療及化療增敏劑：放療增敏劑的正名、定義及其研究特點(diǎn)

離體細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)；整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)各類抗腫瘤藥物所涉及到的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

當(dāng)前第5頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)●腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)方法

（動(dòng)物的，人的）●動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法[移植性、誘發(fā)性（也可在體外誘發(fā)）、自發(fā)性]

●腫瘤轉(zhuǎn)移的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>

●腫瘤免疫藥理研究方法

（體外、體內(nèi)）腫瘤藥理學(xué)基本的實(shí)驗(yàn)方法當(dāng)前第6頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)一、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

二、腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代

三、腫瘤細(xì)胞的活性檢測(cè)

▲形態(tài)觀察

▲細(xì)胞排染試驗(yàn)

▲細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

▲抗癌作用測(cè)定

▲克隆形成試驗(yàn)

▲半數(shù)抑制濃度的計(jì)算腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)方法(InVitro)

當(dāng)前第7頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)●無(wú)菌室

●超凈工作臺(tái)

●消毒器

●CO2孵箱

●倒置顯微鏡

●酶標(biāo)儀

●培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶●營(yíng)養(yǎng)液，等等腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)所需要的基本條件

當(dāng)前第8頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)原代細(xì)胞培養(yǎng)

與傳代細(xì)胞培養(yǎng)

貼壁細(xì)胞傳代與懸浮細(xì)胞傳代腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代當(dāng)前第9頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

原代細(xì)胞培養(yǎng)

原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織、接種細(xì)胞培養(yǎng)到第一次傳代之前(一般可持續(xù)1-4周)。此期細(xì)胞可見(jiàn)到細(xì)胞分裂，但不旺盛。原代培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞克隆形成率（CloningEfficiency）很低?？寺⌒纬陕始醇?xì)胞群被稀釋分散成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，形成細(xì)胞小群（克隆）的百分?jǐn)?shù)。初代培養(yǎng)細(xì)胞也可用于檢測(cè)藥物的生物活性。當(dāng)前第10頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)

傳代培養(yǎng)（Passageculture）：將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比例轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。

為什么要進(jìn)行傳代？體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞密度過(guò)大，生存空間不足，可引起營(yíng)養(yǎng)枯竭從而停止生長(zhǎng)。因此，要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株或得到大量的同種細(xì)胞用于研究，并維持細(xì)胞種的延續(xù)。

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

傳代細(xì)胞培養(yǎng)當(dāng)前第11頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)細(xì)胞“一代”指從細(xì)胞接種在培養(yǎng)器皿到分離再培養(yǎng)的一段期間。細(xì)胞倍增時(shí)間：指此次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所需的時(shí)間?！耙淮迸c“倍增”的概念不同。在一代中，細(xì)胞可培增2-3次甚至5-6次。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

傳代代數(shù)與細(xì)胞倍增時(shí)間當(dāng)前第12頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)

細(xì)胞傳代后，一般經(jīng)過(guò)游離期、指數(shù)增生期、坪臺(tái)期三個(gè)階段

游離期：細(xì)胞接種后從懸浮狀態(tài)到細(xì)胞貼瓶；

指數(shù)增生期：細(xì)胞接種2～3天分裂增殖比較旺盛，是活力最好時(shí)期，稱指數(shù)增生期(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)，適宜進(jìn)行各種試驗(yàn)；坪臺(tái)期（停止期）：細(xì)胞密度已飽和，細(xì)胞停止增殖，但代謝活動(dòng)仍在進(jìn)行。腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)

指數(shù)增生期當(dāng)前第13頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)可分為單層貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。

▲懸浮培養(yǎng)是指細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中進(jìn)行生長(zhǎng)或維持。

