農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗方法3

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB15670-1995農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗方法ToxicologicaltestmethodsofPesticidesforregistration1主題內(nèi)容與適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗的方法、條件的基本要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于為農(nóng)藥登記而進(jìn)行的毒理學(xué)試驗。2急性經(jīng)口毒性試驗2．1目的求出試驗農(nóng)藥對試驗動物的半數(shù)致死劑量（LD50）；通過觀察急性毒性效應(yīng)的臨床表現(xiàn)，初步估測毒作用的靶器官和可能的毒作用機理；為亞慢性、慢性和其他毒性試驗的劑量水平設(shè)計提供參考；為急性毒性分級和制定安全防護(hù)措施提供依據(jù)。2．2試驗農(nóng)藥原藥和制劑。2．3試驗動物2．3．1主要選用品系、遺傳背景明確的初年大鼠。各劑量組內(nèi)同性別動物體重差異應(yīng)小于平均體重的10%，組間同性別動物體重均值差異應(yīng)小于5%。2．3．2每一劑量組的大鼠8~10只（雌雄各半），試驗前要對動物觀察一周，確認(rèn)健康后，方可使用。2．4劑量分組2．4．1至少應(yīng)設(shè)4~5個劑量組，各劑量組之間要有適當(dāng)?shù)膭┝块g距。以便各組出現(xiàn)不同程度的毒性效應(yīng)（死亡率），求得劑量效應(yīng)曲線及LD50。2．4．2如劑量達(dá)5000mg/kg體重以上，動物仍不出現(xiàn)死亡，則不需要進(jìn)行更高劑量的試驗。2．5給藥方法及觀察時間2．5．1動物給藥前應(yīng)隔夜禁食但不禁水，稱重后，一次灌胃給藥，給藥后至少間隔2h進(jìn)食。2．5．2灌胃量大鼠按100g體重給1mL，小鼠按20g體重給0.4mL計算，灌胃可用水溶液、油溶液或懸液。2．5．3給藥后立即觀察并記錄動物的中毒表現(xiàn)，癥狀出現(xiàn)和消失的時間及死亡時間。給藥當(dāng)日應(yīng)連續(xù)觀察，其后，每日至少觀察2次，觀察期為14d。如在給藥96h后出現(xiàn)遲發(fā)性新效應(yīng)，則應(yīng)延長觀察期至3周或4周。2．6觀察指標(biāo)2．6．1中毒癥狀全面觀察中毒的發(fā)生、發(fā)展過程和規(guī)律以及中毒特點和毒作用的靶器官。觀察的系統(tǒng)包括：a．中樞神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)肌肉系統(tǒng)：體位異常、叫聲異常、不安、呆滯、痙攣、抽搐麻痹、運動失調(diào)、對外反應(yīng)過敏或遲鈍；b．植物神經(jīng)系統(tǒng)：瞳孔擴大或縮小、流涎或流淚；c．呼吸系統(tǒng)：鼻孔流液、鼻翼煽動、呼吸深緩、呼吸過速、蜂腰；d．泌尿生殖系統(tǒng)：會陰部污穢、有分泌物、陰道或乳房腫脹；e．皮膚和毛：皮膚充血、紫紺、被毛蓬松、污穢；f．眼：眼球突出、結(jié)膜充血、角膜混濁；g．消化系統(tǒng)：腹泄、厭食。2．6．2體重給藥前、死亡時各稱量一次體重，觀察期間每3d稱量一次。2．6．3一般不做病理組織學(xué)檢查和生化指標(biāo)檢驗，但對死亡動物應(yīng)做大體病理學(xué)觀察。如24h以上的存活動物，肉眼檢查有病變時應(yīng)做病理組織學(xué)檢查。2．7結(jié)果評定2．7．1用統(tǒng)計方法計算LD50值。計算方法見附錄A（補充件）。2．7．2按農(nóng)藥的急性經(jīng)口毒性分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評定（見表1）。表1急性經(jīng)口毒性分級標(biāo)準(zhǔn)級別經(jīng)口LD50,mg/kg劇毒高毒中毒低毒<5

5-50

50-500

>5003急性經(jīng)皮毒性試驗3.1目的了解農(nóng)藥對試驗動物皮膚直接接觸引起局部皮膚損傷、全身中毒的特征等毒性效應(yīng)，求出半數(shù)致死劑量（LD50），為制定農(nóng)藥生產(chǎn)和應(yīng)用中的防護(hù)措施提供依據(jù)。3．2試驗農(nóng)藥原藥和制劑。3．3試驗動物3．3．1為有足夠的涂藥面積，首選成年大鼠，體重要求200-300g。3．3．2各劑量組大鼠8~10只（雌雄各半）。3．4劑量分組3．4．1至少應(yīng)設(shè)4個劑量組，各劑量組應(yīng)有一定的間距，使給藥組能出現(xiàn)毒性表現(xiàn)和死亡。3．4．2如果2000mg/kg劑量仍不出現(xiàn)死亡時，則不需要再進(jìn)行高劑量試驗。3．5給藥方法及觀察時間3．5．1給藥前24h背部去毛，注意勿損傷皮膚，涂藥面積應(yīng)占體表面積10%，大鼠4×5cm^2，兔12×14cm^2，豚鼠7×10cm^2。3．5．2液體農(nóng)藥用原藥液，粉末農(nóng)藥用水或溶劑稀釋。3．5．3先將動物固定，在略小于剃毛面積內(nèi)進(jìn)行定量敷藥，然后覆蓋一個與脫毛面積相當(dāng)?shù)暮惺秸?，再用膠布固定。以防止動物舔食試驗藥品。3．5．4涂藥持續(xù)時間為4h。3．5．5涂藥4h后取下罩盒，用溫水洗去皮膚上的試驗農(nóng)藥，再進(jìn)行局部觀察。3．5．6觀察時間為2周。3．6觀察指標(biāo)3．6．1中毒的臨床表現(xiàn)，參照。3．6．2死亡時間及死亡率。3．7結(jié)果評定3．7．1用統(tǒng)計方法計算LD50值。計算方法見附錄A（補充件）。3．7．2按農(nóng)藥的急性經(jīng)皮毒性分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評定（見表2）。表1急性經(jīng)皮毒性分級標(biāo)準(zhǔn)級別經(jīng)皮LD50(4h),mg/kg劇毒高毒中毒低毒<20

