雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)工藝課件

27抗體藥物27.1抗體與抗原的涵義27.2抗體藥物的結(jié)構(gòu)特性27.3抗體藥物的類型27.4抗體藥物的功用27.5典型抗體藥物生產(chǎn)技術(shù)及工藝姓名：韓亞平27.1抗體與抗原的涵義抗體

(antibody)是能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有特定功能的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)，它是在抗原的刺激下，淋巴細(xì)胞增殖和分化之后分泌出來(lái)的免疫球蛋白?？贵w還可解釋為：能與相應(yīng)抗原(表位)特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。在人和動(dòng)物體內(nèi)，由于抗原或半抗原入侵刺激機(jī)體而在細(xì)胞中產(chǎn)生的免疫球蛋白。能可逆、非共價(jià)、特異地與相應(yīng)抗原結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合體。機(jī)體內(nèi)B細(xì)胞在抗原刺激下所產(chǎn)生的具特異性免疫功能的球蛋白。具有抗原結(jié)合部位，能與抗原分子上相應(yīng)表位發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白?？贵w可通過(guò)三種方式中和、除去有害物質(zhì)：（1）直接使抗原失活；（2）使免疫效應(yīng)細(xì)胞將其吞噬并加以破壞；（3）抗原表面弱化，從而易受補(bǔ)體破壞。它與免疫球蛋白的區(qū)別在于，抗體都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白不一定都具有抗體活性功能?？贵w與不同的抗原結(jié)合往往出現(xiàn)不同的反應(yīng)，因而常給抗體以不同的名稱，如凝集素、沉淀素、抗毒素、溶血素、溶菌素等?？贵w的組成抗體的組成極為復(fù)雜，是由成千上萬(wàn)、多種多樣的免疫球蛋白(Ig)分子所組成。這些Ig分子在形狀、大小、結(jié)構(gòu)以及氨基酸的組成和排列上，既相似，又有差別。由于有差別，它們的電泳活性就有很大的變化。因?yàn)榭贵w具有與抗原決定簇相對(duì)應(yīng)的結(jié)合部位（抗原結(jié)合簇），所以抗體與抗原的結(jié)合具有特異性。另一方面，抗體本身是一種蛋白質(zhì)，具有本身的氨基酸組成、排列和立體結(jié)構(gòu)，對(duì)異種動(dòng)物來(lái)說(shuō)，它又是抗原。Ig抗原的特異性各類Ig都具有可用血清學(xué)方法檢出的抗原特異性，它們表現(xiàn)出不同的血清學(xué)類型。Ig抗原的特異性有3種:①同種型特異性：同一種屬所有個(gè)體共同具有的抗原特異性。人的Ig可分為5大類(IgM、IgG、IgA、IgD、IgE)、兩個(gè)型(λ型和κ型)、以及若干亞類、亞型、群和亞群等。但是，抗體和抗原結(jié)合的特異性與抗體的類、亞類、型別等無(wú)關(guān)；②同種異型特異性：同一種屬（如人）的某些個(gè)體共有的抗原決定簇。這是由遺傳基因決定的，某些重鏈和輕鏈(κ)的恒定區(qū)內(nèi)，有個(gè)別氨基酸發(fā)生置換而形成Gm、Am、Km各型；③獨(dú)特型特異性:由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的Ig分子獨(dú)有的抗原性。此決定簇在重鏈和輕鏈的可變區(qū)，特別是在可變區(qū)的超變區(qū)中。由于每一個(gè)體抗體形成細(xì)胞是由多克隆組成，所以獨(dú)特型特異性為數(shù)極多。