▲單層貼壁培養(yǎng)是指細(xì)胞貼附在培養(yǎng)器皿表面生長(zhǎng)的方法。將細(xì)胞消化后分散成單個(gè)細(xì)胞后種入器皿，細(xì)胞置含37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，一般經(jīng)過(guò)3-6h，細(xì)胞沉于器皿底部，附著于玻璃或塑料層的培養(yǎng)面，分裂，向四周生長(zhǎng)，逐漸融合形成細(xì)胞單層。正常二倍體細(xì)胞在兩個(gè)細(xì)胞集落生長(zhǎng)到相互接觸時(shí)，由于細(xì)胞信息的傳遞，生長(zhǎng)即停止，即生長(zhǎng)接觸抑制。惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞由于具有失去接觸抑制的特性，在生長(zhǎng)到細(xì)胞相互接觸時(shí)，還能繼續(xù)生長(zhǎng)，形成重疊層。細(xì)胞生長(zhǎng)到旺盛期，即可進(jìn)行傳代。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

懸浮培養(yǎng)與貼壁培養(yǎng)當(dāng)前第14頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)

腫瘤細(xì)胞傳代

懸浮細(xì)胞的傳代懸浮細(xì)胞是指細(xì)胞呈單個(gè)或細(xì)胞團(tuán)懸浮在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到一定密度時(shí)，進(jìn)入坪臺(tái)期，即需傳代。

傳代方法：取少量細(xì)胞懸液移入新培養(yǎng)器皿，加入新鮮培養(yǎng)液即可。

當(dāng)前第15頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)1.打開(kāi)瓶口，過(guò)火后，輕輕倒去培養(yǎng)液。2.用PBS或用Hank’s液2ml洗1－2次，加入0.05%~0.25%胰蛋白酶適量，消化1~3min。3.在顯微鏡下觀察細(xì)胞呈圓球狀時(shí)（或肉眼觀察培養(yǎng)瓶細(xì)胞面出現(xiàn)布紋孔狀），表示細(xì)胞已從壁上消化下來(lái)，倒去胰蛋白酶，可用Hank’s液輕輕洗1－2次。4.加入新鮮培養(yǎng)液后，用滴管輕輕吹打，使細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶表面脫落，混合成細(xì)胞懸液，以適量接種入新培養(yǎng)器皿中。腫瘤細(xì)胞傳代

貼壁細(xì)胞的傳代當(dāng)前第16頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)1.培養(yǎng)液中可加入適量青霉素、鏈霉素；

2.用于調(diào)pH值的7%NaHCO3用0.1-0.22μm

濾膜過(guò)濾滅菌，勿高壓滅菌。

3.洗去胰蛋白酶時(shí)應(yīng)該用D-Hanks液，而

不是Hanks液。

4.傳代時(shí)細(xì)胞分散密度要適當(dāng)，不能太

低，因腫瘤細(xì)胞的自泌促生長(zhǎng)因子會(huì)

因分散培養(yǎng)而被稀釋，達(dá)不到腫瘤生

長(zhǎng)的需求，降低腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖力。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

注意事項(xiàng)當(dāng)前第17頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)分離純化外科腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞的方法1.取材：材料主要來(lái)源于外科手術(shù)或活檢腫瘤組織。取材時(shí)避免用壞死組織，要挑選瘤細(xì)胞集中和活力較好的部位，瘤性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是較好的培養(yǎng)材料。取材后盡快培養(yǎng)，因故不能立即培養(yǎng)者，可凍存。2.成纖維細(xì)胞排除：在腫瘤組織中?；祀s有一些成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)能與瘤細(xì)胞同時(shí)生長(zhǎng)，并常壓過(guò)癌細(xì)胞，導(dǎo)致癌細(xì)胞生長(zhǎng)受阻，應(yīng)仔細(xì)排除。排除方法常有：機(jī)械刮除法、反復(fù)貼壁法、消化排除法、膠原酶消化法等。

當(dāng)前第18頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)成纖維細(xì)胞排除

機(jī)械刮除法機(jī)械刮除法是用不銹鋼鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用。刮除程序?yàn)椋?/p>