20-200

200-2000

>20004急性吸入毒性試驗4．1目的測試可能經(jīng)呼吸道進(jìn)入機體的農(nóng)藥（尤其是揮發(fā)性強的農(nóng)藥）對呼吸道及全身的損傷及其危害程度。求出吸入接觸的半數(shù)致死濃度（LC50），為農(nóng)藥的安全評價和制定生產(chǎn)應(yīng)用中的防護(hù)措施提供依據(jù)。4．2試驗農(nóng)藥原藥和制劑。4．3試驗動物4．3．1一種以上的哺乳動物，大鼠為首選動物。4．3．2動物性別、體重和每組動物數(shù)量的要求同2.3。4．4劑量分組4．4．1至少應(yīng)設(shè)3個出現(xiàn)毒性效應(yīng)直至死亡的劑量組。4．4．2如果以濃度2000mg/m3給藥2h仍無死亡，則無需再做高濃度試驗。4．5給藥方法及觀察時間4．5．1給藥方式包括鼻、頭部接觸和全身置于染毒柜內(nèi)接觸兩種方式。4．5．2染毒柜內(nèi)應(yīng)保持恒定的空氣流量、農(nóng)藥濃度、溫度及濕度，并要求柜內(nèi)保持微負(fù)以免農(nóng)藥外漏。4．5．3吸入給藥一般為2h。4．5．4給藥后至少觀察14d。4．6觀察指標(biāo)4．6．1中毒的臨床表現(xiàn)，參照。4．6．2死亡時間及死亡率。4．7結(jié)果評定4．7．1用統(tǒng)計方法計算LC50值。計算方法見附錄A（補充件）。4．7．2按農(nóng)藥的急性吸入毒性分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評定（見表3）。表3急性吸入毒性分級標(biāo)準(zhǔn)級別LC50(2h),mg/m^3劇毒高毒中毒低毒<20

20-200

200-2000

>20005．急性皮膚刺激試驗5．1目的測定農(nóng)藥對哺乳動物皮膚是否有刺激或腐蝕作用，估計人體接觸該農(nóng)藥時可能出現(xiàn)的類似危害。5．2試驗農(nóng)藥原藥和制劑。5．3試驗動物5．3．1兔或豚鼠，首選動物為白色家兔。5．3．2至少4只皮膚完好的健康動物。5．4劑量5．4．1一次涂藥量為0.5mL或0.5g。5．4．2動物自身皮膚做為對照。5．5試驗步驟5．5．1試驗前24h將背部毛剪掉，面積約6cm^2。5．5．2涂上試驗農(nóng)藥，再用紗布蓋上，以膠布固定或采用其他封閉性蓋罩，避免試驗動物舔食。5．5．3涂敷持續(xù)時間一般為4h。時間結(jié)束時，用水或適當(dāng)?shù)娜軇┫慈埩舻霓r(nóng)藥，但注意不要操作皮膚。5．5．4根據(jù)需要做進(jìn)一步的觀察，以確定反應(yīng)的可逆性。一般觀察期不超過14d。5．6結(jié)果評定每一只動物試驗結(jié)果按表4進(jìn)行刺激反應(yīng)評分，計算出平均分值，按表5進(jìn)行強度評定。表4皮膚刺激反應(yīng)評分癥壯及程序積分A紅斑形成無紅斑勉強可見明顯紅斑中等至嚴(yán)重紅斑紫紅色斑并有焦痂形成

B水腫形成無水腫勉強可見水腫隆起輪廓清楚水腫隆起輪廓清楚水腫隆起約1mm水腫隆起超過1mm，范圍擴大0

1

2

3

4

0

1

2

3

4總分A+B表5皮膚刺激強度分級強度分值無刺激性輕度刺激性中等刺激性強刺激性0-0.4

注：pH≤2或pH≥11.5的農(nóng)藥可不進(jìn)行本試驗6眼刺激試驗6．1目的了解試驗農(nóng)藥對眼睛的刺激作用和程度，為農(nóng)藥生產(chǎn)和使用中的安全防護(hù)提供依據(jù)。6．2試驗農(nóng)藥原藥和制劑，但對具有強酸、強堿性質(zhì)的化合物（pH≤2,pH≥11.5）不需做此試驗。6．3試驗動物成年的白色家兔至少4只。試驗前24h檢查試驗家兔雙眼，有異常者不得使用。6．4劑量液體農(nóng)藥或100倍稀釋液0.1mL,粒狀農(nóng)藥不超過100mg，且應(yīng)先將顆粒磨成細(xì)粉。6．5給藥方法及觀察時間6．5．1將一側(cè)下眼瞼輕輕下拉，把試驗農(nóng)藥滴入結(jié)膜囊內(nèi)，為防止藥液外溢，立即輕輕閉合眼瞼約1min。如果用噴霧給藥法，將眼瞼分開，在眼前方10cm距離處迅速噴霧1s。6．5．2給藥后24h內(nèi)不洗眼。6．5．3對側(cè)眼為對照。6．5．4給藥后于1，24，48，72h分別檢查眼睛。如72h仍無刺激反應(yīng)時，則終止試驗。6．5．5如果出現(xiàn)角膜操作或眼睛其他部位出現(xiàn)反應(yīng)，要繼續(xù)觀察損傷的經(jīng)過及其可逆性，觀察期最長不超過21d。6．5．672h刺激反應(yīng)仍不消退時，至少另選4只家兔觀察洗眼效果。即滴入藥物后分別在4s和30s時用生理鹽水洗眼5min，觀察洗眼后的眼睛反應(yīng)情況。6．6觀察指標(biāo)除了觀察結(jié)膜、角膜、虹膜外，還應(yīng)注意其他部位的損害。6．7結(jié)果評定按表6將每只動物的角膜、虹膜和結(jié)膜的刺激反應(yīng)的分值相加，即是一只動物眼刺激反應(yīng)的總積分。每個動物的刺激反應(yīng)積分的總和除以動物數(shù)，就是該試驗農(nóng)藥對眼刺激性的最后分值。再按表7評定眼刺激程度。表6眼損傷程度評分部位及程度積分角膜A混濁（以最致密部位為準(zhǔn)）無混濁散在或彌漫性混濁，虹膜清晰可見0

1續(xù)表6部位及程度積分半透明區(qū)易分辯，虹膜模糊不清出現(xiàn)灰白半透明區(qū)，虹膜細(xì)節(jié)不清，瞳孔大小勉強看清角膜不透明，由于混濁，虹膜無法辨認(rèn)B角膜受損范圍

