蛋白質(zhì)的分離純化

1透析和超過濾

P302當前第1頁\共有37頁\編于星期六\10點2超速離心

P302當前第2頁\共有37頁\編于星期六\10點基本原理：層析由流動相和固定相組成樣品作為流動相流過固定相各組分在兩相中分布程度不同各成分遷移率不同分離3層析（色譜）（Chromatography）

P148當前第3頁\共有37頁\編于星期六\10點兩相：固定相（靜相）和流動相（動相）有效分配系數(shù)：當前第4頁\共有37頁\編于星期六\10點層析按流動相：氣相、液相色譜等；按操作形式不同：紙層析、薄層層析、柱層析等；按分離機制：凝膠層析、離子交換層析、親和層析、吸附層析等。當前第5頁\共有37頁\編于星期六\10點3.1紙層析

（Filter-paperchromatography）相對遷移率

P151當前第6頁\共有37頁\編于星期六\10點3.2薄層層析

（Thin-layerchromatography）

P152當前第7頁\共有37頁\編于星期六\10點3.3柱層析當前第8頁\共有37頁\編于星期六\10點①凝膠過濾層析

(分子排阻層析、分子篩層析）（Gel-filtrationchromatography）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同來分離純化蛋白質(zhì)的一種方法。

P303當前第9頁\共有37頁\編于星期六\10點介質(zhì)：凝膠顆粒（多孔的網(wǎng)狀結構）交聯(lián)度或孔度（網(wǎng)孔大小）——凝膠的分級分離范圍交聯(lián)葡聚糖——SephadexG-50（1500-30000）瓊脂糖——Sepharose或Bio-GelA聚丙烯酰胺——Bio-GelP當前第10頁\共有37頁\編于星期六\10點原理：當前第11頁\共有37頁\編于星期六\10點②離子交換層析

（Ion-exchangechromatography）根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的不同進行分離純化。介質(zhì)：離子交換樹脂溶液中的離子與樹脂上的帶電基團進行交換反應；各種離子交換能力不同，與樹脂結合的牢固程度就不同；在洗脫過程中，各種離子遷移率不同，達到分離的目的。

P152和310當前第12頁\共有37頁\編于星期六\10點當前第13頁\共有37頁\編于星期六\10點當前第14頁\共有37頁\編于星期六\10點當前第15頁\共有37頁\編于星期六\10點當前第16頁\共有37頁\編于星期六\10點茚三酮反應：生成紫色物質(zhì)脯氨酸和羥脯氨酸生成黃色物質(zhì)

氨基酸的定性定量當前第17頁\共有37頁\編于星期六\10點當前第18頁\共有37頁\編于星期六\10點

根據(jù)蛋白質(zhì)與特異的配體相互作用來分離的。蛋白質(zhì)＋配體蛋白質(zhì)配體復合物③親和層析

(Affinitychromatography)

P313當前第19頁\共有37頁\編于星期六\10點當前第20頁\共有37頁\編于星期六\10點當前第21頁\共有37頁\編于星期六\10點當前第22頁\共有37頁\編于星期六\10點當前第23頁\共有37頁\編于星期六\10點④高效液相層析（High-Performanceliquidchromatography,HPLC）

P154和314也分為凝膠過濾層析、離子交換層析和親和層析等特點：固定相支持劑顆粒細采取高壓，洗脫速度增大當前第24頁\共有37頁\編于星期六\10點當前第25頁\共有37頁\編于星期六\10點4電泳(Electrophoresis)在外電場存在下，利用蛋白質(zhì)分子攜帶的凈電荷不同以分離混合物ArneTiselius獲1948年諾貝爾化學獎

P307當前第26頁\共有37頁\編于星期六\10點4.1凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠（蛋白質(zhì)和多核苷酸）瓊脂糖凝膠（核酸）當前第27頁\共有37頁\編于星期六\10點電泳儀水平電泳槽垂直電泳槽當前第28頁\共有37頁\編于星期六\10點聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）不連續(xù)：濃縮膠和分離膠電泳遷移率決定于所帶的凈電荷以及分子大小和形狀等因素。+凝膠加樣

P309當前第29頁\共有37頁\編于星期六\10點巰基乙醇：打開二硫鍵。SDS：變性劑，破裂蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用。

SDS以其氫鍵與蛋白質(zhì)分子的側鏈結合成復合體。①帶有很多負電荷——遠遠超過蛋白質(zhì)分子原有電荷②改變了蛋白質(zhì)單體分子的構象：近似雪茄煙形的長橢圓棒，短軸長度相同，長軸長度隨蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量成正比例變化。遷移率主要取決于蛋白質(zhì)相對分子量SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）當前第30頁\共有37頁\編于星期六\10點當前第31頁\共有37頁\編于星期六\10點遷移率當前第32頁\共有37頁\編于星期六\10點4.2等電聚焦電泳高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術。在具有pH梯度的介質(zhì)中進行的。在外電場的作用下各種蛋白質(zhì)將移向并聚焦（停留）在等于其等電點的pH梯度處，并形成一個很窄的區(qū)帶。特別適用于同功酶的鑒定。只要它們的pI有0.02pH單位的差別就能分開。

P310當前第33頁\共有37頁\編于星期六\10點當前第34頁\共有37頁\編于星期六\10點等電聚焦電泳電泳時，每種蛋白遷移至與它的pI相一致的pH處加入蛋白樣品電場作用下在凝膠中建立穩(wěn)定的一個pH梯度當前第35頁\共有37頁\編于星期六\10點當前第36頁\