任何一個(gè)正常人血清中的抗體都是含有成千上萬(wàn)的、多種多樣的、具有各種獨(dú)特型抗原性的免疫球蛋白分子混合物。κ鏈和λ鏈可以和各類、各亞類配合。重鏈、輕鏈本身又有各種異型，每一克隆產(chǎn)生的Ig又具有自身的獨(dú)特型。抗體的多樣性受B細(xì)胞系統(tǒng)的遺傳基因控制。肽鏈?zhǔn)怯蓛蓚€(gè)不同基因分別編碼可變區(qū)或恒定區(qū)，恒定區(qū)的基因（C基因）是有限的,它雖然可以決定Ig分子的類別和亞類，為造成Ig分子多樣性的原因之一，但是，造成免疫球蛋白分子多樣性的主要原因卻在于可變區(qū)的異質(zhì)性，可變區(qū)是由V基因編碼的，而V基因的數(shù)目仍不清楚。抗原（antigen）是能與抗體結(jié)合的物質(zhì)，可分為蛋白抗原和非蛋白抗原。對(duì)于蛋白抗原，在缺乏T淋巴細(xì)胞時(shí)，不能引起抗體產(chǎn)生反應(yīng)，稱為T細(xì)胞依賴性抗原。非蛋白抗原在無(wú)T細(xì)胞時(shí)，也能產(chǎn)生抗體，如多糖、脂類及核酸等，也稱為非T細(xì)胞依賴性抗原。蛋白抗原與B淋巴細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，通過(guò)內(nèi)化加工，形成小肽與MHCⅡ類分子形成復(fù)合物，向T細(xì)胞提呈，T細(xì)胞通過(guò)膜相關(guān)的分子接觸識(shí)別及分泌多種淋巴因子，刺激B細(xì)胞增殖和分化，并分泌抗體。B淋巴細(xì)胞來(lái)源于骨髓干細(xì)胞，并在骨髓中成熟，是抗體的生成細(xì)胞。在前B淋巴細(xì)胞階段，胞漿中合成μ鏈，在非成熟B淋巴細(xì)胞階段合成κ和λ輕鏈，與μ鏈組裝形成IgM，表達(dá)于細(xì)胞表面，形成特異的抗原受體，并與Igα和Igβ形成復(fù)合物。在成熟B淋巴細(xì)胞階段，表達(dá)IgM和IgD，μ鏈和δ鏈具有相同V區(qū)。成熟B淋巴細(xì)胞離開骨髓，進(jìn)入血液循環(huán)和周圍淋巴組織?？乖?jīng)血或淋巴進(jìn)入周圍淋巴組織，與成熟的B淋巴細(xì)胞相遇，B淋巴細(xì)胞表達(dá)lgM和IgD，可作為特異抗原的受體。抗原和膜型IgM和IgD結(jié)合，立即啟動(dòng)B淋巴細(xì)胞的活化，使其增殖并分化成為具有典型形態(tài)特征的細(xì)胞即漿細(xì)胞，分泌型Ig增多，膜型Ig減少，最終分泌抗體。每一個(gè)B淋巴細(xì)胞僅表達(dá)對(duì)其某一個(gè)抗原決定簇專一的Ig具有等位基因排斥和輕鏈同種型排斥性?？乖肿又信c抗體結(jié)合的部位為抗原決定簇(determinant)或表位(epitope)，蛋白性抗原有多個(gè)決定簇，互不相同，為非多價(jià)抗原。而多糖、核酸具有多個(gè)相同決定簇，為多價(jià)抗原。蛋白性抗原的決定簇可分為線性決定簇和構(gòu)象決定簇兩種，線性決定簇由相鄰的氨基酸殘基構(gòu)成，一般包括6個(gè)氨基酸殘基。而構(gòu)象決定簇由空間相互靠近的氨基酸殘基組成?？乖c抗體的反應(yīng)抗原與抗體可發(fā)生高度專一性的反應(yīng)?？乖c抗體的反應(yīng)是抗體的V區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)形成的三維構(gòu)象與抗原高級(jí)結(jié)構(gòu)表面的決定簇之間的反應(yīng)，為非共價(jià)鍵結(jié)合，包括靜電引力、氫鍵、范德華力、疏水作用力等?？乖贵w反應(yīng)具有高度特異性，但也可能與多種抗原發(fā)生交叉反應(yīng)?？乖cB細(xì)胞膜Ig受體結(jié)合后，可促使抗體V區(qū)發(fā)生突變，通過(guò)選擇增加親和力，即親和力成熟。抗體由膜型轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谛蜁r(shí)，C區(qū)發(fā)生類別轉(zhuǎn)換，便于抗體行使功能。血清免疫球蛋白具有高度異質(zhì)性和抗體的多樣性(diversity)?？乖c抗體的反應(yīng)抗原與抗體的反應(yīng)每種B淋巴細(xì)胞只能按其固有的遺傳信息接受一種抗原決定簇或表位的刺激，大量增殖形成一個(gè)具有相同遺傳特性的克隆細(xì)胞群，產(chǎn)生一種化學(xué)結(jié)構(gòu)完全相同，在結(jié)構(gòu)上與抗原決定簇互補(bǔ)的特異抗體——即單克隆抗體。因此，進(jìn)入機(jī)體的每一種抗原能被針對(duì)其不同抗原決定簇的各種抗體所識(shí)別，而每一種抗原決定簇又可由1000～8000種不同的抗體所識(shí)別。這就使免疫動(dòng)物出現(xiàn)極不均一的多樣性的抗體。不同種系動(dòng)物產(chǎn)生抗體混合物不同，不同個(gè)體對(duì)同一抗原決定簇的反應(yīng)也不同，甚至在不同時(shí)間的反應(yīng)也不盡相同。用抗原免疫動(dòng)物后獲得的常規(guī)血清，實(shí)際上是由多種多樣的單克隆抗體混合而成的多克隆抗體。27.2抗體藥物的結(jié)構(gòu)特性抗體藥物分子具有功能和結(jié)構(gòu)的雙重性，為了識(shí)別不同抗原，需要數(shù)量巨大的結(jié)構(gòu)多樣性；但在發(fā)揮體內(nèi)效應(yīng)時(shí)，需要結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。雖然抗體分子是體內(nèi)最復(fù)雜的分子，但具有相似的基本結(jié)構(gòu)，其單體是由2條相同的重鏈（heavychain，H鏈）和2條相同的輕鏈(lightchain，L鏈）組成的四聚體（圖27-1）。圖27-1抗體的通用分子結(jié)構(gòu)及其片段特性每條鏈分為兩個(gè)區(qū)，可變區(qū)（variableregion，V區(qū)）和恒定區(qū)(constantregion，C區(qū)）。V區(qū)從多肽的N端起，包括輕鏈的1/2和重鏈的1/4，其氨基酸的序列變化較大，隨抗體的特異性不同而不同。其中高可變區(qū)（hypervariableregion,HV區(qū)）或互補(bǔ)決定區(qū)(complementarydeterminingregion，CDR)是抗原特異結(jié)合部位。C區(qū)從多肽的C端起，包括輕鏈的1/2和重鏈的3/4，同類抗體這部分氨基酸序列變化不大。重鏈約由450個(gè)氨基酸殘基(lgG、IgA、IgD)或570個(gè)氨基酸殘基(lgM、IgE)組成，分子量50~75kd，重鏈糖基化。輕鏈由214個(gè)氨基酸殘基組成，分子量25kd，輕鏈無(wú)糖基化。抗體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，輕重鏈之間和重鏈之間以二硫鍵連接，形成“Y”字形結(jié)構(gòu)。有些抗體由多個(gè)單體連接起來(lái)形成多聚體，如IgM為5聚體，IgA為2聚體。