<1/4

1/4-1/2

1/2-3/4

3/4-12

3

4

1

2

3

4最高積分80(積分AXBX5)虹膜正常鄒折明顯加深，充血，腫脹，角膜周圍有輕度充血，瞳孔對光仍有反應(yīng)出血，肉眼可見破壞，對光無反應(yīng)（或出現(xiàn)其中之一反應(yīng)）0

1

2最高積分10（積分x5)結(jié)膜A充血狀態(tài)（系指瞼結(jié)膜、球結(jié)膜部位的血管）血管正常充血血管充血呈鮮紅色血管充血呈深紅色，血管不易分辨彌漫性充血呈紫紅色

B水腫無輕微水腫（包括瞬膜）明顯水腫，伴有部分眼瞼外翻水腫至眼瞼近半閉合

C分泌物無少量分泌物使眼瞼和睫毛潮濕或粘著分泌物使整個眼區(qū)潮濕或粘著0

1

2

3

0

1

2

3

4

0

1

2

3最高積分20[A+B+C)X2]角膜、虹膜、結(jié)膜反應(yīng)累加最高積分110(80+10+20)表7眼刺激性分級刺激強度眼刺激積分指數(shù)

(I.A.O.I)眼刺激的平均指數(shù)

(M.I.O.I)無刺激性輕度刺激性輕度至中度刺激性中度刺激性中度至重度刺激性重度刺激性0-5

5-15

15-30

30-60

60-80

80-11048h0

48h5

4d5

7d20

7d407皮膚變態(tài)反應(yīng)（致敏）試驗7．1目的測試動物在反復(fù)接觸農(nóng)藥后，機體產(chǎn)生免疫傳遞的皮膚反應(yīng)的可能性，從而確定農(nóng)藥的變態(tài)反應(yīng)性（致敏）。7．2試驗農(nóng)藥制劑。7．3試驗動物豚鼠、每組動物數(shù)10~20只。7．4劑量致敏（誘導(dǎo)）濃度允許引起皮膚輕度刺激反應(yīng)（即最高耐受濃度）。激發(fā)濃度一般低于致敏濃度，不得引起原發(fā)刺激性炎癥反應(yīng)。7．5試驗步驟7．5．1接觸致敏的發(fā)病過程包括致敏和激發(fā)兩個階段。a．致敏接觸實驗前24h將動物背部左側(cè)去毛3cm×3cm。將試驗農(nóng)藥0.1~0.2ml涂在2cm×2cm濾紙上，并將其敷貼在去毛區(qū)，用兩層紗布，一層油紙或不透水塑料膜覆蓋，再以無刺激膠布封閉固定，持續(xù)6h。第7d和第14d以同樣方法重復(fù)一次。b．激發(fā)接觸實驗前24h將動物背部右側(cè)去毛2cm×2cm。末次致敏后14~28d，將0.1~0.2mL或低于誘導(dǎo)濃度的試驗農(nóng)藥斑貼于右側(cè)去毛區(qū)，覆蓋方法同7.5.1a.持續(xù)6h，去掉斑貼及試驗農(nóng)藥后，每日觀察至第12d。如無致變，可再次激發(fā)以確定試驗農(nóng)藥能否引起過敏反應(yīng)。匠7．滋5．隔2先試驗染須設(shè)浸陽性搏或陰污性對妨照組蓬，陰維性對堵照組坐僅給城予激框發(fā)接劉觸。摟7．逃6甜結(jié)果施評定富將出難現(xiàn)皮畜膚紅現(xiàn)斑或穩(wěn)水腫啦（不棍論程灑度輕本重）尺的動寇物數(shù)予除以睛動物堵總數(shù)敞，求驕出動俱物致中敏率量，再任按表叔8進(jìn)醋行致羅敏率龜強度殿評定瞎。檔表8考致敏具率強隆度分拉級致敏率分級強度分類0-8

