基因操作常規(guī)技術(shù)詳解演示文稿

基因操作常規(guī)技術(shù)詳解演示文稿當(dāng)前第1頁\共有119頁\編于星期日\21點（優(yōu)選）基因操作常規(guī)技術(shù)當(dāng)前第2頁\共有119頁\編于星期日\21點4.1核酸的分離與檢測gDNA的分離質(zhì)粒DNARNA的分離當(dāng)前第3頁\共有119頁\編于星期日\21點細(xì)胞破碎去蛋白DNA沉淀4.1.1gDNA的提取SDS法酚抽提法CTAB法當(dāng)前第4頁\共有119頁\編于星期日\21點CTAB法高鹽:溶解低鹽:沉淀蛋白、多糖分離NaAc-70%alc當(dāng)前第5頁\共有119頁\編于星期日\21點如何保持CS-DNA的完整性?物理降解內(nèi)源DNase＞pH7當(dāng)前第6頁\共有119頁\編于星期日\21點4.1.2質(zhì)粒DNA的分離純化拓?fù)鋵W(xué)的差異gDNA大,易解旋質(zhì)粒小,ccc狀態(tài)當(dāng)前第7頁\共有119頁\編于星期日\21點proteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs1.CsCl密度梯度超離心密度梯度沉降=擴(kuò)散浮力密度差樣品+EB樣品BD=該位置上的CsCl密度位置分布:沉降速度、MW及離心時間當(dāng)前第8頁\共有119頁\編于星期日\21點SolI;II;IIIcccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA2.堿變性法pH12:變性程度pH7:復(fù)性速度離心:收集?當(dāng)前第9頁\共有119頁\編于星期日\21點3.沸水浴法加酶破壁沸水浴40s離心Eth沉淀

當(dāng)前第10頁\共有119頁\編于星期日\21點4.1.3RNA的提取原理酚-異硫氰酸胍當(dāng)前第11頁\共有119頁\編于星期日\21點防止RNA降解的措施DEPC處理RNasin專用無菌臺器皿、手套、口罩低溫操作當(dāng)前第12頁\共有119頁\編于星期日\21點4.1.4核酸質(zhì)量檢測紫外光譜法凝膠電泳法[ssDNA]=33(A260A310)

稀釋[dsDNA]=50(A260A310)

稀釋[ssRNA]=40(A260A310)

稀釋熒光分析法二苯胺顯色當(dāng)前第13頁\共有119頁\編于星期日\21點分子篩;電荷效應(yīng)UV→EB→熒光凝膠電泳技術(shù)當(dāng)前第14頁\共有119頁\編于星期日\21點當(dāng)前第15頁\共有119頁\編于星期日\21點凝膠成像系統(tǒng)當(dāng)前第16頁\共有119頁\編于星期日\21點Rf、分辨力的影響因素大小,構(gòu)型gel濃度電壓、時間buffer凝膠濃度片段大小/kb0.35600.61100.70.8201.00.581.20.40.12當(dāng)前第17頁\共有119頁\編于星期日\21點緩沖液及其pHTBE:緩沖力大?長:TAE﹥TBE?短:TAE分辨力低如何防止pH和離子強(qiáng)度改變?當(dāng)前第18頁\共有119頁\編于星期日\21點RNA的檢測A260變性膠28S→4.5kb18S→2.1kb當(dāng)前第19頁\共有119頁\編于星期日\21點PAGE尿素buffer:0.51TBE同位素或熒光標(biāo)記測序、多態(tài)性分析當(dāng)前第20頁\共有119頁\編于星期日\21點＞40kb:Rf與分子大小無關(guān)交替改變的電場,線團(tuán)→束狀脈沖場凝膠電泳改變形狀所需時間不同膠孔中摩擦力不同A-+AB-+B當(dāng)前第21頁\共有119頁\編于星期日\21點B+A-+A-B脈沖電場電泳示意圖當(dāng)前第22頁\共有119頁\編于星期日\21點當(dāng)前第23頁\共有119頁\編于星期日\21點A-+AB-+B垂直交變電場系統(tǒng)場翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)箝位勻強(qiáng)電場系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)A-+AB-+BA-+AB-+B-+當(dāng)前第24頁\共有119頁\編于星期日\21點影響分辨率的因素脈沖時間(0.1s-1000s):長脈沖,大片段電壓:場強(qiáng)↑,最大片段范圍↑電場夾角:110–120溫度:4℃

