核酸血液篩查(上海浩源)課件

核酸血液篩查07June2023P12023/6/7分子生物學(xué)概論一核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)二三

目錄P2核酸血液篩查系統(tǒng)07June2023四血站核酸檢測(cè)樣本的采集、運(yùn)送和保存三PCR實(shí)驗(yàn)室的污染防治2023/6/7

分子生物學(xué)概論P(yáng)307June2023

核酸的分子組成-核苷酸2023/6/7

分子生物學(xué)概論P(yáng)407June2023

DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)CytosineAdenineThymineGuanineHydrogenBondsDeoxyribose(Sugarmolecule)PhosphoricAcid(Phosphatemolecule)由A/T/G/C四種單核苷酸組成2023/6/7

分子生物學(xué)概論

DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)P507June2023DNA分子由相互平行、走向相反、堿基互補(bǔ)的兩條脫氧核糖核苷酸鏈圍繞同一中心軸，盤(pán)繞成雙螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋的一側(cè)為大溝，另一側(cè)為小溝。平行鏈對(duì)應(yīng)堿基總是A==T、G===C配對(duì)（basepairing)或互補(bǔ)，形成穩(wěn)定聯(lián)系。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)2023/6/7P607June2023分子生物學(xué)概論

核酸的理化性質(zhì)DNA的熱變性與復(fù)性DNA熱變性后緩慢冷卻處理過(guò)程稱(chēng)退火annealingDNA加熱變性后，若經(jīng)驟然降溫，互補(bǔ)鏈堿基之間來(lái)不及配對(duì)互補(bǔ)，形成氫鍵聯(lián)系，兩鏈維持分離狀態(tài)。慢驟2023/6/7

分子生物學(xué)概論

P707June2023核酸分子雜交hybridization

當(dāng)不同來(lái)源的核酸變性后一起復(fù)性時(shí)，只要這些核酸分子中含有相同序列的片段，即可形成堿基配對(duì)，出現(xiàn)復(fù)性現(xiàn)象，形成雜種核酸分子，或稱(chēng)雜化雙鏈，稱(chēng)核酸分子雜交。2023/6/7

分子生物學(xué)概論

P807June2023

DNA半保留復(fù)制DNA合成進(jìn)行時(shí)，以?xún)蓷l親代DNA鏈中的每—條鏈為模板，在DNA指導(dǎo)下的DNA聚合酶催化下，按A與T、G與C堿基配對(duì)原則合成子代DNA的過(guò)程稱(chēng)DNA的復(fù)制(replication)。由于復(fù)制合成的子代DNA兩條脫氧核糖核苷酸鏈中有一條來(lái)自親代DNA，另一條是以前者為模板新合成的子代DNA鏈，所以DNA的這種合成作用又稱(chēng)半保留復(fù)制(semiconservativereplication)。2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P907June2023核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)磁珠法提取核酸熒光PCR技術(shù)與TMA技術(shù)UNG-dUTP防污染系統(tǒng)內(nèi)對(duì)照分子2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P1007June2023

磁珠法提取核酸樣品核酸提取磁珠法2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P1107June2023

磁珠法提取核酸第一步：細(xì)胞的裂解：破碎細(xì)胞，并向溶液中加入磁珠。

第二步：結(jié)合核酸：pH較低，在高鹽環(huán)境下，硅膠磁珠帶正電荷，選擇性的與優(yōu)化試劑中的核酸結(jié)合2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P1207June2023

磁珠法提取核酸第三步：洗滌：用洗滌液將非核酸成分沖洗分離（為清洗干凈該步驟可以重復(fù)多次）。第四步：核酸的洗脫：pH升高，在低鹽環(huán)境下，核酸被洗脫下來(lái)。2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P1307June2023

PCR技術(shù)5’5’3’3’d.NTPs耐熱DNA聚合酶引物5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’加入試管中2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P1407June2023