（1）標(biāo)記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞的部位；

（2）刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無(wú)菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無(wú)標(biāo)記空間；

（3）用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細(xì)胞；

（4）注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留，可重復(fù)刮除至完全除掉為止當(dāng)前第19頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)

根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn)，并結(jié)合使用不加血清的營(yíng)養(yǎng)液，把含有兩類細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類細(xì)胞相互分離，操作方法與傳代相同。

（1）待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，Hanks沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液；

（2）取編號(hào)為此A、B、C三個(gè)培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)5～20分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B培養(yǎng)瓶中后；向A瓶中補(bǔ)充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)；

（3）培養(yǎng)B瓶中細(xì)胞5～20分鐘后，按處理A的方法，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中；再向B瓶中補(bǔ)加完全培養(yǎng)基。

當(dāng)三個(gè)瓶?jī)?nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見(jiàn)A瓶主要為成纖維細(xì)胞，B瓶?jī)深惣?xì)胞相雜，C瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時(shí)可反復(fù)處理多次，直至癌細(xì)胞純化為止。

成纖維細(xì)胞排除

反復(fù)貼壁法當(dāng)前第20頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)消化排除法：

根據(jù)成纖維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞易先脫落的特點(diǎn)。此法曾用于乳癌細(xì)胞的培養(yǎng)，具體程序是：

（1）先用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下觀察和不時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細(xì)胞脫落下來(lái)后，便立即停止消化；

（2）把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶?jī)?nèi)也補(bǔ)加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)幾次反復(fù)處理，可能把成纖維細(xì)胞除凈。當(dāng)前第21頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)膠原酶消化法：

利用成纖維細(xì)胞對(duì)膠原酶較為敏感的特點(diǎn)，通過(guò)消化進(jìn)行選擇。

（1）可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后，即終止消化；

（2）用Hanks洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細(xì)胞。如成纖維細(xì)胞未被除凈，可再次重復(fù)。

當(dāng)前第22頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)其它方法：▲有人發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺有抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的作用；▲也有人用聚蔗糖制備成比重1.025～1.085的密度梯度離心液，加入細(xì)胞懸液后，在23℃中800g離心10分種。在比重1.025～1.050層為成纖維細(xì)胞，在比重1.050～1.085層為上皮細(xì)胞，再經(jīng)過(guò)分離進(jìn)行培養(yǎng)。最近也有人應(yīng)用特殊化學(xué)物如SOD抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。

選用上述任何一種方法，都需進(jìn)行試驗(yàn)，取得必要經(jīng)驗(yàn)，找出適合的條件，才能獲得好的效果。

當(dāng)前第23頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)

●腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

●腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代

●腫瘤細(xì)胞的活性檢測(cè)

▲形態(tài)觀察

▲細(xì)胞排染試驗(yàn)

▲細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

▲

MTT試驗(yàn)

▲克隆形成試驗(yàn)

▲半數(shù)抑制濃度的計(jì)算腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)當(dāng)前第24頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)

●腫瘤細(xì)胞的活性檢測(cè)

▲形態(tài)觀察

▲細(xì)胞排染試驗(yàn)

▲細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

▲MTT試驗(yàn)

▲克隆形成試驗(yàn)

▲半數(shù)抑制濃度的計(jì)算當(dāng)前第25頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)

腫瘤細(xì)胞的活性檢測(cè)

▲形態(tài)觀察

主要觀察細(xì)胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、多少等以及細(xì)胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。

當(dāng)前第26頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)●實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞損傷或死亡后細(xì)胞膜完整性破壞。正常的活細(xì)胞拒染，而死亡的細(xì)胞則染成藍(lán)色。