當(dāng)前第25頁\共有119頁\編于星期日\21點4.2分子雜交技術(shù)SouthernblotNorthernblotWesternblotdotblotFISH菌落原位雜交當(dāng)前第26頁\共有119頁\編于星期日\21點

探針與探針標(biāo)記寡核苷酸片段ssords足夠長度不含互補(bǔ)區(qū)當(dāng)前第27頁\共有119頁\編于星期日\21點5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

Mg2+5dNTP5pppdA(-32P-dATP)5’…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

DNaseIDNApolI1.探針的標(biāo)記當(dāng)前第28頁\共有119頁\編于星期日\21點隨機(jī)引物標(biāo)記當(dāng)前第29頁\共有119頁\編于星期日\21點5末端標(biāo)記5

HOOH3

OH5

T4-PNKMg2+

pppATP

(-32P-dATP)5pp5

3

HO3

HOOH3

當(dāng)前第30頁\共有119頁\編于星期日\21點2.

標(biāo)記物及其檢測標(biāo)記物及性質(zhì)標(biāo)記方法雜交體檢測法地高辛:DIGRPL酶標(biāo)抗體-底物顯色生物素:Bio-16-dUTPNT,TL,PCR酶標(biāo)親合素顯色熒光素:羅丹明,FITC合成法熒光顯微鏡放射性標(biāo)記非放射性當(dāng)前第31頁\共有119頁\編于星期日\21點地高辛系統(tǒng)標(biāo)記dUTP-連接臂-甾醇半抗原DIG抗體-顯色酶交聯(lián)復(fù)合物當(dāng)前第32頁\共有119頁\編于星期日\21點當(dāng)前第33頁\共有119頁\編于星期日\21點生物素標(biāo)記GCTTGAGCAGTAACCTG顯色酶Biotin

Avidin

烷烴連接臂生色底物顏色產(chǎn)物當(dāng)前第34頁\共有119頁\編于星期日\21點當(dāng)前第35頁\共有119頁\編于星期日\21點熒光素標(biāo)記GCTTGAGCAGTAACCTG熒光素Biotin

Avidin烷烴連接臂當(dāng)前第36頁\共有119頁\編于星期日\21點當(dāng)前第37頁\共有119頁\編于星期日\21點

Southern雜交質(zhì)粒鑒定、基因位置、分子診斷酶切和電泳法可以嗎?當(dāng)前第38頁\共有119頁\編于星期日\21點當(dāng)前第39頁\共有119頁\編于星期日\21點4.2.3Northern雜交樣品,電泳,探針?不宜堿變性?勿低鹽buffer洗膜?膠中無EB當(dāng)前第40頁\共有119頁\編于星期日\21點4.2.4Western雜交電泳,印跡,免疫學(xué)主要步驟SDS,blot雜交(AP或HRP)當(dāng)前第41頁\共有119頁\編于星期日\21點Semi-drytransfersystem當(dāng)前第42頁\共有119頁\編于星期日\21點當(dāng)前第43頁\共有119頁\編于星期日\21點斑點雜交當(dāng)前第44頁\共有119頁\編于星期日\21點Allele-specificoligonucleotide(ASO)dot-blothybridizationcanidentifyindividualswiththesicklecellmutation.Theschematicdot-blotattopshowstheresultofprobingwithanASOspecificforthenormal-globinallele(A-ASO).Theresultsarepositive(filledcircle)fornormalindividualsandforheterozygotesbutnegativeforsicklecellhomozygotes(dashed,unfilledcircle).Thedot-blotatthebottomshowstheresultofprobingwithanASOspecificforthesicklecell-globinallele(S-ASO),andinthiscasetheresultsarepositiveforthesicklecellhomozygotesandheterozygotesbutnegativefornormalindividuals.TheA-andS-ASOweredesignedtobe19nucleotideslonginthiscasechosenfromcodons3to9ofrespectivelythesenseAandSglobingenesequencessurroundingthesicklecellmutationsite.Thelatterisasinglenucleotidesubstitution(A→T)atcodon6inthe-globingene,resultinginaGAG(Glu)→GTG(Val)substitution(seemiddlesequences).當(dāng)前第45頁\共有119頁\編于星期日\21點制片探針制備雜交鏡檢、拍照