PCR技術(shù)循環(huán)循環(huán)延伸5’3’5’3’5’3’5’3’繼續(xù)延伸5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’循環(huán)2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P1507June2023

PCR技術(shù)5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’第二個(gè)循環(huán)4個(gè)拷貝第三個(gè)循環(huán)8個(gè)拷貝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’第n個(gè)循環(huán)2n個(gè)拷貝2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P1607June2023

PCR技術(shù)2023/6/7

分子生物學(xué)概論

P1707June2023

TMA技術(shù)2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P1807June2023

TMA與PCR比較TMAPCR擴(kuò)增原理模擬自然DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA的過(guò)程模擬自然DNA復(fù)制的過(guò)程靶目標(biāo)RNADNA酶MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及T7RNA聚合酶DNA聚合酶反應(yīng)體系兩種酶，兩條引物，dNTP,NTP一種酶，一對(duì)引物，dNTP溫度條件恒溫（41.5℃）循環(huán)導(dǎo)熱（變性，退火，延伸）擴(kuò)增儀器水浴箱或者加熱塊熱循環(huán)儀擴(kuò)增產(chǎn)物RNADNA擴(kuò)增速度每個(gè)循環(huán)可以生成100-1000個(gè)復(fù)制物，在15-30分鐘內(nèi)可增加10億倍復(fù)制物以2n擴(kuò)增，2～3h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大10億倍2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P1907June2023

熒光PCR技術(shù)SYBRGREENMolecularbeacon2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P2007June2023TaqMan熒光PCR技術(shù)2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P2107June2023

TaqMan熒光PCR技術(shù)5’5’3’3’d.NTPsThermalStableDNAPolymerasePrimers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AddMasterMixandSampleDenaturation5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AnnealingReactionTubeTaql5’3’RQProbe5’3’RQ2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P2207June2023

TaqMan熒光PCR技術(shù)5’3’5’3’ExtensionStep5’3’1.StrandDisplacementTaq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’2.Cleavage3.PolymerizationComplete5’3’QTaqR3’5’4.Detection5’3’3’QTaqR5’lR5’3’RQ2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P2307June2023

熒光定量PCR技術(shù)一般而言，熒光擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P2407June2023

CT值與閾值CT值的定義是PCR擴(kuò)增過(guò)程中，熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P2507June2023

CT值與閾值實(shí)驗(yàn)操作中，CT值定義為在基線上方產(chǎn)生可檢測(cè)到的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的熒光發(fā)射時(shí)所對(duì)應(yīng)的PCR循環(huán)次數(shù)（圖）?！盎€上方”也就是閾值高度的量化定義是基線范圍內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。閾值所在的橫線與PCR擴(kuò)增曲線的交點(diǎn)所指的PCR循環(huán)次數(shù)就是CT值。2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P2607June2023

熒光定量PCR檢測(cè)流程圖2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P2707June2023

UNG-dUTP防污染系統(tǒng)UUUU50℃,2minUNGUNG：Uracil-DNA

Glycosylase，也稱(chēng)為UDG，尿嘧啶糖基化酶2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P2807June2023