●實(shí)驗(yàn)方法

取100μl細(xì)胞懸液加等量0.4％臺(tái)盼藍(lán)染色液，攪動(dòng)細(xì)胞使之與染料混合均勻，滴入血球計(jì)數(shù)板，穩(wěn)定2min后進(jìn)行觀察，在l5min內(nèi)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。未染色的是活細(xì)胞，死細(xì)胞呈藍(lán)色。分別計(jì)數(shù)染色細(xì)胞與不染色細(xì)胞，求得細(xì)胞存活率。

腫瘤細(xì)胞的活性檢測(cè)

▲細(xì)胞排染試驗(yàn)

當(dāng)前第27頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)

細(xì)胞排染試驗(yàn)

細(xì)胞存活率＝×100%未經(jīng)任何處理的培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞存活率應(yīng)達(dá)95%以上。

當(dāng)前第28頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率＝

觀察藥物的作用，可對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(即末染色細(xì)胞數(shù))，再根據(jù)下列公式求得細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率?！?00%當(dāng)前第29頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)染色液混勻后，應(yīng)在5min內(nèi)計(jì)數(shù)完畢，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，由于細(xì)胞活度下降而通透性增加，從而影響拒染細(xì)胞數(shù)，因而影響實(shí)驗(yàn)的真實(shí)結(jié)果。

細(xì)胞排染試驗(yàn)注意事項(xiàng)當(dāng)前第30頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)

在最適條件下，腫瘤細(xì)胞在培養(yǎng)液中隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈指數(shù)生長(zhǎng)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，可得一條直線，故稱此時(shí)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。隨著細(xì)胞密度不斷增高，由于代謝產(chǎn)物的積聚及營(yíng)養(yǎng)物的消耗，細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸減慢以致停止，此時(shí)稱高坪期或穩(wěn)定期。藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響可通過(guò)生長(zhǎng)曲線反映出來(lái)。實(shí)驗(yàn)原理腫瘤細(xì)胞的活性檢測(cè)

▲腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線當(dāng)前第31頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配成細(xì)胞濃度為1×104/ml的細(xì)胞懸液分裝在培養(yǎng)瓶中，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的被測(cè)樣品，對(duì)照組加入等體積的溶劑。細(xì)胞置含37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)后ld、2d、3d、4d、5d、7d各取樣，置血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)，以每毫升細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線（計(jì)數(shù)法）。

注意：懸浮細(xì)胞同一培養(yǎng)物可連續(xù)取樣，而貼壁細(xì)胞每個(gè)培養(yǎng)瓶只能作一次計(jì)數(shù)，故要計(jì)算好需要的細(xì)胞瓶數(shù)。

實(shí)驗(yàn)方法

腫瘤細(xì)胞的活性檢測(cè)

▲腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線當(dāng)前第32頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)藥物對(duì)細(xì)胞的殺傷率＝×100%也可用MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線N0:對(duì)照組生長(zhǎng)曲線線性部分外推至y軸的截距，代表接種后對(duì)照組具有增殖力的細(xì)胞數(shù)；N0′:實(shí)驗(yàn)組生長(zhǎng)曲線線性部分外推至y軸的截距，代表接種后實(shí)驗(yàn)組具有增殖力的細(xì)胞數(shù)。當(dāng)前第33頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)

MTT比色法：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT（噻唑藍(lán),Thiazolyl

blue）還原為藍(lán)紫色結(jié)晶，并沉淀在細(xì)胞里，而死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原

。DMSO能夠溶解細(xì)胞中的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜(formazan)，用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值(OD值)，OD值的大小可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物的形成量與活細(xì)胞數(shù)成正比。由吸光度值，根據(jù)相關(guān)公式計(jì)算抑制率。

MTT實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)前第34頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)方法1.將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培養(yǎng)基配成濃度約為5000個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。2.接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種200μl。3.經(jīng)37℃、5%CO2的溫箱中培養(yǎng)24h。4.實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)液，對(duì)照組則用等體積的培養(yǎng)液，每組設(shè)3