FISH雜交當(dāng)前第46頁\共有119頁\編于星期日\21點基因檢測新技術(shù)使膀胱癌確診提前“FISH技術(shù)在膀胱癌檢測中的臨床應(yīng)用研究”,為期2年,對4809例患者開展了臨床檢測實驗.結(jié)果:比臨床常規(guī)檢查,膀胱癌確診提前36m雜交探針和檢測試劑已實現(xiàn)國產(chǎn)化,質(zhì)量穩(wěn)定可靠,價格比進(jìn)口產(chǎn)品降低近七成當(dāng)前第47頁\共有119頁\編于星期日\21點4.2.7菌落(斑)原位雜交陽性重組子檢測菌落→?文庫菌斑→?文庫當(dāng)前第48頁\共有119頁\編于星期日\21點4.3PCR擴(kuò)增技術(shù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)動物單拷貝GSinceitsdiscoveryin1983thepolymerasechainreactionhasrevolutionizedmolecularbiology.Today,newformsofPCRandtherelatedtechniquesofcloningarefindingnewapplicationsatthecuttingedgeofbiomedicine.

當(dāng)前第49頁\共有119頁\編于星期日\21點4.3.1基本原理離體合成幾何級數(shù)平臺效應(yīng)當(dāng)前第50頁\共有119頁\編于星期日\21點4.3.2反應(yīng)體系模板引物Taq酶dNTPs緩沖液DNAormRNA模板純度數(shù)量當(dāng)前第51頁\共有119頁\編于星期日\21點引物的設(shè)計1630nt,GC含量連續(xù)互補(bǔ)堿基﹤3

3?正確配對5?可被修飾簡并引物當(dāng)前第52頁\共有119頁\編于星期日\21點耐熱的DNApolTaq酶Pfu酶?3→5校讀?高保真當(dāng)前第53頁\共有119頁\編于星期日\21點緩沖液pH、離子強(qiáng)度Mg2+↓,酶活↓Mg2+↑,非特異↑引物退火當(dāng)前第54頁\共有119頁\編于星期日\21點4.3.2基本過程變性退火延伸當(dāng)前第55頁\共有119頁\編于星期日\21點擴(kuò)增精確性的影響因素引物:1mol/LdNTPs:20~200mol/LMg+2:0.5~2.5mmol/Lhotstart當(dāng)前第56頁\共有119頁\編于星期日\21點4.3.3PCR技術(shù)的改進(jìn)nestedPCRinversePCRanchoredPCRRT-PCRinsituPCR實時定量PCR當(dāng)前第57頁\共有119頁\編于星期日\21點1.巢式PCR嵌套引物外引物內(nèi)引物當(dāng)前第58頁\共有119頁\編于星期日\21點2.