UNG生化特性1234無(wú)作用：游離U、A、T、G、C和RNA不耐熱：37-50℃95℃分子量小球蛋白發(fā)揮作用不依賴(lài)于Mg2+作用范圍：?jiǎn)捂満碗p鏈U堿基糖苷鍵2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P2907June2023dUTP-UNG系統(tǒng)實(shí)施的必要性產(chǎn)物污染交叉污染試劑污染天然核酸的污染實(shí)驗(yàn)室污染物理分區(qū)紫外線照射高壓消毒10%次氯酸鈉DNaseI消化UNG消化2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P3007June2023dUTP-UNG作用原理特異地識(shí)別DNA分子中尿嘧啶核苷切割下來(lái)，形成自由的尿嘧啶和“糖-磷酸”骨架加熱或堿性條件下，DNA在“糖-磷酸骨架”處斷裂模板無(wú)法擴(kuò)增dUTP代替dTTP擴(kuò)增，形成UNG有效作用底物U-DNA2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P3107June2023dUTP-UNG作用示意圖2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P3207June2023dUTP-UNG優(yōu)缺點(diǎn)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)TextText防止含dU產(chǎn)物的污染不影響目的片段的擴(kuò)增作用條件簡(jiǎn)單，易實(shí)現(xiàn)。只防自身產(chǎn)物的污染，不防天然產(chǎn)物的污染。若混有核酸酶，會(huì)同時(shí)分解目的產(chǎn)物。UNG致使CT值增加，易導(dǎo)致假陰性。dUTP在對(duì)GC豐富的模板時(shí)作用不大。滅活不夠完全。相對(duì)用dTTP，成本高。VS2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P3307June2023內(nèi)對(duì)照分子TextText內(nèi)參照的概念人工合成的小片段DNA，放在反應(yīng)液中和待測(cè)目的基因一起擴(kuò)增。內(nèi)對(duì)照是PCR方法檢測(cè)疾病基因的必需成分，是防止假陰性、提高檢測(cè)結(jié)果可靠性的重要標(biāo)示。內(nèi)對(duì)照對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，包括樣品提取、分裝、PCR熱循環(huán)儀孔間差、PCR抑制元素等等可能的影響因素進(jìn)行監(jiān)控，防止假陰性，提高安全性2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P3407June2023

競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)對(duì)照分子3’5’5’3’3’5’120291310(BP)兩端為特異性引物目的基因片段

內(nèi)對(duì)照順序競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)對(duì)照的概念與目的基因使用相同的引物。擴(kuò)增產(chǎn)物序列與目的基因不同，可用不同的探針檢測(cè)。2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P3507June2023

競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)對(duì)照分子3’5’5’3’3’5’120291310(BP)內(nèi)對(duì)照特異性引物目的基因片段

內(nèi)對(duì)照順序非競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)對(duì)照的概念與目的基因使用不同的引物。擴(kuò)增產(chǎn)物序列與目的基因不同，可用不同的探針檢測(cè)。目的基因特異性引物2023/6/7

核酸血液篩查相關(guān)技術(shù)

P3607June2023內(nèi)對(duì)照分子內(nèi)對(duì)照的作用真實(shí)反應(yīng)擴(kuò)增效率避免假陰性：假陰性是目前血液篩查中最重視的問(wèn)題之一，內(nèi)標(biāo)全程進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控質(zhì)控血篩核酸檢測(cè)的內(nèi)對(duì)照設(shè)計(jì)理念中心理念：監(jiān)測(cè)全程的實(shí)驗(yàn)過(guò)程包含病毒核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、及擴(kuò)增過(guò)程的效率。內(nèi)對(duì)照選用：最好能達(dá)到上述三個(gè)條件，且能顧及仿真病毒的安全性。2023/6/7

核酸血液篩查系統(tǒng)

P3707June2023核酸血液篩查系統(tǒng)核酸檢測(cè)樣本匯集設(shè)備自動(dòng)化核酸提取設(shè)備PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)設(shè)備2023/6/7

核酸血液篩查系統(tǒng)

P3807June2023

核酸血液篩查系統(tǒng)分析后采集容器采集方式保存運(yùn)輸不合格樣本：脂血、溶血、樣本量不足樣本分析中分析前檢測(cè)結(jié)果純化試劑準(zhǔn)備儀器維護(hù)自檢準(zhǔn)備：質(zhì)控樣本試劑前處理混樣信息錄入擴(kuò)增檢測(cè)核酸純化檢測(cè)系統(tǒng)試劑`設(shè)備質(zhì)控品檢測(cè)試劑的準(zhǔn)備2023/6/7

核酸血液篩查系統(tǒng)

P3907June2023核酸檢測(cè)樣本匯集設(shè)備加樣器HAMILTON液體工作站2023/6/7

核酸血液篩查系統(tǒng)