個(gè)以上的平行孔，37℃、5%CO2，培養(yǎng)所設(shè)定的時(shí)間。

MTT實(shí)驗(yàn)當(dāng)前第35頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)方法5.棄去上清液，用培養(yǎng)液洗3次，以去除藥液。然后，每孔加入200μl含0.2mg/mlMTT的無(wú)血清培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)4h。

6.小心棄去上清，并加入200μl酸化異丙醇（或DMSO）溶解MTT甲臜沉淀，用振蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀上用波長(zhǎng)為570nm，參比波為

450nm測(cè)定光密度(OD)值。

MTT實(shí)驗(yàn)當(dāng)前第36頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)按公式計(jì)算IC50舉例：各組藥物濃度：0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001（稀釋倍數(shù)為10，最大濃度為0.1）抑制率分別為：0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。將上述數(shù)據(jù)代入下列計(jì)算公式：lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:最大劑量的對(duì)數(shù)=lg0.1=-1

I:（最大劑量/相鄰劑量)的對(duì)數(shù)=lg0.1/0.01=lg10=1P:陽(yáng)性反應(yīng)率之和=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Pm:最大陽(yáng)性反應(yīng)率=0.95，Pn:最小陽(yáng)性反應(yīng)率=0.06lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025

當(dāng)前第37頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)

腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)是進(jìn)行抗癌藥物篩選檢測(cè)、研究癌變機(jī)理以及惡性腫瘤分子生物學(xué)研究的重要手段。主要優(yōu)點(diǎn)如下：1.不需要用動(dòng)物，能很方便、很經(jīng)濟(jì)的進(jìn)行很多種藥物的篩選；2.可比較準(zhǔn)確的控制藥物作用的時(shí)間、劑量和條件，并可準(zhǔn)確的選擇藥物作用的靶位；3.將藥物直接加入到腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)體系中，使藥物直接與細(xì)胞接觸，可提示藥物的直接作用或體內(nèi)的間接作用。腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)方法主要優(yōu)點(diǎn)當(dāng)前第38頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)

1.與體外實(shí)驗(yàn)相比，體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境極為復(fù)雜，因此體外的藥效作用在體內(nèi)并不一定都能相對(duì)應(yīng)；

2.對(duì)復(fù)方藥和中藥研究較為困難，尤其是藥物的顏色，可因?yàn)橛绊懕壬Y(jié)果而影響對(duì)藥物的評(píng)價(jià)；

3.水溶性的藥物較易研究，而非水溶性的藥物則較難。（可進(jìn)行血清藥理學(xué)研究）

因此，要將體外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)的結(jié)合起來(lái)才能較為全面而科學(xué)地評(píng)價(jià)藥效。腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)方法主要缺點(diǎn)當(dāng)前第39頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)初代培養(yǎng)物開(kāi)始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱之為細(xì)胞系（CellLine）。

從一個(gè)經(jīng)過(guò)生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過(guò)篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱細(xì)胞株（Cellstrain）。

細(xì)胞株與細(xì)胞系的概念當(dāng)前第40頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)●腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)方法

（動(dòng)物的，人的）●動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法（移植性、誘發(fā)性、自發(fā)性）

●腫瘤轉(zhuǎn)移的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>

●腫瘤免疫藥理研究方法腫瘤藥理學(xué)基本的實(shí)驗(yàn)方法當(dāng)前第41頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

Invivo

腫瘤藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法(InVitro)

當(dāng)前第42頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)腫瘤藥理學(xué)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法是評(píng)價(jià)一個(gè)藥物是否有效的最主要的方法，即使在體外有一個(gè)很好的療效，最終也一定要在體內(nèi)進(jìn)行觀察。因此，用整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法來(lái)觀察藥物的作用顯得很重要。研究藥物的體內(nèi)抗腫瘤作用，就必須建立各種腫瘤的動(dòng)物模型，模型越接近于人體其意義越大。當(dāng)前第43頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)

