醫(yī)學(xué)專題-酶、細胞、原生質(zhì)體固定化

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第二章酶與細胞(xìbāo)的固定化

固定化生物技術(shù)(jìshù)——通過化學(xué)或物理的手段將酶或游離細胞定位于限定的空間區(qū)域內(nèi)，使其保持活性并可反復(fù)利用。第二頁，共八十五頁。編輯ppt1.酶是蛋白質(zhì)，穩(wěn)定性差（熱、酸堿、有機溶劑對其有影響(yǐngxiǎng)）。2.不能回收，也使產(chǎn)物中混雜酶蛋白。3.分離純化困難。

游離(yóulí)酶的缺點：第三頁，共八十五頁。編輯ppt一、固定化酶和固定化細胞的定義及特點1.固定化酶(immobilizedenzyme)固定在載體上并在一定(yīdìng)空間范圍內(nèi)進行催化反應(yīng)的酶。

第一節(jié)酶與細胞(xìbāo)的固定化第四頁，共八十五頁。編輯ppt什么(shénme)是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體(zàitǐ)水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)(jìshù)第五頁，共八十五頁。編輯ppt優(yōu)點：(1)可提高穩(wěn)定性。(2)能回收，易與產(chǎn)物分離，可反復(fù)使用。缺點(quēdiǎn)：(1)存在擴散限制。適于催化小分子物質(zhì)。(2)酶活性下降。第六頁，共八十五頁。編輯ppt

2.固定化細胞（immobilizedcell）固定在載體上并在一定(yīdìng)空間范圍內(nèi)進行生命活動（生長、繁殖、新陳代謝）的細胞。第七頁，共八十五頁。編輯ppt優(yōu)越性：(1)降低成本，省去酶的分離純化工作;(2)既可作為單一酶，也可作為復(fù)合酶系完成部分代謝過程。局限性：(1)細胞內(nèi)多種酶的存在(cúnzài)，會形成不需要的副產(chǎn)物。(2)細胞膜、細胞壁和載體都存在著擴散限制作用。第八頁，共八十五頁。編輯ppt3.固定化原生質(zhì)體意義：(1)固定化原生質(zhì)體去除了細胞壁的擴散障礙，有利于氧的傳遞，營養(yǎng)成分的吸收(xīshōu)和胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌。(2)原生質(zhì)體不穩(wěn)定，容易破裂，固定化后，由于載體的保護作用，穩(wěn)定性提高。第九頁，共八十五頁。編輯ppt

二、固定化方法(fāngfǎ)固定化方法(fāngfǎ)（一）酶的固定化方法(fāngfǎ)吸附法共價偶聯(lián)法交聯(lián)法包埋法網(wǎng)格型微囊型離子交換吸附物理吸附法第十頁，共八十五頁。編輯ppt依據(jù)帶電的酶或細胞和載體(zàitǐ)之間的靜電作用，使酶吸附于惰性固體的表面或離子交換劑上。1.吸附(xīfù)法（adsorption）第十一頁，共八十五頁。編輯ppt根據(jù)吸附劑的特點分:1）物理吸附法（physicaladsortion）作用力：氫鍵、疏水鍵常用載體(zàitǐ)：氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石、纖維素、活性碳等。2）離子結(jié)合法（ionbinding）作用力：離子鍵常用載體：DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM-纖維素第十二頁，共八十五頁。編輯ppt優(yōu)點：條件溫和，操作簡便(jiǎnbiàn)，酶活力損失少。缺點：結(jié)合力弱，易解吸附。第十三頁，共八十五頁。編輯ppt借助共價鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團和載體的功能(gōngnéng)基團進行偶聯(lián)。2.共價(ɡònɡjià)偶聯(lián)法（covalentbindingorcovalentcoupling）

第十四頁，共八十五頁。編輯ppt1）載體：親水載體優(yōu)于疏水載體

如:天然(tiānrán)高分子衍生物:纖維素葡聚糖凝膠親和性好，機械性能差瓊脂糖合成聚合物：聚丙烯酰胺 聚苯乙烯機械性能好，但有疏水結(jié)構(gòu)尼龍第十五頁，共八十五頁。編輯ppt2）偶聯(lián)方法(fāngfǎ)：偶聯(lián)成功與否取決于： 載體：功能基團：芳香氨基，羧基，羧甲基等。酶分子:側(cè)鏈非必需基團：羧基，巰基，羥基，酚基，咪唑基。 第十六頁，共八十五頁。編輯ppt

