生物化學蛋白質-課件

第三部分氨基酸和蛋白質一、蛋白質的基本結構單位——氨基酸蛋白質和多肽的肽鍵可被催化水解酸/堿能將蛋白完全水解，得到各種AA的混合物酶水解一般是部分水解，得到多肽片段和AA的混合物地球上天然形成的AA300種以上。構成蛋白質的AA只有20余種，且都是α-氨基酸。蛋白質——shi——胨——多肽——肽——AA

1*1045*1032*1031000200～500100?結構通式：(脯氨酸除外)

－aa（一）常見氨基酸（20種）的結構及分類(兼性離子形式)（中性分子形式）?分類脂肪族aa（15）芳香族aa(3)雜環(huán)族aa(2)一氨基一羧基aa：Gly,Ala,Val,Leu,Ile含羥基aa：Ser,Thr含硫aa：Cys,Met含酰胺基aa：Asn,Gln一氨基二羧基aa(酸性aa)：Asp,Glu二氨基一羧基aa(堿性aa)：Lys,ArgPheTyrTrpHisPro++-根據(jù)R基化學結構和極性分類黑色：非極性R基氨基酸綠色：極性R基氨基酸—一氨基一羧基氨基酸脂肪族氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸）返回—羥基氨基酸：（絲氨酸、蘇氨酸）返回—含硫氨基酸：（半胱氨酸、甲硫氨酸）返回—含酰胺基氨基酸（天冬酰胺、谷氨酰胺）—一氨基二羧基氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）返回返回—二氨基一羧基氨基酸：（賴氨酸、精氨酸）返回芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）返回雜環(huán)族氨基酸（組氨酸、脯氨酸）因為其特殊的環(huán)狀R基團，脯氨酸（Proline）一般不出現(xiàn)在α-螺旋中，而經常出現(xiàn)在α-螺旋的開始處。由常見AA經修飾而來的不常見的蛋白質AA

羥脯氨酸：亞氨基酸之一，一般蛋白不存在這種氨基酸。在動物膠和骨膠原中含有L-羥脯氨酸。在生物體內羥脯氨酸是由脯氨酸合成的，但不是以游離狀態(tài)，而是在肽鏈中被羥基化。5-羥賴氨酸：與羥輔氨酸同在膠原中發(fā)現(xiàn)，是一種特異的氨基酸，在5位上帶有羥基。一般認為其合成是和羥輔氨酸一樣，是賴氨酸在膠原前驅物質肽中被氧化而產生的，但與羥輔氨酸比較，其含量很少。150多種多是蛋白質中L型α-AA衍生物有一些是β-，γ-，δ-AA有些是D-型AA

其他的非蛋白質AA鳥氨酸瓜氨酸鳥氨酸：是一種堿性氨基酸，在蛋白質中不能找到。作為尿素循環(huán)的一部分與尿素生成相關，在生物體內與精氨酸、谷氨酸、脯氨酸能相互轉變。在鳥類中它與2分子的苯甲酸或苯乙酸等結合成鳥尿酸的形式起解毒作用。（二）氨基酸的物理性質都為白色晶體，不同氨基酸結晶形狀不同。熔點很高，一般在200℃以上。溶解度：大多數(shù)氨基酸都溶于水。Pro溶解度最大，其次為lys,Arg。胱氨酸和Tyr的溶解度較小。氨基酸由于具有不對稱碳原子，所以具有旋光性。20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠紫外區(qū)(<220nm)均有光吸收。

氨基酸的光吸收特性Tyr

max=275nm

Phe

max=257nmTrpmax=280nm-

蛋白質max=280nm

在近紫外區(qū)(220-300nm）酪氨酸、苯丙氨酸和

色氨酸有光吸收。?氨基酸在晶體和水中主要以兼性離子存在。（三）氨基酸的酸堿性質氨基酸的兩性解離氨基酸是一類兩性電解質，它既起酸（質子供體）的作用，又起堿（質子受體）的作用。中性氨基酸的解離（以Gly為例）陽離子（A+）兼性離子（A0）K1兼性離子（A0）陰離子（A–）K2注：K1和K2分別為-COOH和-+NH3的解離常數(shù)?Handerson-Hasselbalch公式利用此公式可判斷任一pH條件下氨基酸各種基團的帶電狀態(tài)。pK1=2.19pKR=4.25pK2=9.67pK1=1.82pKR=6.0pK2=9.17His在pH7處有顯著的緩沖能力酸性氨基酸的解離（Glu為例）堿性氨基酸的解離（His為例）pK1=2.34pK2=9.60中性氨基酸的解離（Gly為例）pH=pIpH>pIpH<pI電場中靜電荷+