動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法●實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇●移植性動(dòng)物腫瘤模型●誘發(fā)性動(dòng)物腫瘤模型●自發(fā)性動(dòng)物腫瘤模型當(dāng)前第44頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)不同種類的動(dòng)物對(duì)致癌物質(zhì)的敏感性不同，其癌自發(fā)率也不同。常用于自發(fā)、誘發(fā)或移植的動(dòng)物有：

小鼠、裸鼠、金黃地鼠、大鼠豚鼠、兩棲類動(dòng)物如蛙、鳥(niǎo)類。其它許多家畜如豬馬牛羊犬貓家兔等都可發(fā)生各種腫瘤。動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物的選擇當(dāng)前第45頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)小鼠小鼠腫瘤自發(fā)率高，其自發(fā)性腫瘤無(wú)論是從組織發(fā)生、臨床過(guò)程以及組織形態(tài)學(xué)上都與人類的腫瘤接近。所以小鼠目前廣泛用于癌、肉瘤、白血病以及其它惡性腫瘤的研究。進(jìn)行抗腫瘤藥物篩選，小鼠自發(fā)性腫瘤模型優(yōu)于移植性腫瘤模型。動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物的選擇當(dāng)前第46頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)裸鼠裸鼠是一種獨(dú)特的純系動(dòng)物，全身無(wú)毛，先天性無(wú)胸腺，T淋巴細(xì)胞缺乏，細(xì)胞免疫功能缺乏，對(duì)異體移植幾乎無(wú)免疫排斥反應(yīng)，可接受異系、異種腫瘤腫瘤移植等，有“活試管”之稱。自從1969年Rygaard、Povlesev二氏將人類腫瘤異種移植于裸鼠首次獲得成功后，它在腫瘤研究中已被廣泛利用。目前移植于裸鼠較為成功的人類腫瘤有：結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、白血病等。動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物的選擇當(dāng)前第47頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)裸小鼠的費(fèi)用昂貴，飼養(yǎng)時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的條件要求高，小鼠不易大量繁殖。因而一般不用于藥物的初篩選研究。由于先天性免疫缺乏，因而在一般情況下也不用于免疫藥物的研究。

裸鼠的缺點(diǎn)動(dòng)物的選擇當(dāng)前第48頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)C57BL/6小鼠

小鼠類的一種，黑毛，體型小，性情較溫順，易于飼養(yǎng)管理，對(duì)藥物敏感性好，為研究Lewis肺癌所選小鼠。費(fèi)用適中，飼養(yǎng)條件不太高，易大量繁殖，因而一般可用于藥物的體內(nèi)初篩選研究。（Lewis肺癌為C57BL/6小鼠來(lái)源的腫瘤）

動(dòng)物的選擇當(dāng)前第49頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)大鼠

大鼠也廣泛用于腫瘤研究。與小鼠相比，大鼠的體型較大，供給的組織較多，便于進(jìn)行手術(shù)等實(shí)驗(yàn)操作。大鼠的肝臟對(duì)致癌物質(zhì)很敏感，可用二乙基亞硝胺，二甲基偶氮苯（DAB）復(fù)制大鼠肝癌動(dòng)物模型，還可用甲基芐基亞硝胺誘發(fā)大鼠食管癌動(dòng)物模型。大鼠的自發(fā)性癌變的發(fā)生率較低。動(dòng)物的選擇當(dāng)前第50頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)金黃地鼠：金黃地鼠是腫瘤學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中最常用的動(dòng)物，她廣泛用于研究腫瘤的增殖、致癌、抗癌、腫瘤轉(zhuǎn)移、康癌藥物的篩選等。豚鼠：曾被認(rèn)為是很少發(fā)生腫瘤的動(dòng)物，近年發(fā)現(xiàn)豚鼠也可發(fā)生自發(fā)性腫瘤，例如支氣管乳頭腺瘤、白血病等。兩棲類動(dòng)物：蛙類無(wú)毛，光滑的皮膚與人類接近，可為皮膚癌的研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。鳥(niǎo)類：雞和其它鳥(niǎo)類對(duì)腫瘤病毒的研究具有極高的實(shí)用價(jià)值尤其是對(duì)于造血系統(tǒng)和間葉組織腫瘤病毒株具有易感性。魚(yú)類：魚(yú)類也可發(fā)生不少自發(fā)腫瘤，它們對(duì)化學(xué)致癌物十分敏感，例如用黃曲霉素、二乙基亞硝胺等可誘發(fā)魚(yú)類肝臟腫瘤和腎母細(xì)胞瘤。其它：許多家畜如馬牛羊豬犬貓家兔等都可發(fā)生各種腫瘤。動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物的選擇當(dāng)前第51頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)