9-28ⅠⅡ弱致敏物輕度致敏物庭續(xù)表肢8致敏率分級強度分類29-64

65-80

81-100ⅢⅣⅤ中度致敏物強度致敏物極強度致敏物8亞急性經(jīng)口毒性試驗8．1目的通過經(jīng)口途徑在1~4周的時期內(nèi)，連續(xù)多次給予不同劑量的試驗農(nóng)藥，觀察因試驗農(nóng)藥的蓄積作用所產(chǎn)生的不良反應(yīng)，確定亞急性無作用劑量和靶器官，并為亞慢性或慢性毒性試驗的劑量設(shè)定提供依據(jù)。8．2試驗農(nóng)藥原藥。8．3試驗動物8．3．1首選大鼠。作為長期試驗的預(yù)試驗時，兩種試驗應(yīng)使用同一種屬和品系的動物。8．3．2選用大鼠的年齡一般為6~8周，體重變異應(yīng)不大于平均體重的10%。8．3．3每劑量組至少10只動物，雌雄各半。若試驗過程中需要提前剖殺一些動物檢查，或需要一個觀察毒性反應(yīng)可逆性的附加組時，則在試驗開始時要作相應(yīng)的增加。8．4劑量分組一般設(shè)三個劑量組和一個對照組。根據(jù)類似化合物的資料，預(yù)計經(jīng)口給藥劑量超過1000mg/kg不會產(chǎn)生毒性時，可設(shè)二個劑量組。8．4．1高劑量組應(yīng)使動物產(chǎn)生較明顯的毒性效應(yīng)。8．4．2中劑量組應(yīng)產(chǎn)生輕微的可觀察到的毒性反應(yīng)。8．4．3低劑量組不應(yīng)出現(xiàn)任何毒性效應(yīng)，但須超過人的可能接觸劑量。8．4．4對照組除了不接觸試驗農(nóng)藥外，其他處理均應(yīng)與試驗組完全相同。8．5給藥方法將試驗農(nóng)藥滲入飼料或溶于飲水中，以固定濃度喂養(yǎng)或按動物體重以固定劑量通過胃管灌胃。作為長期毒性試驗的預(yù)備試驗時，兩種試驗應(yīng)采用相同的給藥方式。喂養(yǎng)給藥應(yīng)連續(xù)進(jìn)行。管飼法每天在同一時間給藥，并按一定的間隔時間（每周），根據(jù)體重調(diào)整給藥量。8．6給藥時間連續(xù)給藥7~28d或5d/周。為了觀察毒性反應(yīng)的可逆性，附加組動物在停止給藥后再飼養(yǎng)14d，再進(jìn)行毒性效應(yīng)的測試。8．7臨床觀察和檢查8．7．1觀察給藥期間和給藥后試驗動物的毒性效應(yīng)、出現(xiàn)時間、持續(xù)時間和程度。如發(fā)現(xiàn)瀕死動物應(yīng)及時解剖。每周至少測量一次進(jìn)食量（或飲水量）和體重。8．7．2血液學(xué)檢查檢測項目包括血紅蛋白含量、紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)及其分類等8．7．3血液生化檢查檢測項目一般應(yīng)包括肝、腎功能，如血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶、尿素氮、肌酐等。必要時還須檢測總蛋白、白蛋白、血糖、總膽固醇、總膽紅素、高鐵血紅蛋白、膽堿酯酶、鉀、鈉、鈣、磷等。8．8病理學(xué)檢查8．8．1系統(tǒng)解剖所有試驗動物包括試驗過程中死亡的動物都應(yīng)進(jìn)行完整的系統(tǒng)解剖和仔細(xì)的肉眼觀察。肉眼可見的損傷或可疑損傷部位都應(yīng)采樣固定，作進(jìn)一步組織學(xué)檢查。8．8．2臟器重量稱取脾、肝、腎、腎上腺、睪丸等臟器重量并計算其臟器系數(shù)（臟器重/體重×100%）。8．8．3組織學(xué)檢查對照組和高劑量組動物以及系統(tǒng)解剖時發(fā)現(xiàn)的異常組織均需作詳細(xì)的組織學(xué)檢查。其他劑量組一般僅在高劑量組有異常發(fā)現(xiàn)時進(jìn)行。附加組動物應(yīng)對試驗組已確證有毒性效應(yīng)的組織和器官重點檢查。檢查臟器一般包括腦、肝、脾、腎、腎上腺、睪丸、卵巢和其他肉眼觀察發(fā)現(xiàn)有損害或大小出現(xiàn)變化的器官。一般以肝、腎及可穎靶器官為主。此外，還應(yīng)包括與農(nóng)藥直接接觸的組織或器官，如胃等。9亞急性經(jīng)皮毒性試驗9．1目的按經(jīng)皮方式反復(fù)給藥21d，觀察由此產(chǎn)生的不良反應(yīng)，求出無作用劑量。9．2試驗農(nóng)藥原藥。9．3試驗動物按8.3進(jìn)行。9．4劑量分組9．4．1一般設(shè)三個劑量組和一個對照組。必要時還應(yīng)設(shè)溶劑對照組。9．4．2最高劑量組應(yīng)出現(xiàn)明顯的中毒效應(yīng)，但死亡動物數(shù)不能妨礙有效的評定。9．4．3如果用1000mg/kg體重以上的劑量給藥而未出現(xiàn)任何毒性效應(yīng)，則不必再設(shè)其他更高劑量組。9．5給藥方法9．5．1剃去動物背部體毛，在無損部分均勻地涂敷試驗農(nóng)藥，并用無刺激性的塑料膜和紗布覆蓋，膠布固定，使農(nóng)藥與皮膚保護(hù)良好的接觸，并防止被動物舔食。9．5．2涂藥面積一般不少于動物體表面積的10%（大鼠約為20~40cm^2）。高毒農(nóng)藥涂藥面積可略減，涂布時要盡量薄而均勻。9．5．3如動物敷用農(nóng)藥后，產(chǎn)生嚴(yán)重的皮膚刺激和損傷，要降低試驗農(nóng)藥的濃度，重新進(jìn)行試驗。9．6給藥時間每天一次，每次4~6h，或5d/周，共給藥21d。為了觀察毒性效應(yīng)的可逆性，附加組動物在停止給藥后再飼養(yǎng)14d，再進(jìn)行毒效反應(yīng)的測試。9．7臨床觀察和檢查按8.7進(jìn)行。9．8病理學(xué)檢查除按8.8進(jìn)行外，尚需增加與農(nóng)藥直接接觸的皮膚檢查。10亞急性吸入毒性試驗10．1目的在規(guī)定的3-4周時期內(nèi)，按吸入方式反復(fù)給藥，觀察由于連續(xù)經(jīng)呼吸道給藥所產(chǎn)生的不良反應(yīng)，求出無作用劑量。10．