0

-不移動移向正極移向負極

氨基酸的等電點（isoelectricpoint,pI）?在一定pH范圍內，pH離pI越遠，氨基酸所帶靜電荷越大；利用各種aa的pI不同，可通過電泳法、離子交換層析法進行分離。調節(jié)溶液pH值，使氨基酸處于兼性離子狀態(tài)，此時氨基酸所帶正負電荷數(shù)相等，即凈電荷為0，在電場中既不向陽極又不向陰極移動，這時溶液的pH值即為氨基酸的等電點。定義pK1pK2pKRpI側鏈不解離中性氨基酸2.0~3.09.0~10.05~6酸性氨基酸AspGlu2.092.199.829.673.864.252.973.22堿性氨基酸ArgLysHis2.172.181.829.048.959.1712.4810.536.0010.769.747.59pI為兼性離子兩側相應解離基團pK的算數(shù)平均值。各種氨基酸的等電點甘氨酸5.97丙氨酸6.02谷氨酰胺5.65纈氨酸5.97亮氨酸5.98精氨酸10.76異亮氨酸6.02絲氨酸5.68賴氨酸9.74蘇氨酸6.53天冬氨酸2.98

組氨酸7.59天冬酰胺5.41谷氨酸3.22半胱氨酸5.02甲硫氨酸5.75苯丙氨酸5.48酪氨酸5.66色氨酸5.89脯氨酸6.30與2，4-二硝基氟苯（DNFB或FDNB）的反應弱堿中DNP-氨基酸（黃色）Sanger試劑此反應是Sanger法鑒定多肽或蛋白質N末端氨基酸的依據(jù)。(四)氨基酸的化學反應1.-NH2參加的反應與苯異硫氰酸酯（PITC）反應此反應是Edman法鑒定多肽或蛋白質N末端氨基酸的依據(jù)，在aa序列分析方面占有重要地位。苯乙內酰硫脲-氨基酸（PTH-aa）PTC-aa2.-羧基參加的反應例：成鹽和成酯反應氨基酸鈉鹽干燥HCL回流氨基酸乙酯鹽酸鹽aa羧基成鹽成酯后，-COOH被保護，而-NH2的反應活性加強。3.-氨基、α-羧基共同參加的反應紫色物質注意：脯氨酸、羥脯氨酸與茚三酮反應生成黃色物質。水合茚三酮此反應用于定性、定量鑒定氨基酸。茚三酮反應成肽反應肽鍵4.側鏈R基參加的反應氨基酸R基上的功能團也能發(fā)生化學反應。功能團：

羥基（Ser,Thr）巰基(Cys)苯基（Tyr,Trp）酚基(Tyr)吲哚基（Trp）咪唑基(His)胍基（Arg）甲硫基(Met)非-NH2(Lys)非-COOH(Asp,Glu)巰基易被空氣或其它氧化劑氧化胱氨酸在穩(wěn)定蛋白質空間構象上發(fā)揮很大作用二硫鍵注意：二硫鍵可被氧化劑和還原劑打開2+6HCOOH2+R—S—S—R2R—SH磺基丙氨酸巰基乙醇二硫蘇糖醇（DTT）6HCOOOH過甲酸二、蛋白質的一級結構氨基末端（N末端）羧基末端（C末端）一級結構定義：蛋白質多肽鏈的氨基酸排列順序和連接方式。氨基酸殘基1.肽的結構通式例：胰島素的一級結構[英]Sanger等，1953FrederickSanger3對二硫鍵A鏈：20aaB鏈：31aa0.36nm2.肽鍵C-N鍵具有部分雙鍵性質肽鍵一般為反式構型肽平面3.肽的物理和化學性質物理性質酸堿性質化學反應茚三酮反應、雙縮脲反應主要取決于游離末端的-NH2和-COOH及R基上可解離基團。短肽為晶體，熔點很高。在水溶液中以兼性離子形式存在。具旋光性。胰蛋白酶：R1=