根據(jù)V區(qū)抗原性的不同，重鏈分為γ、α、μ、δ、ε五種，對(duì)應(yīng)的抗體是IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，它們的理化和免疫特性互不相同（表27-1）。輕鏈有兩類κ和λ。表27-1人的各種免疫球蛋白的特性特征IgGIgMIgAIgEIgD重鏈及亞類γ1γ2γ3γ4Mα1α2εδ多聚體無(wú)5聚體2或多聚體無(wú)無(wú)其它成分無(wú)JJ,分泌小體無(wú)無(wú)重鏈恒定區(qū)數(shù)目34343鉸鏈區(qū)有無(wú)有無(wú)有糖含量%3107139血清中的含量/(mg/mL)8~160.7~1.81.6~2.60.00030.04半衰期/d235.15.833分子量/103150（195）5（160）n19018027.3抗體藥物的類型根據(jù)抗體的生產(chǎn)技術(shù)，可把抗體藥物分為以下類型。（1）多克隆抗體第一代抗體為多克隆抗體(polyclonalantibody)，也稱為常規(guī)抗體(conventionalantibody)，是天然抗原經(jīng)各種途徑免疫動(dòng)物，抽取免疫血清，分離提取制備的抗體，是多種抗體的混合物。1890年Behring和北里柴三郎等發(fā)現(xiàn)了白喉抗毒素(DiphtheriaAntitoxin)，并建立了血清治療法，開始了第一代抗體藥物，如破傷風(fēng)抗毒素血清，仍然在使用。由于多克隆抗體的不均一，在使用中經(jīng)常發(fā)生非特異性交叉反應(yīng)而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，臨床應(yīng)用受到限制。目前，仍然有很多分子生物學(xué)和生物化學(xué)免疫檢測(cè)試劑是多克隆抗體。（2）單克隆抗體第二代抗體為單克隆抗體(monoclonalantibody，McAb)，是由識(shí)別一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的均一抗體。1975年Kohler和Milstein把來(lái)自脾臟能產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，進(jìn)行原生質(zhì)體融合，得到雜交瘤細(xì)胞，通過(guò)離體培養(yǎng)就能產(chǎn)生單一抗體。與多克隆抗體相比，單克隆抗體具有特異性高、親和力強(qiáng)、效價(jià)高、血清交叉反應(yīng)少的優(yōu)點(diǎn)，而且來(lái)源穩(wěn)定，可大量生產(chǎn)，應(yīng)用于臨床的抗腫瘤、抗感染、解毒、抗器官移植排斥反應(yīng)等。第二代抗體主要形式有兩種，全抗體和酶解片段抗體。如木瓜蛋白酶水解片段、胃蛋白酶水解片段等。木瓜蛋白酶在鉸鏈區(qū)(hingeregion)水解全抗體，產(chǎn)生2個(gè)Fab(fragmentwithantigenbinding，為抗體的兩臂）和1個(gè)Fc(fragmentofcristallization)，胃蛋白酶水解全抗體產(chǎn)生F(ab)2。20世紀(jì)70年代建立了雜交瘤(hybridoma)生產(chǎn)單克隆抗體技術(shù)。B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞來(lái)源于鼠，一般也用鼠生產(chǎn)，所以稱為鼠源單克隆抗體。大量的分子生物學(xué)和生物化學(xué)免疫檢測(cè)試劑是單克隆抗體。其缺點(diǎn)是有鼠源性，對(duì)人體有較強(qiáng)的免疫原性(immunogenicity)；半衰期短，靶向吸收差，全抗體分子量大，很難通過(guò)血管進(jìn)入細(xì)胞，特別是腫瘤等部位含量低。（3）人鼠嵌合抗體人鼠嵌合抗體以及下面幾種抗體都是屬于第三代的基因工程抗體，它們是用基因工程方法對(duì)鼠源全抗體的基因進(jìn)行重組、缺失、修飾改型等，構(gòu)建載體，在原核微生物、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，獲得的抗體。包括鼠源抗體的人源化(humanozedantibody)、人鼠嵌合抗體(chimericantibody)、改型抗體(reshapingantibody)、完全人源抗體和小分子抗體（minimalantibody)等。在20世紀(jì)80年代中期開始了基因工程人源化抗體的研究，產(chǎn)生了在基因水平對(duì)抗體結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造的學(xué)科即抗體工程。20世紀(jì)90年代開始用抗體庫(kù)技術(shù)、核糖體展示庫(kù)技術(shù)篩選小分子抗體，并用原核細(xì)胞表達(dá)抗體。抗體與其它蛋白融合，可形成多種具有生物活性的融合抗體。人鼠嵌合抗體(chimericantibody)是由鼠抗體的可變區(qū)和人抗體的穩(wěn)定區(qū)組成的抗體。主要是針對(duì)鼠源性而進(jìn)行的基因改造，降低免疫原性，保持或提高親和力和特異性是改造抗體的兩個(gè)基本原則。由于恒定區(qū)與抗原結(jié)合無(wú)關(guān)，但又是抗體免疫性的主要部位，所以用人恒定區(qū)取代鼠恒定區(qū)進(jìn)行人源化，消除大部分異源，保留鼠源的抗原結(jié)合的特異性和親和力。人鼠嵌合抗體是最早研究出來(lái)的，已批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床治療。實(shí)現(xiàn)人鼠嵌合抗體的過(guò)程是可變區(qū)基因的克隆、表達(dá)載體的構(gòu)建、嵌合抗體的表達(dá)。單元操作要點(diǎn)如下：①可變區(qū)基因的克隆。可采用RT-PCR，用雜交瘤細(xì)胞mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄克隆得到可變區(qū)基因。也可以從基因組文庫(kù)中克隆。引物設(shè)計(jì)是克隆的關(guān)鍵，用第一骨架區(qū)序列或前導(dǎo)序列作為5’端引物，以J或恒定區(qū)序列的互補(bǔ)序列為3’端引物，根據(jù)保守序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。②表達(dá)載體的構(gòu)建。選擇高效載體，將輕鏈和重鏈分別構(gòu)建成相應(yīng)的表達(dá)盒，連接到同一個(gè)載體中(圖27-2)。圖27-2嵌合抗體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體③嵌合抗體的表達(dá)。將人鼠嵌合抗體的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系如CHO和骨髓瘤細(xì)胞SP2/0中，按照動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝進(jìn)行生產(chǎn)制備嵌合抗體。