2試驗農(nóng)藥原藥。10．3試驗動物按8.3進(jìn)行。10．4劑量分組按8.4進(jìn)行。10．5給藥方法10．5．1應(yīng)維持被檢農(nóng)藥在染毒柜中分布均勻，氧含量不低于19%。10．5．2濃度監(jiān)測染毒柜內(nèi)被檢農(nóng)藥濃度應(yīng)定期或連續(xù)監(jiān)測，并盡可能地維持恒定。10．6染毒時間每天一次，每次4h，或5d/周。連續(xù)染毒21-28d。停止染毒后，附加組動物再飼養(yǎng)14d，觀察毒性反應(yīng)的可逆性。10．7臨床觀察和檢查按8.7進(jìn)行。10．8病理學(xué)檢查除按8.8進(jìn)行外，尚需增加與農(nóng)藥直接接觸的呼吸系統(tǒng)，如肺等的檢查。11亞慢性經(jīng)口毒性試驗11．1目的明確試驗農(nóng)藥的亞慢性經(jīng)口毒性效應(yīng)的表現(xiàn)，取得試驗農(nóng)藥亞慢性經(jīng)口的最大無作用劑量參數(shù)，為試驗農(nóng)藥慢性毒性試驗提供劑量參考數(shù)據(jù)。11．2試驗農(nóng)藥原藥。11．3試驗動物11．3．1首選大鼠，4-6周齡，雌雄各半，組間同性別動物體重均值差異應(yīng)小于平均體重的10%。11．3．2動物數(shù)量各組雌雄大鼠均不少于10只。試驗中間剖殺時，應(yīng)相應(yīng)增加。11．4試驗期3-6個月。11．5劑量分組一般設(shè)三個劑量組和一個對照組。11．5．1高劑量組應(yīng)使動物產(chǎn)生較明顯的毒性效應(yīng)，但動物死亡不應(yīng)超過10%。11．5．2中劑量組應(yīng)使動物產(chǎn)生輕微的毒性效應(yīng)。若設(shè)多個中劑量組時，應(yīng)產(chǎn)生不同程度的毒性效應(yīng)。11．5．3低劑量組不應(yīng)引起任何毒性效應(yīng)，屬無作用劑量。11．5．4對照組除不接觸試驗農(nóng)藥外，其他應(yīng)與試驗組相同，當(dāng)試驗農(nóng)藥為制劑，對其助劑、添加劑等的生物活性不清楚時，還應(yīng)設(shè)相應(yīng)的助劑對照組。11．6給藥途徑11．6．1給藥方式混入飼料或溶于飲水。連續(xù)給予動物，每周7d。若因試驗農(nóng)藥引起飼料和飲水的適口性不良，影響動物正常攝入量時，可用管飼法。11．6．2除營養(yǎng)素外，混入飲料的試驗農(nóng)藥一般不應(yīng)超過5%。飼料或飲水中的試驗農(nóng)藥濃度應(yīng)定期監(jiān)測，觀察其均勻性和穩(wěn)定性。11．7臨床觀察和檢查11．7．1臨床觀察外觀體征、行為活動及糞便形狀等每天逐個觀察。詳細(xì)記錄毒性效應(yīng)出現(xiàn)時間和變化，如發(fā)現(xiàn)死亡或瀕死動物應(yīng)及時解剖。體重和食物消耗量每周測量一次。11．7．2血液學(xué)檢查檢查指標(biāo)包括紅細(xì)胞計數(shù)、白細(xì)胞計數(shù)及其分類、血紅蛋白含量等。檢測時間為試驗開始時和3個月后結(jié)束時進(jìn)行，每次檢查各劑量組雌雄大鼠至少各6只，非嚙齒類動物則全部檢查。11．7．3尿液檢查檢查項目包括外觀、pH值、蛋白、糖、隱血（半定量）和沉淀物鏡檢（半定量）。檢測時間和數(shù)量同血液檢查，并盡可能同一動物檢查。11．7．4血液生化檢查檢測項目包括血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶、丙氨酸基轉(zhuǎn)換酶、堿性磷酸酶、尿素氮、肌酐、總蛋白、白蛋白、血糖、總膽固醇、總膽紅素、膽堿酯酶等。11．8病理學(xué)檢查11．8．1系統(tǒng)解剖所有試驗動物包括試驗過程中死亡動物都應(yīng)進(jìn)行完整系統(tǒng)解剖和詳盡的肉眼觀察。所有肉眼可見的病變或可疑病變組織都應(yīng)留樣固定，作進(jìn)一步病理組織學(xué)檢查。11．8．2臟器重量稱取腦、心、肺、肝、脾、腎、腎上腺、睪丸等臟器重量并計算其臟器系數(shù)（臟器重/體重×100%）。11．8．3病理組織學(xué)檢查對照組和高劑量組動物及系統(tǒng)解剖時發(fā)現(xiàn)的異常組織均需作詳盡的組織學(xué)檢查。其他劑量組一般僅在高劑量組有異常發(fā)現(xiàn)時才進(jìn)行組織學(xué)檢查。檢查臟器一般包括腦、脊髓、心、肺、肝、脾、腎、胰、胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、膀胱、腎上腺、垂體、甲狀腺（包括甲狀旁腺）、胸腺、睪丸、附睪、前列腺、卵巢、子宮、乳腺、皮膚、肌肉、骨、淋巴結(jié)、眼球等。吸入染毒時，尚應(yīng)包括呼吸道。11．9結(jié)果評定在仔細(xì)總結(jié)研究各項檢測結(jié)果，并注意對照組與劑量組之間的統(tǒng)計學(xué)差異和各劑量間的劑量反應(yīng)關(guān)系的基礎(chǔ)上，評定以下內(nèi)容。11．9．1試驗農(nóng)藥的動物經(jīng)口毒性效應(yīng)的主要表現(xiàn)。11．9．2試驗農(nóng)藥的亞慢性經(jīng)口動物最大無作用劑量。11．9．3可供參考的試驗農(nóng)藥動物經(jīng)口慢性毒性試驗的適宜劑量范圍。12蓄積毒性試驗12．1目的了解試驗農(nóng)藥蓄積毒性的強弱，并為慢性毒性試驗及其他有毒性試驗的劑量選擇提供參考。12．2試驗農(nóng)藥一般用原藥，當(dāng)大鼠經(jīng)口LD50大于5000mg/kg，或已作過代謝試驗有半衰期（t1/2）數(shù)據(jù)的，可免去此項試驗。12．3試驗動物剛成年的哺乳動物，選用大鼠或小鼠，雌雄各半。無經(jīng)口LD50數(shù)據(jù)者，需預(yù)測其經(jīng)口LD50。12．4給藥方式采用經(jīng)口方式。為了準(zhǔn)確掌握給藥劑量，須采用灌胃法。