Lys,ArgR2Pro麋蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：R1=

Phe,Trp,TyrR2Pro胃蛋白酶：R1,R2=Phe,Trp,Tyr,Leu等R1Pro嗜熱菌蛋白酶：R2=Leu,Ile,Phe,Trp,Val,Tyr,MetR2Pro,Gly肽鏈內切酶4.肽鏈的斷裂——酶解法和化學裂解法酶解法肽鏈外切酶氨肽酶羧肽酶CNBr：羥胺(NH2OH)：斷裂Asn-Gly之間的肽鍵化學裂解法R1=

Met,生成肽酰高絲氨酸內酯部分裂解Asn-Leu和Asn-Ala之間的肽鍵三、蛋白質的高級結構維持蛋白質高級結構的作用力主要是較弱的相互作用，即非共價鍵或次級鍵。

包括：

氫鍵、范德華力、疏水相互作用、鹽鍵（離子鍵）二硫鍵在維持蛋白質構象中也發(fā)揮重要作用?？稍诙嚯闹麈湹聂驶鹾王０窔渲g、側鏈與側鏈、側鏈與介質水之間等處形成。氫鍵（hydrogenbond）?包括三種較弱的作用力:定向效應：極性分子(或基團)之間誘導效應：極性和非極性分子(或基團)之間分散效應：非極性分子(或基團)之間?范德華距離（接觸距離，contactdistance）

范德華引力只有在兩個非鍵合原子處于一定距離才能達到最大，這個距離稱為范德華距離。等于兩個原子的范德華半徑之和。范德華力很弱，但具有加合性。范德華力（vanderWaalsforce）疏水基團或疏水側鏈出于避開水的需要而被迫接近，這種現(xiàn)象稱為疏水相互作用。定義:變性劑（尿素、非極性溶劑、去污劑等）可破壞疏水相互作用。疏水相互作用（hydrophobicinteraction）F=(Q1Q2)/(εR2)Q1，Q2:電荷電量ε：介質的介電常數(shù)R:電荷質點間的距離

定義:正、負電荷之間的一種靜電作用。生理pH條件下，酸性aa帶負電荷，堿性aa帶正電荷。在分子的疏水內部，帶相反電荷的側鏈可形成鹽鍵。鹽鍵:又稱離子鍵（ionicinteractions）對蛋白質的三級結構起穩(wěn)定作用。二硫鍵(disulfidebridge)(二)蛋白質的二級結構(seconarystructure)-螺旋（-helix）-折疊（-pleatedsheet）-轉角（-turn）-凸起(-bulge)無規(guī)卷曲（randomcoil）定義：指多肽鏈借助H鍵折疊盤繞成沿一維方向具有周期性結構的構象。常見類型：-螺旋（-helix）0.54nm0.15nm0.5nm-螺旋的結構要點：1）多肽主鏈沿中心軸盤繞成右手或左手螺旋；2）每圈螺旋含3.6個氨基酸殘基，螺距0.54nm，每個氨基酸殘基繞軸旋轉100°，沿軸上升0.15nm；螺旋直徑0.5nm;3）-螺旋中氨基酸殘基的側鏈伸向外側；4）相鄰螺旋間形成氫鍵，氫鍵幾乎與螺旋的長軸平行，是由肽鍵上酰胺氫與其前面N端第四個殘基上羰基氧之間形成。[NH-CH-CO]3CNOH3.613-螺旋影響-螺旋形成的因素

R基的電荷性質：同種電荷可產生靜電斥力。例：多聚Lys(pH7)。

R基的結構：

例：Pro、Hyp可中斷-螺旋。

R基的大?。篟基大，空間位阻大。例:多聚Ile-折疊片（

-pleatedsheet）-折疊股1）肽鏈主鏈取鋸齒狀折疊構象。2）兩條或多條多肽鏈之間側向聚集在一起，相鄰多肽鏈羰基氧和酰胺氫之間形成氫鍵，氫鍵與肽鏈的長軸幾乎成直角。3）側鏈R基交替分布于片層平面兩側。4）肽鏈的走向可以是平行的，也可以是反平行的。-折疊結構要點：平行反平行

-轉角（

-turn）AB

TheStructuresoftwokindsofβ-turns.含有4個氨基酸殘基。第一個殘基的羰基氧和第四個殘基的酰胺氫之間形成氫鍵。Gly和Pro常在-turn中出現(xiàn)。-轉角結構要點：-轉角可改變肽鏈走向。

-凸起（

-bugle）大多數(shù)作為反平行β折疊中的一種不規(guī)則情況?？烧J為是β折疊股中額外插入一個殘基。無規(guī)卷曲（randomcoil）多具有明確、穩(wěn)定的結構。常構成酶的活性部位和蛋白質的特異功能部位。鈣結合蛋白中的E-Fhand結構（二）超二級結構