P4007June2023自動(dòng)化核酸提取設(shè)備自動(dòng)化核酸提取(EZbeadsystem-32)2023/6/7

核酸血液篩查系統(tǒng)

P4107June2023PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)設(shè)備ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀2023/6/7血站核酸檢測(cè)樣本的采集、運(yùn)送和保存

P4207June2023血站核酸檢測(cè)樣本的采集、運(yùn)送和保存樣本的采集樣本的運(yùn)送樣本的接收與保存2023/6/7血站核酸檢測(cè)樣本的采集、運(yùn)送和保存

P4307June2023關(guān)注采集、保存、運(yùn)輸?shù)募?xì)節(jié)運(yùn)輸條件離心采血管2023/6/7

P4407June2023

標(biāo)本的采集-采血管無(wú)菌真空采血管一、血清管普通血清管帶分離膠的血清管二、抗凝管

EDTA2K或3K抗凝管

EDTA2K抗凝間分離膠（PPT)

枸櫞酸鈉抗凝管血站核酸檢測(cè)樣本的采集、運(yùn)送和保存2023/6/7

P4507June2023標(biāo)本的采集-離心離心條件

800-1600g20min離心分離的時(shí)間要求—HCVRNA和HIVRNA研究方式不同（樣本、檢測(cè)）結(jié)論差異大離心時(shí)間完成地點(diǎn)血站核酸檢測(cè)樣本的采集、運(yùn)送和保存2023/6/7

P4607June2023

標(biāo)本的運(yùn)送2-8°C穩(wěn)定48hr

血站核酸檢測(cè)樣本的采集、運(yùn)送和保存2023/6/7

P4707June2023標(biāo)本的接收、保存確認(rèn)標(biāo)本數(shù)量運(yùn)輸狀態(tài)標(biāo)本狀態(tài)：溶血、脂血保存：用于檢測(cè)的樣本管：檢測(cè)前保存用于留樣備查的樣本：樣本量血站核酸檢測(cè)樣本的采集、運(yùn)送和保存2023/6/7

P4807June2023檢測(cè)前核對(duì)狀態(tài)標(biāo)識(shí)接收時(shí)間離心后至檢測(cè)前2-8°C保存不超過(guò)48小時(shí)血站核酸檢測(cè)樣本的采集、運(yùn)送和保存2023/6/7

P4907June2023長(zhǎng)期留樣樣本理論上-80°C保存量：核酸檢測(cè)樣本量比酶免確認(rèn)實(shí)驗(yàn)大長(zhǎng)期保存：保存管密閉程度血站核酸檢測(cè)樣本的采集、運(yùn)送和保存2023/6/7

PCR實(shí)驗(yàn)室污染防治

P5007June2023PCR實(shí)驗(yàn)室污染防治PCR實(shí)驗(yàn)室的分區(qū)實(shí)驗(yàn)室人員基本要求PCR實(shí)驗(yàn)室管理核酸擴(kuò)增儀器設(shè)備的質(zhì)控2023/6/7

PCR實(shí)驗(yàn)室污染防治

P5107June2023PCR實(shí)驗(yàn)室的分區(qū) 一個(gè)基本符合要求的PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)包括3~4個(gè)區(qū)

試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)各區(qū)在物理空間上完全互相獨(dú)立，使用功能上互相分割各區(qū)之間不能有空氣直接相通各區(qū)使用的儀器設(shè)備、移液器、Tip、試管架、筆記本、記號(hào)筆、手套等包括清潔用物品都必需執(zhí)行專(zhuān)區(qū)專(zhuān)用原則。2023/6/7

PCR實(shí)驗(yàn)室的污染防治

P5207June2023理想的核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)A產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專(zhuān)用走廊工作流向擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)2023/6/7

PCR實(shí)驗(yàn)室的污染防治

P5307June2023理想的核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)B產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專(zhuān)用走廊工作流向擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)2023/6/7

PCR實(shí)驗(yàn)室的污染防