12．5劑量固定的20d蓄積法12．5．1劑量分組將試驗動物機分成四個劑量組，低劑量為1/20LD50，順次為1/10LD50、1/5LD50和1/2LD50四個劑量組。另設(shè)一個陰性（不給藥）對照組，每組動物為10只，雌雄各半。12．5．2給藥時間劑量組動物每日一次定時給藥，連續(xù)給藥20d。對照級除不給試驗農(nóng)藥外，其他條件均與劑量組相同。12．5．3觀察指標(biāo)各劑量組雌雄合計的動物死亡數(shù)量。12．5．4結(jié)果評定各劑量組均無死亡，好為蓄積性不明顯；如僅高劑量（1/2LD50）組有死亡，其他組均無死亡，則為弱蓄積性；如低劑量組無死亡，其他各組間死亡數(shù)有劑量反應(yīng)關(guān)系時，則為中等蓄積性；如低劑量組有死亡，且有劑量反應(yīng)關(guān)系，則為強蓄積性。12．6劑量遞增蓄積系數(shù)法12．6．1劑量分組將試驗動物隨機分成雌雄兩組，每組20只。12．6．2給藥時間及劑量以4d為一期，連續(xù)給藥。第一期每只動物給藥劑量為0.1LD50，以后各期順次遞增50%，即第二期為0.15LD50，第三期為0.225LD50，依次類推，直至雌雄兩組合計死亡一半（20只），或繼續(xù)給藥至累計劑量達(dá)5.0LD50以上（20d）為止。12．6．3給藥期間每期（4d）須按實測動物體重，計算給藥絕對量。12．6．4結(jié)果計算停止給藥后按式（1）計算蓄積系數(shù)K：K=LD50(n)/LD50(1)......................................................................(10LD50(n)--------試驗動物在給藥期間每只動物共攝入試驗農(nóng)藥相當(dāng)?shù)腖D50數(shù)；LD50(1)--------試驗農(nóng)藥對本試驗動物的經(jīng)口LD50劑量。12．6．5結(jié)果評定按下列標(biāo)準(zhǔn)評定被檢農(nóng)藥蓄積毒性強弱：K<1高度蓄積性；K≥1明顯蓄積性；K≥3中等蓄積性：K≥5輕度蓄積性。13遲發(fā)性神經(jīng)毒性試驗13．1目的了解試驗農(nóng)藥的遲發(fā)性神經(jīng)毒性，求出遲發(fā)性神經(jīng)毒性無作用劑量。13．2試驗農(nóng)藥原藥。13．3試驗動物13．3．1選用遺傳背景明確、健康、步態(tài)正常的母雞，雞齡8~14個月，體重1.5-2kg。13．3．2數(shù)量每劑量組母雞數(shù)量應(yīng)保證在觀察結(jié)束時存活至少有6只。到期處死，如需觀察恢復(fù)情況，則應(yīng)在開始實驗時增加延長觀察期的動物數(shù)。13．4給藥方法13．4．1劑量分組一般設(shè)三個不同劑量的試驗組，一個陽性對照組和一個空白對照組。其賦形劑等生物活性不明確時應(yīng)增設(shè)一個賦形劑對照組。13．4．1．1高劑量組：根據(jù)：LD50和預(yù)試驗確定，一般采用LD50劑量。觀察期結(jié)束時可引起試驗動物膽堿酯酶活性下降，以及部分動物死亡。13．4．1．2低劑量組：根據(jù)預(yù)試驗確定，可能引起或不引起遲發(fā)性神經(jīng)毒狀，其劑量一般為高劑量的五分之一至十分之一左右。13．4．1．3中劑量組：在高低之間，其癥狀在Ⅱ級以上，少部分動物可達(dá)Ⅳ級（見）。13．4．1．4陽性對照組：500mg/kgTOCP（三鄰甲苯磷酸酯）。13．4．1．5空白對照：除不接觸試驗農(nóng)藥外，其他各種條件與試驗組相同。13．4．2給藥方式通常采用經(jīng)口途徑，包括灌胃、膠囊吞咽或咽峽部滴注等方法。13．4．3給藥前預(yù)處理隔夜禁食，經(jīng)口給藥前10min內(nèi)，所有試驗雞均肌肉注射10mg/kg硫酸阿托品作保護(hù)處理。13．5試驗期限13．5．1急性試驗觀察期一般為21d。如未見異常反應(yīng)或有可疑反應(yīng)時，須再次給藥，繼續(xù)觀察21d。到期處死作組織病理學(xué)檢查。如特殊需要，部分動物可延長2~4周或更長時間觀察恢復(fù)情況。13．5．2亞慢性試驗連續(xù)給藥13周并觀察，停藥后再觀察一周。13．6臨床觀察和檢查13．6．1中毒癥狀給藥后每天觀察記錄試驗雞的外觀體征，行為活動，特別是雞的站立和運動姿勢及運動失調(diào)程度。必要時可強迫母雞活動，如爬樓梯等，以便觀察遲發(fā)性神經(jīng)毒性的最小反應(yīng)。其典型癥狀的分級標(biāo)準(zhǔn)為：Ⅰ步態(tài)稍異常；Ⅱ步態(tài)嚴(yán)重異常；Ⅲ能以跗站立；Ⅳ不能站立。一般遲發(fā)性神經(jīng)毒性反應(yīng)在第7~10d開始出現(xiàn)并逐漸加重。13.6.2每周稱體重一次。13.6.3病理組織學(xué)檢查對死亡動物和到期處死動物檢查延髓/橋腦、大腦皮質(zhì)、小腦皮質(zhì)、脊髓（包括上位頸段、胸段中部、腰骶結(jié)合部和坐骨神經(jīng)等）并作組織切片。一般用灌流或其他方法，使被檢腦神經(jīng)組織固定在原來位置上。坐骨神經(jīng)切片要作髓鞘和軸索的特殊染色。光鏡觀察，必要時可作電鏡觀察檢查。13．7數(shù)據(jù)整理與結(jié)果評定將數(shù)據(jù)匯總列表，說明每組實驗動物數(shù)，有上述損傷或異常反應(yīng)的動物數(shù)，出現(xiàn)損傷和異常反應(yīng)的百分率，并用卡方等統(tǒng)計方法分析組間差異的顯著性。評定試驗農(nóng)藥能否引起遲發(fā)性神經(jīng)毒性及其反應(yīng)。評定時應(yīng)結(jié)合所觀察到的神經(jīng)毒性效應(yīng)和神經(jīng)病理組織學(xué)檢查結(jié)果綜合考慮。14致突變試驗14．1目的檢測試驗農(nóng)藥的誘變性。預(yù)測其遺傳危害和潛在致癌作用的可能性。14．2試驗農(nóng)藥原藥。