常用(chánɡyònɡ)的偶聯(lián)反應(yīng)有：重氮化法、疊氮法、溴化氰法、烷基化法等。第十七頁，共八十五頁。編輯ppt優(yōu)點：酶與載體結(jié)合牢固，不會輕易脫落，可連續(xù)使用。缺點(quēdiǎn)：反應(yīng)條件較激烈，易影響酶的空間構(gòu)象而影響酶的催化活性。

第十八頁，共八十五頁。編輯ppt3.交聯(lián)法（crosslinking）借助雙功能試劑使酶分子(fēnzǐ)之間發(fā)生交聯(lián)的固定化方法。雙功能試劑：

常用的是戊二醛 O

O H—C—CH2—CH2—

CH2—

C—H第十九頁，共八十五頁。編輯ppt

戊二醛有兩個醛基，均可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基(ānjī)反應(yīng),使酶蛋白交聯(lián)。

此法與共價(ɡònɡjià)偶聯(lián)法利用的均是共價(ɡònɡjià)鍵，不同之處：交聯(lián)法不使用載體。第二十頁，共八十五頁。編輯ppt

交聯(lián)反應(yīng)既能發(fā)生在分子間，也可發(fā)生在分子內(nèi)。酶濃度低時，交聯(lián)發(fā)生在分子內(nèi)，酶仍保持(bǎochí)溶解狀態(tài)。酶濃度高時，交聯(lián)發(fā)生在分子間，酶變?yōu)椴蝗軕B(tài)。第二十一頁，共八十五頁。編輯ppt

缺點：(1)反應(yīng)條件激烈，酶分子的多個基團被交聯(lián)，酶活力損失大。(2)制備(zhìbèi)的固定化酶顆粒較小，給使用帶來不便。

第二十二頁，共八十五頁。編輯ppt4.包埋法（entrapment）

將酶用物理(wùlǐ)的方法包埋在各種載體（高聚物）內(nèi)。分為：網(wǎng)格型：將酶包埋在高分子凝膠細微網(wǎng)格中。微囊型：將酶包埋在高分子半透膜中。第二十三頁，共八十五頁。編輯ppt1）網(wǎng)格(wǎnɡɡé)型包埋法（gel(lattic)entrapment）又稱凝膠包埋法凝膠包埋條件酶活性強度天然凝膠瓊脂、海藻酸鈣、角叉菜膠、明膠溫和不變差合成凝膠聚丙烯酰胺、光交聯(lián)樹脂聚合反應(yīng)部分失活高使用(shǐyòng)的多孔載體及其特點第二十四頁，共八十五頁。編輯ppt海藻(hǎizǎo)酸鈣凝膠包埋法：滴至海藻酸鈉溶液＋E(orcell)CaCl2溶液中IE(orIC)

角叉菜膠包埋法：滴至角叉菜膠＋E(orcell)KCl

溶液中IE(orIC)聚丙烯酰胺凝膠包埋法：APAcr+Bis+E(orcell)IE(orIC)TEMED第二十五頁，共八十五頁。編輯ppt2）微囊型包埋法（microencapsulation）

又稱半透膜包埋法將一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜內(nèi)。半透膜：直徑幾十微米到幾百微米，厚約25nm。半透膜孔徑<酶分子孔徑，小于半透膜孔徑的小分子底物(dǐwù)和產(chǎn)物可以自由進出，被稱為“人工細胞”。第二十六頁，共八十五頁。編輯ppt

與網(wǎng)格型包埋法相比，微囊型包埋法的優(yōu)點：1）固定化酶顆粒小，有利于底物和產(chǎn)物擴散。2）半透膜能阻止蛋白質(zhì)分子滲漏和進入，注入體內(nèi)既可避免引起免疫過敏反應(yīng)，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有較大(jiàodà)的醫(yī)學(xué)價值。缺點：反應(yīng)條件要求高,制備成本也較高。