人鼠嵌合抗體仍保留30%左右的鼠源序列，并沒(méi)有完全消除免疫原性的發(fā)生并具有全抗體的缺點(diǎn)。（4）改型抗體改型抗體(reshapingantibody)是把鼠單克隆抗體的CDR移植到人單克隆抗體的骨架區(qū)，使人單克隆抗體獲得同鼠單抗一樣的抗原特異性，因此也稱為CDR移植抗體(CDRgraftingantibody)。可變區(qū)序列的CDR設(shè)計(jì)與克隆是改型抗體的關(guān)鍵，合理保留CDR兩側(cè)的骨架區(qū)序列，可將N端數(shù)個(gè)氨基酸與CDR一起移植。根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)和計(jì)算機(jī)輔助分析，合理設(shè)計(jì)基于同源性分析和分子結(jié)構(gòu)模型。改型抗體構(gòu)建的基本思路和流程如下：

①可變區(qū)序列的分析。比較鼠與人單克隆抗體的可變區(qū)基因序列，包括CDR和骨架區(qū)(frameregion，F(xiàn)R)的位置，可變區(qū)亞類、亞型的序列，VL/VH界面殘基，F(xiàn)R的特殊殘基，確定保守性殘基和同源性最高的殘基，設(shè)計(jì)改型人可變區(qū)基因。②抗體基因序列的克隆。將鼠CDR與人FR連接組合起來(lái)，對(duì)重要的不同殘基仔細(xì)分析認(rèn)定，確定適合人輕鏈和重鏈可變區(qū)改型殘基序列。根據(jù)中心法則，將氨基酸序列轉(zhuǎn)換為核酸序列，以最接近的CDR序列為模板，采用重疊PCR突變擴(kuò)增，獲得整個(gè)基因序列。③構(gòu)建人可變區(qū)和恒定區(qū)基因表達(dá)載體，進(jìn)行生產(chǎn)。將基因構(gòu)建在載體上，轉(zhuǎn)染后，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)，分離純化，得到人改型抗體。人改型抗體比嵌合抗體構(gòu)建難度更大，已有批準(zhǔn)上市的治療性人改型抗體。但這種抗體仍然不能避免獨(dú)特型抗體和抗Fc同種特異型抗體產(chǎn)生的可能性。（5）人源抗體人—人雜交瘤融合率低、不穩(wěn)定，用傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)制備高親和力的穩(wěn)定的人抗體克隆十分困難。但可以用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)、基因敲除技術(shù)、置換技術(shù)、制備完整全人源抗體片段及全抗體。（6）小分子抗體小分子抗體是分子量較小的具有抗原結(jié)合功能的抗體片段。根據(jù)抗體的各個(gè)結(jié)構(gòu)域功能進(jìn)行構(gòu)建，可分為Fab抗體、單鏈抗體、單域抗體和超變區(qū)抗體。小分子抗體具有以下優(yōu)點(diǎn)：可以在大腸桿菌等細(xì)胞中表達(dá)，生產(chǎn)成本低；容易穿透血管壁或組織屏障，進(jìn)入病灶部位，有利于治療腫瘤等；不含有Fc片段，不與Fc受體結(jié)合；有利于進(jìn)一步進(jìn)行基因工程改造。小分子抗體的構(gòu)建可采用常規(guī)基因工程的方法和程序，從雜交瘤細(xì)胞中分離RNA，純化mRNA、RT-PCR，克隆相應(yīng)片段的基因，連接并構(gòu)建在載體上，在宿主細(xì)胞中表達(dá)。不同抗體分子的特性見表27-2。表27-2不同抗體分子的特性抗體分子分子量/103體內(nèi)清除率腫瘤穿透能力腫瘤攝取率IgG155++++++F(ab)2100+++++++diaboby50++++++++ScFv25+++++++++1）Fab抗體

Fab由重鏈Fd（可變區(qū)VH和CH1）和完整輕鏈（VL和CL）組成，通過(guò)二硫鍵連接形成異二聚體，其大小只有完整全抗體分子的1/3，僅有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。Fab的制備有多條途徑。第一條途徑是用木瓜蛋白酶水解全抗體后，分離純化制備Fab。第二條途徑是基因工程大腸桿菌表達(dá)。Fab抗體可在信號(hào)肽的引導(dǎo)下分泌進(jìn)入細(xì)菌的周質(zhì)，前導(dǎo)肽被蛋白酶切除，生成有功能的Fab抗體。第三條途徑是對(duì)Fab進(jìn)行改造，制備重組Fab抗體。其恒定區(qū)為人源性，H鏈的V區(qū)和CH1功能區(qū)的cDNA與L鏈完整的cDNA重組，表達(dá)產(chǎn)物為重組Fab抗體。