14．3鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗（Ames試驗）14．3．1菌株本試驗至少要用TA97、TA98、TA100和TA102四種標(biāo)準(zhǔn)突變型菌株。14．3．2試劑14．3．2．140%葡萄糖溶液：稱取400g葡萄糖，加入蒸鎦水稀釋至1000mL，在115℃（0.56kg/cm^2）10min高壓下滅菌。14．3．2．20.5mmol/L組氨酸-生物素溶液：D-生物素（分子量247.3）30.9mgL-組氨酸鹽酸鹽（分子量191.7）24.0mg蒸鎦水250mL14．3．2．3S-9混合液（按每毫升S-9混合液計算）：大鼠肝S-9100uLMgCl2-KCl鹽溶液20uL6-磷酸葡萄糖5umol輔酶Ⅱ4umol0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）500muL無菌蒸鎦水380muL14．3．2．4鹽溶液[1.65mol/L氯化鉀（KCl）+0.4mol/L氯化鎂（MgCl2）]：氯化鉀（KCl）61.5g氯化鎂（MgCl2·6H2O）40.7g蒸鎦水500.0mL在121℃（15Ib）20min高壓下滅菌。14．3．2．50.2mol/L磷酸鹽緩沖劑（pH7.4）：磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）0.593g磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）5.803g蒸鎦水100.0mL在121℃（1.05kg/cm^2）20min高壓下滅菌。14．3．2．60.15mol/L氯化鉀溶液：精確稱取氯化鉀11.18g，用蒸鎦水稀釋1000mL，121`C(1.05kg/cm^2)30斯mi雜n高杰壓下梳滅菌晃，冷革卻后調(diào)冰箱三保存混。誘14械．3貍．2倚．7惱氨芐女青霉鐮素溶陷液（煎8m命g/療mL案）：篇稱取孔三羥傍氨芐蛛青霉尚素8核0m建g，名加入鍵0.韻02匯mo春l/緩L氫綁氧化錯鈉溶史液1事0m臣L。溪14構(gòu)．抗3牲．釣2池．墳8程0.其1%知結(jié)晶崖紫溶旺液：它稱取菜結(jié)晶文紫后10莖mg六，加錄10午mL餡無菌肯水?？?4坑．麗3聚．鑼2攝．駕9雷四環(huán)貧素溶匙液（犬8m工g/石mL苗）：善稱取訴四環(huán)遼素堅40慌mg兄，加熄入姐0.夜02動mo短l/鞠L沒鹽酸庫溶液姑5m徹L廚，用乖于四在環(huán)素蹄抗性談試驗風(fēng)。確14蝦．姑3丑．?dāng)?shù)3返培養(yǎng)量基討14顯．慕3預(yù)．臥3挑．騎1擔(dān)頂層遠(yuǎn)培養(yǎng)泄基：榆瓊脂拉1.預(yù)2g免氯化藝物備1.紗0g墻蒸鎦攔水頁2衣00鵝.0皇mL榨在懼12屑1條℃丑30線mi革n高縣壓滅增菌后你，加漢入0被.5吐mm媽ol啟/L防組氨唉酸-絕生物掙素溶桌液2雹0m欠L。鴿14棗．3勢．3疏．2靜底層跟培養(yǎng)改基：屬瓊脂總7.濫5g摟蒸鎦傾水對4燕65惱.0氏mL勢在斑12鎖1飲℃摔30欠mi刃n高斃壓滅睛菌后改，加江入（擾V-傘B）宰培養(yǎng)甲基E檔10刑mL止和4偏0%技葡萄擁糖溶爸液2盡5m禿L，瘋混勻禁，按紡每皿鞏30住mL子倒平追皿，咽冷凝沸固化揉合倒卻置于類37產(chǎn)℃贏培養(yǎng)由箱中擠24娃~4益8h蘆。漢14存．3艇．3晚．3富Vo專ge內(nèi)l-漿Bo倘nn茶er蔬(V臘-B既)培宋養(yǎng)基蹈E：近硫酸耀鎂（便Mg埋SO吳4主·7泄H拐2止O）路盾10頭.0俱g謀檸檬涉酸（旨C份6團(tuán)H豪8骨O助7棉·H藍(lán)2銳O）梅10須0.母0g纏磷酸喝氫二挑鉀（酒K猜2膠HP蛛O淋4鹿）俱50籠0.賞0g價磷酸夏二氫的鈉（賊Na珠H煩2償PO室4寇·4首H財2店O）昨17床5.嗽0g廚先將川檸檬湊酸、圣磷酸溝氫二內(nèi)鉀和住磷酸嚼二氫桶鈉溶效解后擋，再肉加入禽硫酸傷鎂，逃待完衣全溶限解后勇倒入健容量壇瓶中沿，用車蒸鎦賞水稀唇釋至賺10壁00室mL徑，分辟裝于保錐形央瓶內(nèi)令，在錫12故1稿℃吩30蔑mi兇n高角壓下學(xué)滅菌使。露14淚．3刻．3偉．4捉肉雀湯培田養(yǎng)基在：駝牛肉慣膏螞2.趕5g延胰胨貨5.滲0g何氯化兼鈉（華Na驕Cl草）漿2.躁5g漢磷酸升氫二黨鉀（鴿K叛2縣HP疲O稱4劉）見1.論0g委蒸鎦棍水葡5文00否.0叨mL客在蹦12弓1灘℃恩30圾mi菠n高賊壓下凝消毒約。微14炮．3把．3納．5鉗肉添湯斜棍面或污平板茶：享瓊脂悔7.呀5g軋肉湯吃培養(yǎng)松基果5恩00伴.0堪mL味在震12因1莊℃脹30雹mi丑n高欣壓滅棒菌后完，倒牲斜面翻或平乳皿。搜用于坦菌株逼鑒定櫻或常洗規(guī)試效驗用標(biāo)菌株達(dá)保存邁。湊14她．3宗．4顯溶劑怕和劑勻量分飽組教常用廉溶劑透為蒸控鎦水糟、二驚甲基差亞砜難。此咽外還隆可用鞋丙酮幻、二罪甲基鍬甲?？岚?、浩甲酰剩胺、厭95害%耳乙醇覺等溶夫劑，串最高搶加入蔬量為謎0.寫1m貴L魯。試悟驗農(nóng)蟲藥的奧劑量扣范圍兵可在野每皿違0.早1-賠5.將0m組g墊，或坡對細(xì)醒菌發(fā)森生毒鵲性的泄劑量腿之間噸。每違種試木驗農(nóng)布藥至倘少設(shè)杏三個危劑量濤組，兔每個汁劑量嬸至少矩三個敘重復(fù)問樣品額。每下次試故驗必宣須設(shè)銹陽性戰(zhàn)對照援和陰創(chuàng)性對芝照。驗14辭．慘3觸．靈5軍標(biāo)準(zhǔn)治菌株虜對陽膨性誘撓變劑傭的反沉應(yīng)（拼見表童9奶）?？乇?拿標(biāo)辱準(zhǔn)沙匹門氏路菌株槍對陽禽性誘據(jù)變劑坐的回勢變反渠應(yīng)誘變劑劑量（ug)S-9TA97TA98TA100TA102柔毛霉素疊氨化鈉2,4,7-三硝基-9-芴酮4-硝基O-次苯二胺4-硝基喹啉-N-氧化物甲基磺酸甲酯2-氨基芴苯并（a）芘6.0

