高效液相色譜柱故障排除

高效液相色譜柱故障排除第一頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二HPLC色譜柱故障排除/400-606-8099/service@楊定忠博納艾杰爾科技Email：dz_yang@

2011年12月通化第二頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二HPLC色譜柱故障排除/400-606-8099/service@楊定忠博納艾杰爾科技Email：dz_yang@

2011年12月通化第三頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二HPLC色譜柱故障排除/400-606-8099/service@楊定忠博納艾杰爾科技Email：dz_yang@

2011年12月通化第四頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二HPLC色譜柱故障排除/400-606-8099/service@楊定忠博納艾杰爾科技Email：dz_yang@

2011年12月通化第五頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二進(jìn)樣器混合器溶劑泵色譜柱檢測器廢液泵進(jìn)樣器色譜柱檢測器數(shù)據(jù)系統(tǒng)以上組件都可能出現(xiàn)問題，都需要進(jìn)行故障排除HPLC系統(tǒng)1/400-606-8099/service@第六頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二1.色譜柱柱壓

2.色譜峰峰形3.色譜峰保留值4.色譜柱柱壽命HPLC色譜柱故障

2/400-606-8099/service@第七頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二色譜柱柱壓柱壓高多少正常？同一條件：新色譜柱，C18，5μm，球形，4.6×250mm100%甲醇，1mL/min，25℃，管路內(nèi)徑0.3mm（0.010″）通常:＜7MPa3/400-606-8099/service@第八頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二

柱壓高確認(rèn)壓力升高組件其他組件原因色譜柱原因………色譜柱污染色譜柱填料堵塞篩板堵塞1.清洗色譜柱－清除色譜柱污染物和堵塞的填料－清除大分子量色譜柱吸附物－清除樣品或緩沖液沉淀2.反沖色譜柱－清洗堵塞的篩板3.更換篩板4/400-606-8099/service@色譜柱柱壓第九頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二確定壓力升高來源：保護(hù)柱-卸下保護(hù)柱儀器堵塞-卸下色譜柱？色譜柱進(jìn)口端堵塞-反方向測試（不是反沖?。。┤绻巧V柱引起的柱壓升高，問題是……5/400-606-8099/service@色譜柱柱壓第十頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二柱頭污染填料嚴(yán)重流失填料嚴(yán)重污染填料塌陷填料污染流失篩板堵塞篩板污染篩板凸起堵塞篩板顆粒狀堵塞6/400-606-8099/service@第十一頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二色譜柱柱壓沖洗色譜柱反相色譜柱（C18,C8）按照以下方式?jīng)_洗：使用己烷或二氯甲烷沖洗色譜柱，在重新使用反相流動(dòng)相以前，必須用異丙醇過渡！正相色譜柱（SiO2.Diol）以下溶劑至少各50ml沖洗色譜柱:1、水/乙腈95/5→0/1002、7/400-606-8099/service@3,如果不行，可在異丙醇里加1%TFA.原則：使用比MP更強(qiáng)的溶劑沖洗二氯甲烷>丙醇>四氫呋喃>乙醇>乙腈>甲醇>水第十二頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二色譜柱柱壓沖洗色譜柱一定正確嗎？C18柱上蛋白的沖洗：是DMSO而不是THF??！C18柱上淀粉的沖洗：是水而不是甲醇??！根據(jù)強(qiáng)保留污染物性質(zhì)，選擇合適的沖洗溶劑和程序！！8/400-606-8099/service@第十三頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二色譜柱柱壓沖洗篩板強(qiáng)溶劑、反方向、低流速－沖洗篩板不要連接檢測器－不建議用戶自行更換篩板反相色譜柱：水/乙腈95/5→0/100正相色譜柱：50%甲醇＋50%三氯甲烷→100%乙酸乙酯9/400-606-8099/service@第十四頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二色譜柱柱壓預(yù)防柱壓過高1、使用保護(hù)柱2、樣品前處理（重點(diǎn)討論樣品類型）3、經(jīng)常沖洗色譜柱4、過濾流動(dòng)相5、緩沖液或水不要保存過長時(shí)間10/400-606-8099/service@第十五頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二制劑淀粉？硅膠？其他添加劑？樣品基質(zhì)中藥強(qiáng)疏水性成分？……？如何去除？11/400-606-8099/service@第十六頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二1.色譜柱柱壓