2）Fv與ScFv抗體

Fv是抗體分子中保留抗原結(jié)合部位的最小功能抗體片段，由輕鏈可變區(qū)重鏈可變區(qū)組成，以非共價(jià)鍵結(jié)合。可用前導(dǎo)肽引導(dǎo)在基因工程細(xì)菌中表達(dá)Fv的兩個(gè)片段分泌進(jìn)入周質(zhì)，組裝成Fv。由于是非共價(jià)鍵結(jié)合，不穩(wěn)定，所以應(yīng)用最多的是單鏈抗體。

單鏈抗體(singlechainFv，ScFv)是H鏈V區(qū)cDNA3’端與L鏈V區(qū)cDNA5’端，用寡核苷酸接頭連接，構(gòu)成單鏈可變區(qū)基因片段，表達(dá)出具有抗原結(jié)合能力的抗體，其大小只有全抗體的1/6。Hv和Lv的取向(Hv-Lv，Lv-Hv)不影響抗體的功能，但接頭設(shè)計(jì)很重要，長(zhǎng)度不短于3.5nm，至少10個(gè)氨基酸殘基，具有親水性，容易折疊，側(cè)鏈不宜太多，以減少抗原性。接頭大多含有14～15個(gè)氨基酸殘基，但25個(gè)氨基酸殘基也有活性。最廣泛使用的接頭是重復(fù)4個(gè)甘氨酸和一個(gè)絲氨酸(GGGGS)3。甘氨酸側(cè)鏈最短，絲氨酸親水性最強(qiáng)。ScFv可在大腸桿菌、酵母、植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)，最常用大腸桿菌。

ScFv在37℃時(shí)穩(wěn)定性較差，可在雙鏈之間增加1個(gè)二硫鍵，提高穩(wěn)定性，這就是dsFv(disulfide-stabilizedFv)。引入二硫鍵的位置是此抗體構(gòu)建的關(guān)鍵，在CDR引入二硫鍵要嚴(yán)密設(shè)計(jì)，在遠(yuǎn)離CDR的骨架區(qū)設(shè)計(jì)具有通用性，如H44/L100或H105/L43引入半胱氨酸。3）單域抗體

單域抗體(singledomainantibody)只含有VH或VL一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，大小只有全抗體的1/12，也叫小抗體(minibody)。生產(chǎn)制備相對(duì)簡(jiǎn)單，在大腸桿菌中能表達(dá)出活性。超可變區(qū)多肽（hypervariableregionpeptide）或最小識(shí)別單位（minimalrecognitionunit），只含有一個(gè)CDR的多肽，特別是H鏈CDR3，只有16～30個(gè)氨基酸殘基，穿透能力強(qiáng)，具有結(jié)合抗原的能力，但不完全和不穩(wěn)定，非特異性吸附明顯增加。4）雙分子抗體

將兩個(gè)不同特征的單鏈抗體分子的VH和VL交叉組合，構(gòu)建兩個(gè)雜合的單鏈抗體，重組在一個(gè)表達(dá)載體中，則可在大腸桿菌中表達(dá)出雙特異性雙鏈抗體(diabody)，如F(ab')2。為了增加穩(wěn)定性，在抗體的C端設(shè)計(jì)半胱氨酸，形成鏈間二硫鍵。縮短接頭（1~5個(gè)氨基酸），還可形成三鏈(triabody)、四鏈抗體(tetrabody)?？贵w的C端連接自聚化結(jié)構(gòu)域，使抗體片段多聚化。常用的自聚化結(jié)構(gòu)域有亮氨酸拉鏈、α螺旋束、CH3、鏈親和素等，在抗體與自聚化結(jié)構(gòu)域之間設(shè)計(jì)一個(gè)柔性接頭，如GGGGS或IgG3的鉸鏈區(qū)，自聚化尾部接半胱氨酸，增加穩(wěn)定性。（7）融合抗體融合抗體是抗體與其它蛋白融合表達(dá)的產(chǎn)物，結(jié)合了抗體和其它蛋白的雙重功能，形成新的生物活性。利用抗體的同源性識(shí)別功能將靶蛋白引導(dǎo)至特定部位，起靶向治療作用。

1）免疫毒素

免疫毒素（immunotoxin）是抗體與毒性蛋白融合，定向殺傷腫瘤。所用抗體部分為ScFv、dsFv、Fab、diabody等，毒性蛋白有銅綠假單胞菌外毒素、白喉毒素、蓖麻毒素等。免疫毒素只能用大腸桿菌制備，不能在真核細(xì)胞中表達(dá)。抗體片段與細(xì)胞因子融合構(gòu)成免疫細(xì)胞因子(immunocytocine)，也是靶向治療的手段，所用細(xì)胞因子包括IL-2、TNF、IFN、IL-12等。抗體與特異靶向分子融合構(gòu)成免疫橋連，可結(jié)合不同細(xì)胞。如抗CD3的抗體與EGF的融合蛋白，可把表達(dá)CD3的T細(xì)胞與有EGF受體的腫瘤細(xì)胞連接起來(lái)，介導(dǎo)T細(xì)胞殺傷效應(yīng)。