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包埋法是目前應(yīng)用最多的一種較理想的方法，與其它固定化方法相比：優(yōu)點：不與酶蛋白氨基酸殘基反應(yīng)，很少改變酶的高級結(jié)構(gòu)，酶活回收率高。缺點：只適合作用(zuòyòng)于小分子底物和產(chǎn)物的酶。第二十八頁，共八十五頁。編輯ppt

吸附法共價偶聯(lián)法交聯(lián)法包埋法

酶的四種固定化方法第二十九頁，共八十五頁。編輯ppt第三十頁，共八十五頁。編輯ppt第三十一頁，共八十五頁。編輯ppt固定化方法吸附法包埋法共價結(jié)合法交聯(lián)法物理吸附法離子吸附法制備難易易易較難難較難結(jié)合程度弱中等強強強活力回收高，酶易流失高高低中等再生可能可能不能不能不能費用低低低高中等底物專一性不變不變不變可變可變各種(ɡèzhǒnɡ)固定化方法的優(yōu)缺點比較第三十二頁，共八十五頁。編輯ppt分類方式固定化細胞分類方式固定化細胞細胞類型微生物植物動物生理狀態(tài)死細胞:完整細胞,細胞碎片,細胞器活細胞:增殖細胞,靜止細胞,饑餓細胞（二）細胞(xìbāo)的固定化方法

1.固定化細胞的分類第三十三頁，共八十五頁。編輯ppt

1)直接固定法

不使用載體，借助(jièzhù)物理（如加熱、冰凍）、化學(xué)方法（如檸檬酸、各種絮凝劑）將細胞直接固定。一般只用于單酶或少數(shù)幾種酶催化的反應(yīng)。

2)吸附法3)包埋法

2.固定化方法(fāngfǎ)第三十四頁，共八十五頁。編輯ppt

例如：葡萄糖異構(gòu)酶(白色鏈霉菌)，是一種胞內(nèi)酶。在50--80℃加熱10分鐘，使菌體自溶作用的酶失活，而葡萄糖異構(gòu)酶仍然保持(bǎochí)活性，長期使用酶活力不減少。第三十五頁，共八十五頁。編輯ppt

微生物細胞植物細胞動物細胞

吸附法吸附力較弱，細胞易脫落包埋法第三十六頁，共八十五頁。編輯ppt實驗：

2.4%左右的卡拉膠，70℃溶解,再冷卻到42℃,+10%左右的細菌菌體(預(yù)熱到42℃）

迅速混合均勻(jūnyún)4℃冰箱放置大約30min取出后切成3×3mm的小顆粒

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一般采用網(wǎng)格包埋法（即凝膠包埋法）。常用凝膠：瓊脂凝膠，海藻(hǎizǎo)酸鈣凝膠，角叉菜膠和光交聯(lián)樹脂。注意：一般要加滲透壓穩(wěn)定劑，以防止原生質(zhì)體破裂。（三）原生質(zhì)體的固定化方法(fāngfǎ)第三十八頁，共八十五頁。編輯ppt

第二節(jié)

固定化酶和固定化細胞的性質(zhì)(xìngzhì)與表征一、固定化酶的性質(zhì)

影響酶催化活性的因素1.構(gòu)象改變或立體屏蔽以及微擾2.分配效應(yīng)和擴散限制效應(yīng)第三十九頁，共八十五頁。編輯ppt第四十頁，共八十五頁。編輯ppt第四十一頁，共八十五頁。編輯ppt

（一）酶的活性：

通常(tōngcháng)低于天然酶（有例外）。

（二）酶的穩(wěn)定性酶的耐熱性、對變性劑、抑制劑、蛋白酶的抵抗力增加。第四十二頁，共八十五頁。編輯ppt

可能的原因：①固定化增加了酶活性構(gòu)象的牢固程度，可防止酶分子伸展變形(biànxíng)；②抑制酶的自身降解。③固定化部分阻擋了外界不利因素對酶的侵襲。第四十三頁，共八十五頁。編輯ppt如：氨基(ānjī)?；福?0℃，15分鐘，酶失去活性。而固定化后，70℃，15分鐘，有>80%活性。第四十四頁，共八十五頁。編輯ppt