反向PCRX、Y未知序列酶R消化環(huán)化再酶切擴(kuò)增當(dāng)前第59頁\共有119頁\編于星期日\21點反向PCR的特點難選適當(dāng)?shù)南拗泼笖U(kuò)增的長度有限自身環(huán)化效率低當(dāng)前第60頁\共有119頁\編于星期日\21點3.AnchoredPCR?錨定引物A?擴(kuò)增?產(chǎn)物鑒定當(dāng)前第61頁\共有119頁\編于星期日\21點特點擴(kuò)增未知序列無需酶切及連接操作簡單特異性高當(dāng)前第62頁\共有119頁\編于星期日\21點4.RT-PCR當(dāng)前第63頁\共有119頁\編于星期日\21點5.原位PCR原位擴(kuò)增,雜交,定量?不需抽提模板?靈敏度高100?病毒檢測、腫瘤發(fā)生率當(dāng)前第64頁\共有119頁\編于星期日\21點通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時監(jiān)測,實現(xiàn)對起始模板定量分析的方法6.實時熒光定量PCR當(dāng)前第65頁\共有119頁\編于星期日\21點FRET技術(shù);熒光標(biāo)記探針擴(kuò)增、雜交、光譜、實時檢測熒光信號積累,起始模板量熒光定量PCR的原理當(dāng)前第66頁\共有119頁\編于星期日\21點起點定量與終點定量起點天然重現(xiàn)性好終點加工誤差大當(dāng)前第67頁\共有119頁\編于星期日\21點熒光擴(kuò)增曲線的三個階段背景信號階段指數(shù)擴(kuò)增平臺期當(dāng)前第68頁\共有119頁\編于星期日\21點幾個參數(shù)的確定①臨界點②循環(huán)數(shù)(Ct)③標(biāo)準(zhǔn)曲線基線→閾值→Ct值→DNA0閾值缺省:3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍當(dāng)前第69頁\共有119頁\編于星期日\21點Log濃度與循環(huán)數(shù)的關(guān)系起始數(shù)越多,Ct值越小標(biāo)準(zhǔn)曲線→樣品Ct值→初始模板量當(dāng)前第70頁\共有119頁\編于星期日\21點DNA產(chǎn)物的熒光標(biāo)記非特異性熒光標(biāo)記SYBRGreenI特異性熒光標(biāo)記TaqMan探針分子信標(biāo)當(dāng)前第71頁\共有119頁\編于星期日\21點①SYBRGreen法只有和dsDNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時,DNA雙鏈分開,無熒光當(dāng)前第72頁\共有119頁\編于星期日\21點延伸結(jié)束階段采集熒光信號與非特異的dsDNA結(jié)合發(fā)光,必須在反應(yīng)結(jié)束時做融解曲線分析當(dāng)前第73頁\共有119頁\編于星期日\21點SYBRGreen融解曲線分析當(dāng)前第74頁\共有119頁\編于星期日\21點PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化染料:太高抑制Taq酶活性;太低,熒光信號太弱,不易檢測引物:擴(kuò)增有雜帶,定量不準(zhǔn)Mg2+:1.5mM,減少非特異性產(chǎn)物T&T:由酶和引物決定當(dāng)前第75頁\共有119頁\編于星期日\21點SYBRGreen法優(yōu)缺點對模板無選擇性使用方便,無需探針靈敏;便宜非特異性結(jié)合,產(chǎn)生假陽性對引物特異性要求較高當(dāng)前第76頁\共有119頁\編于星期日\21點5-R;3熒光淬滅基團(tuán)(Q)探針完整,R發(fā)射的熒光能量被Q吸收,無熒光;R與Q分開,發(fā)熒光Taq酶:5→3外切酶活性②TaqMan法當(dāng)前第77頁\共有119頁\編于星期日\21點TaqMan水解型雜交探針原理當(dāng)一個熒光分子(供體)的熒光光譜與另一個熒光分子(受體)的激發(fā)光譜相重疊時,供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減,FRET當(dāng)前第78頁\共有119頁\編于星期日\21點熒光共振能量轉(zhuǎn)移當(dāng)前第79頁\共有119頁\編于星期日\21點擴(kuò)增1條DNA→釋放1個熒光分子→熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物同步當(dāng)前第80頁\共有119頁\編于星期日\21點TaqMan法PCR反應(yīng)的建立PP的設(shè)計:探針Tm為70℃,<30bp,5’非G;引物Tm為60℃反應(yīng)參數(shù):

95℃3,94℃15s,60℃60s,40循環(huán)PP優(yōu)化:獲得最小Ct值,最大信號/背景比值primer:

50-900nM;probe:50-250nM當(dāng)前第81頁\共有119頁\編于星期日\21點TaqMan法優(yōu)缺點對目標(biāo)序列的高特異性引物設(shè)計相對簡單重復(fù)性比較好只適合一個特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記,價格較高當(dāng)前第82頁\共有119頁\編于星期日\21點③分子信標(biāo)與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合產(chǎn)生熒光,信號的強(qiáng)弱→靶序列的多少當(dāng)前第83頁\共有119頁\編于星期日\21點發(fā)夾型熒光探針R與Q接近,產(chǎn)生FRET探針-模板配對,構(gòu)象改變R與Q分離→熒光當(dāng)前第84頁\共有119頁\編于星期日\21點熒光定量PCR的特點實時檢測特異性強(qiáng)定量精確無需跑膠當(dāng)前第85頁\共有119頁\編于星期日\21點4.4DNA測序化學(xué)降解法末端終止法當(dāng)前第86頁\共有119頁\編于星期日\21點G反應(yīng):DMS使G、A甲基化G+A:哌啶使G斷裂T+C:肼使嘧啶環(huán)斷開,哌啶除去堿基C反應(yīng):高鹽下,僅C與肼反應(yīng),C末端