蛋白質中，由若干相鄰的二級結構單元（如-螺旋、-折疊、-轉角）組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則、在空間上能辨認的二級結構組合體，以充當三級結構的構件，稱為超二級結構。三種基本組合形式：、、

。定義

Rossman折疊

（-螺旋束）2-4股右手-螺旋相互纏繞形成左手超螺旋連接鏈折疊股-螺旋（三）結構域（structuredomain）定義：對于較大的蛋白質分子（或亞基），多肽鏈往往由兩個或兩個以上相對獨立的三維實體締合而成三級結構，這種獨立的折疊單位稱為結構域。單結構域多結構域一般含100-200個氨基酸殘基。例：肌紅蛋白（153aa）例：己糖激酶（約1000aa）2個結構域結構域存在的優(yōu)越性：結構角度：

一條長的多肽鏈先分別折疊成幾個相對獨立的區(qū)域，再締合成三級結構，在動力學上更為合理。功能角度：

--通過結構域有利于構建具有特定三維結構的活性中心；

--結構域間易發(fā)生相對運動，有利于活性中心結合底物施加應力。Theconformationalchangeinducedinhexokinasebythebindingofasubstrate(D-glucose,showninred).己糖激酶兩個結構域之間為一個裂縫（四）蛋白質的三級結構定義：指多肽鏈在二級結構的基礎上借助各種次級鍵進一步盤繞成具有特定肽鏈走向的緊密球狀構象。含有多種二級結構元件，具有明顯的折疊層次。緊密的球狀實體，但活性部位具松散區(qū)域，以利于構象變化。疏水側鏈埋藏在分子內部，親水側鏈暴露在分子表面。分子表面有一個空穴（裂縫、口袋、凹槽），是結合配體并行使生物學功能的部位。共同特征：一級結構：Mr.16700，含153aa,由一條多肽鏈和一個血紅素輔基組成。

二級結構：-螺旋：8段，命名為A,B,C…..H

松散肽段：位于螺旋之間和C末端三級結構：8個螺旋段大體分成兩層，整個分子緊密結實，分子內部僅能容納4個水分子。Mb是哺乳動物肌細胞貯存和分配氧的蛋白質。例：肌紅蛋白(Mb)的三級結構

血紅素（heme）結合的位置位于肌紅蛋白表面的疏水洞穴內。疏水微環(huán)境可防止Fe（II）被氧化成Fe（III）從而失去載氧能力。血紅素（Fe-原卟啉IX）卟啉血紅素（鐵原卟啉IX）

由原卟啉IX與一個Fe原子（II或III）組成。Fe（II）有六個配位鍵，四個與卟啉N結合，第5個與F8His殘基的咪唑N結合，第6個呈開放狀態(tài)，是O2的結合部位，其附近為E7His。因E7His的存在而產生的空間位阻可降低血紅素對CO的親和力。（五）蛋白質的四級結構定義

具三級結構的球狀蛋白質以非共價鍵締合在一起，形成的聚集體稱為蛋白質的四級結構。其中每個球狀蛋白質稱為亞基。指蛋白質與配基結合改變蛋白質的構象，進而改變蛋白質生物活性的現(xiàn)象。寡聚蛋白質與別構效應例：血紅蛋白的結構和功能（1）寡聚蛋白質:Mr.65000。具四個亞基（22），每個亞基與一個血紅素分子結合。（2）一級結構:

:141aa:146aa9個保守殘基：F8His(87,92)、E7His（58,63）等（3）二、三級結構：和鏈與Mb相類似亞基間具8個鹽橋兩個亞基與1分子BPG

(2,3-二磷酸甘油酸)形成8個鹽橋（4）四級結構：分子近球形，四個亞基占據(jù)四面體的四個角，以鹽鍵相連。由于這些鹽橋，血紅蛋白在未與氧結合之前，分子構象受到很大束縛。Thethree-dimensional(quaternarylstructureofdeoxyhemoglobin.(a)Aribbonrepresentation.(b)Aspace-fillingmodel.Theαsubunitsareshowninwhiteandlightblue;theβsubunitsareshowninpinkandpurple.Notethatthehemegroups,showninred,arerelativelyfarapart.Saltbridgesbetweensubunitsinhemoglobin.四、蛋白質的理化性質及分離純化技術1.蛋白質的大小和分子量蛋白質分子量:

6000—