（三）酶的最適溫度

最適溫度與酶穩(wěn)定性有關(guān)。多數(shù)酶固定化后熱穩(wěn)定性上升，最適溫度也上升（有例外）。

（四）酶的最適pH

帶負電荷載體：最適pH向堿性(jiǎnxìnɡ)偏移。帶正電荷載體：最適pH向酸性偏移。第四十五頁，共八十五頁。編輯ppt第四十六頁，共八十五頁。編輯ppt

固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km隨載體的帶電性能變化(biànhuà)。固定化載體與底物電荷相反,固定化酶的表觀Km值降低。固定化載體與底物電荷相同,固定化酶的表觀Km值顯著增加。（五）酶的動力學(xué)特征(tèzhēng)第四十七頁，共八十五頁。編輯ppt與自然酶基本相同。但大分子底物難于(nányú)接近酶分子，導(dǎo)致酶的專一性發(fā)生改變。（六）酶的作用(zuòyòng)專一性

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與固定化酶相比，固定化細胞的情況比較復(fù)雜。（1）有活性升高的現(xiàn)象(xiànxiàng)。（2）穩(wěn)定性的增加。（3）最適溫度和最適pH常保持不變。二、固定化細胞(xìbāo)的性質(zhì)

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(一)酶(細胞(xìbāo))的活力

固定化酶通常呈顆粒狀，一般用于測定自然酶活力的方法改進后才能用于測定固定化酶。

(二)蛋白總量

1.雙辛可寧酸法(BCA法)2.考馬斯亮藍法

三、固定化酶（細胞(xìbāo)）的評價指標(biāo)

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(三)偶聯(lián)率及相對(xiāngduì)活力

偶聯(lián)率=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/加入蛋白活力×100%活力回收=固定化酶總活力/加入酶的總活力×100%相對活力=固定化酶總活力/(加入酶的總活力-上清液中未偶聯(lián)酶活力)×100%第五十一頁，共八十五頁。編輯ppt

(四)半衰期

在連續(xù)(liánxù)測定條件下，固定化酶(細胞)的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)(liánxù)工作時間，以t1/2表示。是衡量穩(wěn)定性的一項重要指標(biāo)。第五十二頁，共八十五頁。編輯ppt不同(bùtónɡ)固定化方法的比較carriersRecoveryofenzymeactivity(%)Agar54.0po1yacrvlamldel5.24Gelatin40.77carragheenan69.13Glutaraldehyde0第五十三頁，共八十五頁。編輯ppt乙酰-DL—AlaL—Ala+乙酸(yǐsuān) 乙酰-D—Ala第三節(jié)固定化酶與固定化細胞的應(yīng)用(yìngyòng)

一、在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用1.氨基?；福ˋminoacylase）世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶第五十四頁，共八十五頁。編輯ppt泵儲罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機消旋反應(yīng)器固定化酶柱子晶體L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala第五十五頁，共八十五頁。編輯ppt

2.葡萄糖異構(gòu)酶世界上生產(chǎn)規(guī)模最大，應(yīng)用最為成功(chénggōng)的一種固定化酶。第五十六頁，共八十五頁。編輯ppt二、固定化酶在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用1.消血栓：纖溶酶是異源蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)引起免疫(miǎnyì)反應(yīng)，無法長期使用。酶的不穩(wěn)定性使其在較短的時間內(nèi)失活。用包埋法制備的酶固定化技術(shù)可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物質(zhì)能自由進出。第五十七頁，共八十五頁。編輯ppt2.人工(réngōng)腎：原理：將病人血液中的尿素經(jīng)脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微膠囊活性炭組成人工腎。第五十八頁，共八十五頁。編輯ppt第五十九頁，共八十五頁。編輯ppt酶傳感器

固定化酶和電化學(xué)傳感器的結(jié)合。優(yōu)點：①既有不溶性酶體系的優(yōu)點，又具有電化學(xué)電極的高靈敏度；②酶的專一反應(yīng)性，使其具有較高的選擇性，能夠直接在復(fù)雜試樣中進行(jìnxíng)測定。三、在分析檢測(jiǎncè)中的應(yīng)用第六十頁，共八十五頁。編輯pptSensitiveandspecificRapidSimpleBiosensor第六十一頁，共八十五頁。編輯ppt