動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法●實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇●移植性動(dòng)物腫瘤模型●自發(fā)性動(dòng)物腫瘤模型●誘發(fā)性動(dòng)物腫瘤模型當(dāng)前第52頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法移植性動(dòng)物腫瘤模型●人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立●實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立●非實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立

當(dāng)前第53頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)移植性動(dòng)物腫瘤模型人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立

用人的腫瘤細(xì)胞通過(guò)移植的方法移植到適合的動(dòng)物宿主體內(nèi)，建立一個(gè)移植宿主的體內(nèi)模型，通過(guò)該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)藥物進(jìn)行藥理藥效學(xué)觀察。人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植可觀察癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性試驗(yàn)，藥物對(duì)癌細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用，藥物對(duì)癌細(xì)胞的增殖抑制作用和誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡等作用。當(dāng)前第54頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)移植性動(dòng)物腫瘤模型人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立

●動(dòng)物要求●腫瘤細(xì)胞來(lái)源●腫瘤細(xì)胞凍存與復(fù)蘇●腫瘤細(xì)胞體內(nèi)接種當(dāng)前第55頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立

由于人和動(dòng)物不同種，存在移植排斥反應(yīng)，故要用免疫缺陷動(dòng)物，如裸鼠。

裸小鼠是一種獨(dú)特的純系動(dòng)物，全身無(wú)毛，先天性T細(xì)胞缺乏，對(duì)異種腫瘤移植幾乎無(wú)免疫排斥反應(yīng)，可接受人類腫瘤移植。

裸大鼠無(wú)胸腺，缺少T細(xì)胞，故能成功地移植異種皮膚和異種腫瘤，包括小鼠腫瘤及人腫瘤。

動(dòng)物要求當(dāng)前第56頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)小白鼠裸鼠當(dāng)前第57頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立人體腫瘤細(xì)胞的來(lái)源大致可分為兩類，一類是人的癌細(xì)胞株，可從細(xì)胞庫(kù)或其他實(shí)驗(yàn)室得到；另一類是源于人體腫瘤組織塊的癌細(xì)胞，主要從臨床腫瘤患者體內(nèi)獲得。為了使腫瘤細(xì)胞能得到長(zhǎng)期使用和保持不同代的腫瘤組織的本來(lái)特性，防止退化或變異，對(duì)腫瘤細(xì)胞的冷凍保存是很必要的。一般情況下，液氮凍存1-2年后，細(xì)胞存活率可達(dá)80%-90％。

涉及細(xì)胞凍存與復(fù)蘇技術(shù)。腫瘤細(xì)胞的來(lái)源當(dāng)前第58頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)1.消化洗滌將對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞或腹水瘤細(xì)胞經(jīng)消化脫壁后，用培養(yǎng)液洗滌l次。2.凍存細(xì)胞配制含有保護(hù)劑(10%－15％的DMSO，甘油等)的培養(yǎng)液作為細(xì)胞凍存液。以腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞凍存液中的密度為l×l07/ml左右懸浮細(xì)胞。將細(xì)胞懸液加入到2ml塑料凍存管內(nèi)。密封后注明標(biāo)記。將凍存管放入4℃或－30℃低溫冰箱內(nèi)2h后，移入液氮罐內(nèi)長(zhǎng)期保存。3.凍存細(xì)胞的復(fù)蘇將凍存腫瘤細(xì)胞的凍存管從液氮罐內(nèi)取出，立即置于37-40℃溫水中，使凍存細(xì)胞在lmin內(nèi)全部融化，1000r/min離心l0min，棄去上清液，用新鮮培養(yǎng)液稀釋到所需細(xì)胞數(shù)，再進(jìn)行培養(yǎng)?！衤齼隹烊谠瓌t