2）抗體酶

抗體能與抗原特異結(jié)合，但不具催化活性；酶與底物的結(jié)合也具有特異性，但不具抗體活性。利用基因工程技術(shù)，可以設(shè)計(jì)制備出既具催化活性又具抗體功能的蛋白質(zhì)分子，即催化抗體(catalyticantibody)或抗體酶(abzyme)。其構(gòu)建是把與金屬離子結(jié)合的氨基酸序列插入L鏈的V區(qū)，再與H鏈V區(qū)重組。H鏈V區(qū)識(shí)別抗原并選擇性結(jié)合底物，L鏈V區(qū)促進(jìn)底物過(guò)渡態(tài)的形成，發(fā)揮催化反應(yīng)的功能。這樣重組抗體的高效催化性和位點(diǎn)結(jié)合的特異性為疾病治療提供了新途徑?？贵w—酶偶聯(lián)物(antibodyenzymeconjugate)多采用化學(xué)交聯(lián)方法制備，由此衍生出了抗體靶向的酶前藥治療，很多藥物可用于此系統(tǒng)，如包括抗生素、生物堿等，成功的例子有抗Her2的Fv與內(nèi)酰胺酶融合蛋白，可水解前藥頭孢菌素。抗體藥物還常按下列項(xiàng)目進(jìn)行分類：(1)按作用對(duì)象，可將其分為抗毒素、抗菌抗體、抗病毒抗體和親細(xì)胞抗體(能與細(xì)胞結(jié)合的免疫球蛋白，如1型變態(tài)反應(yīng)中的lgE反應(yīng)素抗體，能吸附在靶細(xì)胞膜上)。(2)按理化性質(zhì)和生物學(xué)功能，可將其分為IgG、IgA、IgM、IgE、IgD五類。IgM抗體：是免疫應(yīng)答中首先分泌的抗體。它們?cè)谂c抗原結(jié)合后啟動(dòng)補(bǔ)體的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。它們還把入侵者相互連接起來(lái)，聚成一堆便于巨噬細(xì)胞的吞噬；IgG抗體：激活補(bǔ)體，中和多種毒素。IgG持續(xù)的時(shí)間長(zhǎng)，是唯一能在母親妊娠期穿過(guò)胎盤保護(hù)胎兒的抗體。他們還從乳腺分泌進(jìn)入初乳，使新生兒得到保護(hù)；IgA抗體：進(jìn)入身體的黏膜表面，包括呼吸、消化、生殖等管道的黏膜，中和感染因子。還可以通過(guò)母乳的初乳把這種抗體輸送到新生兒的消化道黏膜中，是在母乳中含量最多，最為重要的一類抗體；IgE抗體：的尾部與嗜堿細(xì)胞、肥大細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)合。當(dāng)抗體與抗原結(jié)合后，嗜堿細(xì)胞與肥大細(xì)胞釋放組織胺一類物質(zhì)促發(fā)炎癥的發(fā)展。這也是引發(fā)速發(fā)型過(guò)敏發(fā)應(yīng)的抗體；IgD抗體的作用還不太清楚。它們主要出現(xiàn)在成熟的B淋巴細(xì)胞表面上，可能與B細(xì)胞的分化有關(guān)。(IgD于1995年從人骨髓瘤蛋白中發(fā)現(xiàn)，分子量為175kD，主要由扁桃體、脾等處漿細(xì)胞產(chǎn)生，人血清中IgD濃度為3～40μg/ml,不到血清總Ig的1%，在個(gè)體發(fā)育中合成較晚。IgD鉸鏈區(qū)很長(zhǎng)，且對(duì)蛋白酶水解敏感，因此IgD半衰期很短，僅2.8天。血清中IgD確切的免疫功能尚不清楚。在B細(xì)胞分化到成熟B細(xì)胞階段，除了表達(dá)SmIgD，抗原刺激后表現(xiàn)為免疫耐受。成熟B細(xì)胞活化后或者活化后或者變成記憶B細(xì)胞時(shí)，SmIgD逐漸消失。)(3)按與抗原結(jié)合后是否出現(xiàn)可見反應(yīng)，可將其分為：在介質(zhì)參與下出現(xiàn)可見結(jié)合反應(yīng)的完全抗體，即通常所說(shuō)的抗體，以及不出現(xiàn)可見反應(yīng)，但能阻抑抗原與其相應(yīng)的完全抗體結(jié)合的不完全抗體。(4)按抗體的來(lái)源，可將其分為天然抗體和免疫抗體。(5)根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的各種表現(xiàn)形式將抗體分為：①沉淀素指與抗原結(jié)合后可發(fā)生沉淀反應(yīng)的抗體；②凝集素是指與顆粒性抗原結(jié)合出現(xiàn)凝集的抗體；③溶解素為與細(xì)胞膜上抗原結(jié)合后，在補(bǔ)體的參與下可使細(xì)胞出現(xiàn)溶解的抗體，如溶菌素，溶血素等；④補(bǔ)體結(jié)合抗體指與抗原結(jié)合后可激活補(bǔ)體的抗體；⑤調(diào)理素指具有調(diào)理作用,與微生物結(jié)合后能促進(jìn)吞噬細(xì)胞吞噬作用的抗體；⑥中和抗體為與病毒結(jié)合后,可使病毒失去感染性的抗體。27.4抗體藥物的功用最初有人用電泳證明血清中抗體活性在γ球蛋白部分，故曾把抗體統(tǒng)稱為丙種(γ)球蛋白。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，抗體并不都在γ區(qū)；并且位于γ區(qū)的球蛋白，也不一定都具有抗體活性。1964年，世界衛(wèi)生組織舉行專門會(huì)議，將具有抗體活性以及與抗體相關(guān)的球蛋白統(tǒng)稱為免疫球蛋白(Ig)，如骨髓瘤蛋白，巨球蛋白血癥、冷球蛋白血癥等患者血清中存在的異常免疫球蛋白以及正常人天然存在的免疫球蛋白亞單位等。因而免疫球蛋白是結(jié)構(gòu)化學(xué)的概念，而抗體是生物學(xué)功能的概念?？梢哉f(shuō)，幾乎所有抗體都是免疫球蛋白（極少數(shù)抗體為RNA），但并非所有免疫球蛋白都是抗體?？贵w的主要功能是與抗原(包括外來(lái)的和自身的)相結(jié)合，從而有效地清除侵入機(jī)體內(nèi)的微生物、寄生蟲等異物，中和它們所釋放的毒素或清除某些自身抗原，使機(jī)體保持正常平衡，但有時(shí)也會(huì)對(duì)機(jī)體造成病理性損害，如抗核抗體、抗雙鏈DNA抗體、抗甲狀腺球蛋白抗體等一些自身抗體的產(chǎn)生，對(duì)人體可造成危害?？贵w作用的規(guī)律是：(1)初次反應(yīng)產(chǎn)生抗體：當(dāng)抗原第一次進(jìn)入機(jī)體時(shí)，需經(jīng)一定的潛伏期才能產(chǎn)生抗體，且抗體產(chǎn)生的量也不多，在體內(nèi)維持的時(shí)間也較短。(2)再次反應(yīng)產(chǎn)生抗體：當(dāng)相同抗原第二次進(jìn)入機(jī)體后，開始時(shí)，由于原有抗體中的一部分與再次進(jìn)入的抗原結(jié)合，可使原有抗體量略為降低。隨后，抗體效價(jià)迅速大量增加，可比初次反應(yīng)產(chǎn)生的多幾倍到幾十倍，在體內(nèi)留存的時(shí)間亦較長(zhǎng)。(3)回憶反應(yīng)產(chǎn)生抗體：由抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后可逐漸消失。此時(shí)若再次接觸抗原，可使已消失的抗體快速上升。如再次刺激機(jī)體的抗原與初次相同，則稱為特異性回憶反應(yīng)；若與初次反應(yīng)不同，則稱為非特異性回憶反應(yīng)。非特異性回憶反應(yīng)引起的抗體的上升是暫時(shí)性的，短時(shí)間內(nèi)即很快下降?？贵w藥物的生物學(xué)功能主要有：(1)特異性結(jié)合抗原：抗體本身不能直接溶解或殺傷帶有特異抗原的靶細(xì)胞，通常需要補(bǔ)體或吞噬細(xì)胞等共同發(fā)揮效應(yīng)以清除病原微生物或?qū)е虏±頁(yè)p傷。然而，抗體可通過(guò)與病毒或毒素的特異性結(jié)合，直接發(fā)揮中和病毒的作用。(2)激活補(bǔ)體：IgM、IgG1、IgG2和IgG3可通過(guò)經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體，凝聚的IgA、IgG4和IgE可通過(guò)替代途徑激活補(bǔ)體。(3)結(jié)合細(xì)胞：不同類別的免疫球蛋白，可結(jié)合不同種的細(xì)胞，產(chǎn)生不同的免疫反應(yīng)，參與免疫應(yīng)答。(4)可通過(guò)胎盤及粘膜：免疫球蛋白G(IgG)能通過(guò)胎盤進(jìn)入胎兒血流中，使胎兒形成自然被動(dòng)免疫。免疫球蛋白A(IgA)可通過(guò)消化道及呼吸道粘膜，是粘膜局部抗感染免疫的主要因素。