2.色譜峰峰形3.色譜峰保留值4.色譜柱壽命HPLC色譜柱故障

12/400-606-8099/service@第十七頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二色譜峰拖尾色譜峰分裂色譜峰擴(kuò)展色譜峰峰形13/400-606-8099/service@1，許多色譜峰峰形問題都是復(fù)合型問題，色譜峰擴(kuò)展和柱效降低2，色譜峰擴(kuò)展和拖尾或拖尾隨保留加劇第十八頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二原因色譜柱問題溶劑效應(yīng)進(jìn)樣量（過載）樣品的特性柱外效應(yīng)色譜峰峰形14/400-606-8099/service@第十九頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二色譜峰峰形色譜柱可能的問題污物在柱進(jìn)口處積聚－強(qiáng)溶劑沖洗柱子二次保留效應(yīng)－加入掃尾劑,10mM的TEA重金屬污染－使用高純硅膠基質(zhì)色譜柱15/400-606-8099/service@對(duì)于難溶解的物質(zhì)：小體積強(qiáng)溶劑溶解以后用MP稀釋掃尾劑：30mM的TEA（B性化合物），醋酸胺（A性化合物）第二十頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二色譜峰峰形二次效應(yīng)ASBC18,4.6×150mm，5μm85%25mMNaH2Na，15%ACN1mL/min,35℃10mM的TEA不加TEA16/400-606-8099/service@第二十一頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二色譜峰峰形金屬污染C18硅膠造成的堿性藥物的拖尾ab初始的硅膠基質(zhì)酸洗后的硅膠基質(zhì)流動(dòng)相：20mM三甲胺硅膠純度17/400-606-8099/service@第二十二頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二色譜峰峰形柱外效應(yīng)造成的色譜峰拖尾色譜柱：150×0.45mm,硅膠柱流動(dòng)相：Hexane-CAN(99:1,V/V)流速：2.0mL/min10μL進(jìn)樣閥與8μL檢測器流通池的商品色譜儀(b)0.5μL進(jìn)樣閥與1μL檢測器流通池的商品色譜儀柱外效應(yīng)18/400-606-8099/service@第二十三頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二解決方法：1、使用流動(dòng)相溶解樣品2、加大濃度，降低進(jìn)樣量色譜峰峰形樣品體積：30μL流動(dòng)相：18%乙腈-H2O樣品溶劑進(jìn)樣的影響溶劑效應(yīng)19分別以純乙腈和流動(dòng)相為溶劑注入咖啡因（A峰）與水揚(yáng)酸胺（B峰）樣品/400-606-8099/service@第二十四頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二色譜峰峰形色譜柱：VenusilHILIC5μm4.6×250mm流動(dòng)相：乙腈－水(80:20)柱溫：30℃檢測器：蒸發(fā)光散射檢測器樣品：葡萄糖對(duì)照品水溶液流速：1mL/min葡萄糖端基異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化—兩個(gè)峰提高溫度，或提高pH值，轉(zhuǎn)化加快—一個(gè)峰25℃80℃樣品特性20/400-606-8099/service@第二十五頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二柱外效應(yīng)對(duì)峰形/分離度的影響死體積