1967年Updike等采用酶的固定化技術(shù)，將葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧電極結(jié)合，組裝成了世界(shìjiè)上第一個生物傳感器——葡萄糖氧化酶電極。第六十二頁，共八十五頁。編輯ppt葡萄糖酶電極(diànjí)酶電極(diànjí)示意圖?－D－葡萄糖＋O2 D－葡萄糖酸－1，5－內(nèi)酯＋H2O2半透膜酶膠層感應(yīng)(gǎnyìng)電極第六十三頁，共八十五頁。編輯pptGlucoseGluconicacidGlucoseoxidaseOxygenHydrogenperoxideMembraneElectrode根據(jù)反應(yīng)(fǎnyìng)中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧電極、pH電極和H2O2電極來測定葡萄糖的含量。第六十四頁，共八十五頁。編輯ppt繼酶傳感器（enzymesensor）后，又出現(xiàn)(chūxiàn)：細胞器傳感器（cellorganellesensor）組織傳感器（tissuesensor）微生物傳感器（microbesensor）免疫傳感器（immunosensor）第六十五頁，共八十五頁。編輯ppt1）酶傳感器的原理(yuánlǐ)生物傳感器

由生物識別(shíbié)單元（如酶、微生物、抗體等）和物理轉(zhuǎn)換器相結(jié)合所構(gòu)成的分析儀器。第六十六頁，共八十五頁。編輯ppt第六十七頁，共八十五頁。編輯ppt生物識別(shíbié)元件

(Biologicalrecognitionelement)是酶、抗原(體)、細胞器、組織切片和微生物(shēngwù)細胞等生物(shēngwù)分子經(jīng)固定化后形成的一種膜結(jié)構(gòu)，對被測定的物質(zhì)有選擇性的分子識別能力。第六十八頁，共八十五頁。編輯ppt換能器(Transducer)將識別元件上進行的生化反應(yīng)中消耗或生成(shēnɡchénɡ)的化學(xué)物質(zhì)，或產(chǎn)生的光或熱等轉(zhuǎn)換為電信號，并呈現(xiàn)一定的比例關(guān)系。第六十九頁，共八十五頁。編輯ppt第七十頁，共八十五頁。編輯ppt酶傳感器工作(gōngzuò)原理示意圖酶傳感器主要由固定化酶膜和變換器組成：固定化酶膜：選擇性地“識別”并催化被檢測物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)(huàxuéfǎnyìng)；變換器：把催化反應(yīng)中底物或產(chǎn)物的變量轉(zhuǎn)換成電信號，通過儀表顯示出來。

第七十一頁，共八十五頁。編輯ppt第七十二頁，共八十五頁。編輯ppt2）酶傳感器的應(yīng)用(yìngyòng)

水質(zhì)監(jiān)測

用化學(xué)法測定酚時，硫化物、油類等可干擾其測定。從馬鈴薯中提純、經(jīng)吸附交聯(lián)得到的固定化多酚氧化酶與氧電極構(gòu)成(gòuchéng)酚傳感器，可檢測大多數(shù)酚類化合物。第七十三頁，共八十五頁。編輯ppt德國研發(fā)的環(huán)境(huánjìng)廢水BOD分析儀第七十四頁，共八十五頁。編輯ppt醫(yī)療方面葡萄糖傳感器和血糖(xuètáng)測定儀

用葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase,GOD）制成葡萄糖傳感器，可測定血液中葡萄糖濃度。第七十五頁，共八十五頁。編輯ppt手掌(shǒuzhǎng)型葡萄糖(glucose)分析儀第七十六頁，共八十五頁。編輯pptSBA-50型單電極(diànjí)生物傳感分析儀第七十七頁，共八十五頁。編輯pptSBA-70型血糖乳酸(rǔsuān)自動分析儀第七十八頁，共八十五頁。編輯ppt食品鮮度魚鮮度傳感器在日本、加拿大等國廣泛用于魚類鮮度的測定。魚死后體內(nèi)(tǐnèi)ATP經(jīng)酶解依次形成ADP、AM