人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立凍存與復(fù)蘇方法當(dāng)前第59頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)1.體外培養(yǎng)擴(kuò)增無(wú)菌條件下，將復(fù)蘇的腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)、擴(kuò)增。2.制備細(xì)胞懸液在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.05％胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA）消化1～2min，傾出消化液，加入無(wú)血清1640液洗滌，離心，計(jì)數(shù)，用無(wú)血清1640液或無(wú)菌生理鹽水配成濃度為1×107/ml的細(xì)胞懸液。3.接種腫瘤細(xì)胞在無(wú)菌環(huán)境中，消毒皮膚，用lml注射器抽吸取0.2ml細(xì)胞懸液（約含2×106個(gè)腫瘤細(xì)胞），接種在裸鼠右前肢根部（腋窩）皮下。約1周左右局部就長(zhǎng)出花生米粒大小瘤塊。4.飼養(yǎng)、觀察

在無(wú)菌環(huán)境中飼養(yǎng)、觀察，觀察瘤塊生長(zhǎng)情況，定期測(cè)量瘤體的直徑，最后剝瘤稱重，計(jì)算抑制率。

接種步驟人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立當(dāng)前第60頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)動(dòng)物腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法移植性動(dòng)物腫瘤模型●人體腫瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立●實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立

●非實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立

當(dāng)前第61頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)移植性動(dòng)物腫瘤模型實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立小塊瘤體接種法腫瘤細(xì)胞懸液接種法培養(yǎng)細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)移植法●瘤體測(cè)量方法

●接種方法●主要特點(diǎn)

當(dāng)前第62頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的主要特點(diǎn)1.一群動(dòng)物同時(shí)接種等量同種癌細(xì)胞，腫瘤生長(zhǎng)速度比較一致，個(gè)體差異較小；2.接種的成活率高，接近100%；3.對(duì)宿主的影響較相似，易于客觀判斷療效；4.可在同種或同品系動(dòng)物中連續(xù)移植，長(zhǎng)期保留，供試驗(yàn)用；5.試驗(yàn)周期一般較短，試驗(yàn)條件易于控制。

實(shí)體瘤動(dòng)物模型主要用來(lái)篩選抗腫瘤藥物。當(dāng)前第63頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)移植性動(dòng)物腫瘤模型實(shí)體瘤動(dòng)物體內(nèi)移植模型的建立小塊瘤體接種法腫瘤細(xì)胞懸液接種法培養(yǎng)細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)移植法●瘤體測(cè)量方法

●接種方法●主要特點(diǎn)

當(dāng)前第64頁(yè)\共有73頁(yè)\編于星期四\11點(diǎn)小塊瘤體接種法從動(dòng)物剝離取出腫瘤后，剔除非腫瘤組織和壞死組織，選取生長(zhǎng)良好而無(wú)變性壞死、呈淡紅色(黑色素瘤則呈黑色或黑紫色)、魚(yú)肉狀的瘤組織，切成2mm×2mm×2mm的小塊，在所選宿主動(dòng)物的腋下剪開(kāi)一個(gè)小口，用無(wú)鉤眼科鑷子夾取小塊，送入切口內(nèi)皮。如何保證切成的小塊是2mm×2mm×2mm？

為什么接種在腋下，因?yàn)橐赶虏科つw松弛，能使腫瘤生長(zhǎng)得較大，可延長(zhǎng)宿主動(dòng)物的壽命。