(5)具有抗原性：抗體分子是一種蛋白質(zhì)，也具有刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的性能。不同的免疫球蛋白分子，各具有不同的抗原性。(6)抗體對(duì)理化因子的抵抗力與一般球蛋白相同：不耐熱，60～70℃即被破壞。各種酶及能使蛋白質(zhì)凝固變性的物質(zhì)，均能破壞抗體的作用?？贵w可被中性鹽類沉淀。在生產(chǎn)上?？捎昧蛩徜@或硫酸鈉從免疫血清中沉淀出含有抗體的球蛋白，再經(jīng)透析法將其純化。(7)通過(guò)與細(xì)胞Fc受體結(jié)合發(fā)揮多種生物效應(yīng)。①調(diào)理作用IgG、IgM的Fc段與吞噬細(xì)胞表面的FcγR、FcμR結(jié)合，增強(qiáng)其吞噬能力，通常將抗體促進(jìn)吞噬細(xì)胞吞噬功能的作用稱為抗體的調(diào)理作用(opsonization)。②發(fā)揮抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。27.5典型抗體藥物生產(chǎn)技術(shù)及工藝下面以鼠源單克隆抗體的制備為例來(lái)介紹抗體藥物的生產(chǎn)技術(shù)及工藝。鼠源單克隆抗體是用動(dòng)物鼠來(lái)生產(chǎn)的，先制備鼠雜交瘤細(xì)胞系，然后在體內(nèi)或體外培養(yǎng)生產(chǎn)抗體（圖27-3）。雜交瘤細(xì)胞系的制備工藝包括免疫動(dòng)物、親本細(xì)胞的制備、細(xì)胞融合、培養(yǎng)篩選與鑒定、克隆化等過(guò)程。圖27-3單克隆抗體的制備過(guò)程免疫的B淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，它是產(chǎn)生特異性抗體的細(xì)胞，但漿細(xì)胞還不能在體外培養(yǎng)基中成功生長(zhǎng)，因而不能成為體外生產(chǎn)抗體的來(lái)源。骨髓瘤細(xì)胞(myelomacell)雖然能在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)且比正常細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖速度快，但不能產(chǎn)生抗體。將這兩種不同功能細(xì)胞進(jìn)行融合，得到雜交瘤細(xì)胞，既具有體外長(zhǎng)期迅速增殖的能力，又能持續(xù)產(chǎn)生和分泌特定單一成分的特異性抗體。（1）制備親本細(xì)胞①淋巴細(xì)胞用特異抗原，按照免疫程序，對(duì)純系健康8周齡的BALB/c小白鼠進(jìn)行免疫，分離B淋巴細(xì)胞。用RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)液洗滌脾臟后，將淋巴細(xì)胞輕輕擠壓到培養(yǎng)液中，細(xì)胞計(jì)數(shù)，置于冰箱備用。一般每只小鼠收集到108個(gè)細(xì)胞，大鼠2×108個(gè)細(xì)胞。②骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)該在完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。有遺傳標(biāo)記，喪失了嘌呤或嘧啶核苷酸合成的補(bǔ)救途徑，是核酸代謝旁路酶缺陷型，如次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型(hypoxanthineguaninephosphoribosyl