是指從進(jìn)樣器到檢測器的體積，這一段沒有被色譜填料所填充的部分，死體積大，會(huì)導(dǎo)致峰展寬，峰形變差等等。色譜峰峰形21/400-606-8099/service@第二十六頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二色譜峰峰形柱外效應(yīng)對(duì)峰形/分離度的影響盡量減小連接管路體積。尤其使用窄徑柱時(shí)??！22/400-606-8099/service@第二十七頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二柱外效應(yīng)主要影響N值進(jìn)樣量大主要引起柱子超載，保留時(shí)間和N值下降，一般憑經(jīng)驗(yàn)找到是保留時(shí)間和N最大的進(jìn)樣量。一般：0.46mm的色譜柱最大進(jìn)樣量為10-50ug。一般開始時(shí)大樣品量進(jìn)樣（10-50ug），然后逐漸降低進(jìn)樣量直至保留時(shí)間穩(wěn)定。第二十八頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二色譜峰峰形色譜柱污染復(fù)雜樣品基體或待測樣品量大顆粒物堵塞篩板復(fù)雜樣品基體或待測樣品量大色譜柱死體積

流動(dòng)相pH>7時(shí)，硅膠溶解(除非使用特殊色譜柱)，死體積增加。樣品溶劑效應(yīng)樣品溶劑強(qiáng)于流動(dòng)相-裂分峰和擴(kuò)展峰取決于樣品量色譜峰拖尾/擴(kuò)展/分裂23/400-606-8099/service@第二十九頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二1.色譜柱柱壓

2.色譜峰峰形3.色譜峰保留值4.色譜柱柱壽命HPLC色譜柱故障

24/400-606-8099/service@第三十頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二色譜峰保留值保留時(shí)間變化漂移（單方向增加或減?。┎▌?dòng)（無規(guī)律的變化）25/400-606-8099/service@第三十一頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二色譜峰保留值保留時(shí)間變化原因色譜柱平衡固定相變化色譜柱污染流動(dòng)相組成發(fā)生變化疏水坍塌26/400-606-8099/service@第三十二頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二保留時(shí)間變化原因色譜柱平衡流動(dòng)相變化（梯度洗脫的平衡）溫度變化流速變化更換色譜柱至少使用10-20倍柱體積流動(dòng)相平衡色譜柱27/400-606-8099/service@第三十三頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二保留時(shí)間變化原因固定相變化鍵合相流失通常保留時(shí)間變短使用耐酸色譜柱：venusilASBC18和C8系列硅膠溶解裂峰使用耐堿的色譜柱：DurashellC18，RP28/400-606-8099/service@第三十四頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二保留時(shí)間變化原因色譜柱污染清洗合適的清洗方式使用保護(hù)柱何時(shí)更換保護(hù)柱？壓力？分離效果？時(shí)間？進(jìn)樣次數(shù)？29/400-606-8099/service@第三十五頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二流動(dòng)相組成發(fā)生變化易揮發(fā)性組分揮發(fā)夏天，注意密閉容器不建議循環(huán)使用流動(dòng)相一相小于10%的在線混合正確配置流動(dòng)相（V:V）30/400-606-8099/service@保留時(shí)間變化原因第三十六頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二保留時(shí)間變化原因疏水坍塌C18色譜柱，若沒有指明，不得使用100%水作為流動(dòng)相（至少含有5%的有機(jī)相）使用親水色譜柱（若水相必須大于95%）VenusilMPC18VenusilHLPVenusilASBC18，C831/400-606-8099/service@第三十七頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二色譜峰保留值與分離度建立良好重現(xiàn)性方法選用質(zhì)量好的色譜柱選用良好的流動(dòng)相體系用流動(dòng)相充分平衡柱子（如MP中含THF，三乙基胺或四丁基銨等胺類調(diào)節(jié)劑或離子對(duì)試劑，特別是烷基上有十個(gè)以上的碳原子的情況！~）采用合適的試驗(yàn)技術(shù)，確保日間穩(wěn)定預(yù)存色譜柱32/400-606-8099/service@第三十八頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二1.色譜柱柱壓

2.色譜峰峰形3.色譜峰保留值4.色譜柱柱壽命HPLC色譜柱故障

33/400-606-8099/service@第三十九頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期二色譜柱柱壽命色譜柱的壽命應(yīng)有多長？1、操作者對(duì)色譜柱的使用和處理2、注入樣品的類型干凈樣品：進(jìn)樣至少2000次34/400-606