1.Maxam-Gilbert化學(xué)降解法當(dāng)前第87頁\共有119頁\編于星期日\21點當(dāng)前第88頁\共有119頁\編于星期日\21點距標(biāo)記末端250nt非酶促合成測序,無需引物對合成的寡核苷酸測序蛋白質(zhì)與DNA的相互作用特點當(dāng)前第89頁\共有119頁\編于星期日\21點2.Sanger酶學(xué)法當(dāng)前第90頁\共有119頁\編于星期日\21點基本步驟模板純化測序反應(yīng)模板,引物,Pol,

dNTPs(dd)4個反應(yīng)→4組產(chǎn)物PAGE→自顯影→X光片上樣電泳放射自顯影當(dāng)前第91頁\共有119頁\編于星期日\21點當(dāng)前第92頁\共有119頁\編于星期日\21點測序與PCR的比較測序PCR引物1條1對合成線性指數(shù)底物dNTP和dddNTP產(chǎn)物系列長度片段1條帶當(dāng)前第93頁\共有119頁\編于星期日\21點CAGTtemplateprimerdATP,dNTPpolymeraseterminator3.DNA全自動測序同位素標(biāo)記熒光標(biāo)記?單色熒光?多色熒光當(dāng)前第94頁\共有119頁\編于星期日\21點時間長序列短污染大操作難放射自顯影膠圖當(dāng)前第95頁\共有119頁\編于星期日\21點當(dāng)前第96頁\共有119頁\編于星期日\21點多色熒光標(biāo)記templateprimerdNTPpolymeraseterminatorCGTA當(dāng)前第97頁\共有119頁\編于星期日\21點ABIPrism3100-Avant當(dāng)前第98頁\共有119頁\編于星期日\21點遺傳分析儀的多種應(yīng)用當(dāng)前第99頁\共有119頁\編于星期日\21點基本步驟模板的純化與定量測序反應(yīng)—PCR儀產(chǎn)物的純化與變性上樣電泳—測序儀結(jié)果分析當(dāng)前第100頁\共有119頁\編于星期日\21點AutomatedDNAsequencingwithfluorescentlylabeledddNTP.(A)Thechainterminationreactionsarecarriedoutinasingletube,witheachddNTPlabeledwithadifferentfluorophore.Intheautomatedsequencer,thebandsintheelectrophoresisgelmovepastafluorescencedetector,whichidentifieswhichddNTPispresentineachband.Theinformationispassedtotheimagingsystem.(B)Theprintoutfromanautomatedsequencer.Thesequenceisrepresentedbyaseriesofpeaks,oneforeachnucleotideposition.Inthisexample,agreenpeakisan'A',blueis'C',blackis'G',andredis'T'.當(dāng)前第101頁\共有119頁\編于星期日\21點當(dāng)前第102頁\共有119頁\編于星期日\21點4.DNA測序技術(shù)進(jìn)展當(dāng)前第103頁\共有119頁\編于星期日\21點傳統(tǒng)測序技術(shù)的缺陷及新進(jìn)展序列不可能太長費(fèi)時費(fèi)力準(zhǔn)確度不高結(jié)構(gòu)復(fù)雜序列雜交法質(zhì)譜法DNA芯片法單分子法當(dāng)前第104頁\共有119頁\編于星期日\21點當(dāng)前第105頁\共有119頁\編于星期日\21點4.5DNA的定點誘變盒式取代切除;合成;轉(zhuǎn)化olig介導(dǎo)PCR誘變當(dāng)前第106頁\共有119頁\編于星期日\21點olig片段退火合成轉(zhuǎn)化olig介導(dǎo)的誘變當(dāng)前第107頁\共有119頁\編于星期日\21點OligonucleotidemismatchmutagenesiscancreateadesiredpointmutationatauniquepredeterminedsitewithinaclonedDNAmolecule當(dāng)前第108頁\共有119頁\編于星期日\21點P

C

R

誘變當(dāng)前第109頁\共有119頁\編于星期日\21點當(dāng)前第110頁\共有119頁\編于星期日\21點4.6

DNA與蛋白質(zhì)互作分析Y2HsystemY1HsystemgelretardationassaysDNaseIfootprinting當(dāng)前第111頁\共有119頁\編于星期日\21點1.酵母雙雜交(Y2H)GAL4protein