transferase，HGPRT-)或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（thymidine

kinase，KT-）。常用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系有X63Ag8·653，SP2/O-Ag14，F(xiàn)0，NSI-Ag4-1。兩類親本細(xì)胞的動(dòng)物種系要一致或近源，才能使雜交瘤在同種異體內(nèi)生長(zhǎng)。遠(yuǎn)源雜交瘤胞系不穩(wěn)定，分泌抗體能力也很差。1、雜交瘤細(xì)胞系的建立（2）原生質(zhì)體融合采用PEG1000～4000為細(xì)胞融合誘導(dǎo)劑。取生長(zhǎng)旺盛、形態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞懸液與新鮮制備的BALB/c淋巴細(xì)胞懸液，在離心管中以1：2～10的比例混合，1000r/min離心10min，棄上清。輕輕彈擊管壁，使細(xì)胞松動(dòng)，置于37℃水浴中。搖動(dòng)離心管，在1min內(nèi)逐滴加入1mL50%PEG（pH7.2-7.4），繼續(xù)搖動(dòng)1~2min。在30s內(nèi)沿管壁加入10mLDMEM或RPMI-1640培養(yǎng)液，不能沖散細(xì)胞，轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，使PEG稀釋，終止其誘導(dǎo)作用。1000r/min離心10min，棄上清。分配到加有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在HAT培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇培養(yǎng)。（3）雜交瘤篩選與克隆化在兩類細(xì)胞的融合混合物中存在五種細(xì)胞，未融合的單核親本細(xì)胞、同型融合多核細(xì)胞、異型融合的雙核和多核雜交瘤細(xì)胞。篩選的目標(biāo)是獲得異型融合的雙核雜交瘤細(xì)胞。未融合的淋巴細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程6～10d會(huì)自行死亡，異型融合的多核細(xì)胞由于其核分裂不正常，在培養(yǎng)過(guò)程中也會(huì)死亡，對(duì)雜交瘤細(xì)胞影響不大。但未融合的骨髓瘤細(xì)胞因其生長(zhǎng)快而不利于雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和分離。因此要對(duì)親本細(xì)胞、培養(yǎng)基等進(jìn)行選擇和處理，設(shè)計(jì)合理特異性的選擇系統(tǒng)，獲得目標(biāo)雜交瘤細(xì)胞系。為了除去未融合的骨髓瘤細(xì)胞，在培養(yǎng)基中加入次黃嘌呤(hypoxanthine，H)、氨基蝶呤(aminopterin，A)及胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）進(jìn)行缺陷篩選。正常細(xì)胞的DNA合成有兩條途徑，主路和旁路。主路途徑為全合成途徑，利用糖和氨基酸合成嘌呤和嘧啶，生物合成途徑需要葉酸作為氫的來(lái)源。氨基蝶呤抑制了從二氫葉酸到四氫葉酸的合成，從而阻斷主路DNA的合成。由于未融合的骨髓瘤細(xì)胞是HGPRT—或KT—，因此只有主路DNA合成途徑的未融合的骨髓瘤細(xì)胞，被氨基蝶呤阻斷后，無(wú)法合成DNA而死亡。B淋巴細(xì)胞具有旁路合成途徑，通過(guò)HGPRT酶和TK酶，即可利用HAT培養(yǎng)基中的次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷來(lái)合成DNA。雜交瘤細(xì)胞由于有B淋巴細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，HGPRT+將次黃嘌呤轉(zhuǎn)換成嘌呤，TK+將胸腺嘧啶核苷轉(zhuǎn)換成胸腺嘧啶，可以通過(guò)旁路補(bǔ)救途徑合成DNA，得以生存。在HAT培養(yǎng)基中，淋巴細(xì)胞及其自身融合體，雖有HGPRT酶，卻不能長(zhǎng)期生長(zhǎng)，一般在2周內(nèi)自然死亡。這樣，只有真正的融合的雜交瘤細(xì)胞才能正常生長(zhǎng)，被篩選分離出來(lái)。將細(xì)胞懸浮在HAT培養(yǎng)液（20%胎牛血清，10mmol/LHEPES，10μmol/L巰基乙醇，100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素，0.25μmol/L抗真菌素Fungizone，加入DMEM或RPMI-1640中制成D-15培養(yǎng)液，再加入100μmol/L次黃嘌呤，0.4mol/L氨基蝶呤，100μmol/L胸腺嘧啶核苷）中，細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL。在96孔培養(yǎng)板中，每孔加入0.1mL細(xì)胞懸浮液，或在24孔板上每孔加入1mL細(xì)胞懸浮液。如果必要，在小孔中預(yù)先加入飼養(yǎng)細(xì)胞，促進(jìn)融合細(xì)胞的生長(zhǎng)。同時(shí)設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)。加蓋并密封培養(yǎng)板邊沿后，在5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。次日檢查是否污染，如果無(wú)污染，吸出一半培養(yǎng)液，補(bǔ)充等體積的HAT培養(yǎng)液，以后隔日換液一次。兩周后改用HT培養(yǎng)液，以消耗氨基蝶呤，換液3~5次，集落直徑1~2mm后，改用D-15培養(yǎng)液，進(jìn)行保存。一般5～6d后新的融合細(xì)胞克隆出現(xiàn)，未融