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25514．3．6菌株準(zhǔn)備與鑒定14．3．6．1組氨酸的要求：將組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株分別接種于含有和不含有組氨酸的培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長情況。14．3．6．2脂多糖屏障缺陷：將含0.1mL試驗菌株增菌液的頂層瓊脂培養(yǎng)液倒入肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，冷凝后，將無菌圓形濾紙片置于培養(yǎng)基中央，再滴上0.1%結(jié)晶紫溶液10mL，經(jīng)37℃培養(yǎng)24h。在紙片周圍有抑菌圈。即表示結(jié)晶紫分子已進(jìn)入菌體內(nèi)并抑制其生長。14．3．6．3紫外線損傷修復(fù)缺陷：將被測菌株在肉湯瓊脂培養(yǎng)基上劃線，然后用黑紙覆蓋一半，在15W的紫外燈下，距離33cm處照射8s，37℃培養(yǎng)24h后，TA97、TA98、TA100和TA102在沒有照射的那一半生長，在照射的那一半不能生長。14．3．6．4抗氨芐青霉素試驗：將帶有R因子的菌株TA97、TA98、TA100和TA102在肉湯瓊脂培養(yǎng)基上劃線，然后把沾有氨芐青霉素溶液的濾紙條與劃線交叉，置37℃培養(yǎng)24h，觀察濾紙條周圍菌株生長情況。14．3．6．5抗四環(huán)素試驗：將被測菌株增菌液在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上劃線，待干后，將四環(huán)素溶液與菌株劃線處交叉劃線，經(jīng)37℃培養(yǎng)24h后，對四環(huán)素有抗性的TA102菌株生長不受抑制。14．3．6．6自發(fā)回變：每種被測菌株都以一定的頻率自發(fā)地產(chǎn)生回變。TA97、TA98、TA100和TA102經(jīng)過體外代謝活化后，自發(fā)回變數(shù)要比不經(jīng)體外代謝活化的自發(fā)回變數(shù)略高。14．3．6．7操作步驟板平板摻入法：向融化并保溫在45℃的2.0mL頂層培養(yǎng)基試管中依次加入試驗農(nóng)藥、0.1mL增菌液0.5mLS-9混合液（或不加S-9混合液）混勻，迅速傾入底層培養(yǎng)基上，使其均勻分面，待上層培養(yǎng)基凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，37℃培養(yǎng)48h后，計數(shù)每皿回變菌落數(shù)。14．3．8結(jié)果評定試驗農(nóng)藥的回變菌落數(shù)超過自發(fā)回變菌落數(shù)的兩倍以上，并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，則為陽性。14．4小鼠骨髓多染紅細(xì)胞微核試驗14．4．1試驗動物小鼠，體重為25~30g，每個劑量組至少雌雄各5只。14．4．2試驗材料14．4．2．1姬姆薩染液：稱取Giemsa染料3.8g，加入375mL分析純甲醇，待完全溶解后，再加入125mL甘油，放37℃恒溫箱中保溫48h，使其充分溶解，過濾，兩周后用。14．4．2．2磷酸鹽緩沖液（pH7.4）：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）19.077g、磷酸二氫鉀（KH2PO4）1.814g加蒸鎦水至1000mL。14．4．2．3Giemsa應(yīng)用液：取一份Giemsa液與六份磷酸鹽緩沖液混合而成。14．4．3劑量分組和給藥途徑一般取試驗農(nóng)藥LD50的1/5、1/10、1/20和1/100等劑量，以觀察微核的劑量-反應(yīng)關(guān)系。同時設(shè)溶劑對照組和陽性對照組（一般用環(huán)磷酰胺）。根據(jù)試驗農(nóng)藥的水溶性或脂溶性來確定所用溶劑，常用水、植物油或吐溫-80等溶劑。給藥途徑視試驗?zāi)康亩?，一般用?jīng)口灌胃或腹腔注射方式。采用30h給藥法，即兩次給藥間隔24h，第二次給藥后6h取材。14．4．4操作步驟14．4．4．1制片：斷延髓處死動物，立即取出胸骨，除去胸骨上的血液和肌肉，橫向切斷胸骨，暴露骨髓腔，然后用小止血鉗擠出胸骨骨髓液。將骨髓液滴在載物片一端的胎牛血清液滴里，仔細(xì)混勻，按常規(guī)法涂片，在空氣中晾干。14．4．4．2固定：將骨髓涂片放入甲醇中固定15min，取出晾干。14．4．4．3染色：將骨髓片放入Giemsa應(yīng)用液中，染色15min，然后立即用pH7.4磷酸鹽沖液沖洗。14．4．4．4鏡檢和計數(shù)：每只動物計數(shù)1000個多染紅細(xì)胞。微核率指含有微核的多染紅細(xì)胞數(shù)，以千分率表示。為觀察骨髓細(xì)胞分裂是否受抑制，求出每只動物骨髓中多染紅細(xì)胞/成熟紅細(xì)胞（PCE/NCE）之比。正常情況下PCE/NCE約為。14．4．5結(jié)果評定首先找出受試農(nóng)藥各劑量組和對照組微核95%可信限，查普阿松分布（λ）的可信限表，陽性物組的95%可信限按正態(tài)分布處理。然后繪出試驗農(nóng)藥各劑量組和對照組的95%可信限的直線圖。最后，各劑量組與對照組進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。根據(jù)統(tǒng)計處理結(jié)果來評價試驗農(nóng)藥是否具有致微核作用。14．5哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗14．5．1試驗動物選用成年小鼠或大鼠。14．5．2劑量分組選用1/5、1/10、1/20和1/100LD50劑量為試驗組，另設(shè)陽性對照和陰性對照各一組，陽性對照組可用環(huán)磷酰胺，陰性對照為溶劑對照，每組各為5只動物。14．5．3給藥方式可用經(jīng)口灌入的方式，共染毒兩次，間隔24h，于第二次給藥后6h處死動物，于處死前4h腹腔注射秋水仙素（按劑量4mg/kg）。14．5．4試驗方法14．5．4．1用頸椎脫臼法處死動物，取出股骨，剔除肌肉等組織。14．5．4．2剪去股骨兩端，用注射器吸取5mL生理鹽水，從股骨一端注入，用10mL離心管，從股骨另一端接取流出的骨髓細(xì)胞懸液。14．5．4．3將細(xì)胞懸液以1000r/min的速度離心5~7min，去除上清液。14．5．4．4加入0.075mol/L氯化鉀溶液7mL用滴管將細(xì)胞輕輕地混勻，放入37℃水浴中低滲處理7min，加入2mL固定液（冰乙酸：甲醇=1：3），混勻，以1000r/min速度離心5~7min，棄去上清液。14．5．4．5加入7mL固定液，混勻，固定7min，以1000r/min的速度離心7min，棄去上清液。14．5．4．6用同法再固定1~2次，棄去上清液。14．5．4．7加入數(shù)滴新鮮固定液，混勻。14．5．4．8用混懸液滴片，自然干燥。14．5．4．9用姬姆薩染液染色。14．5．5讀片和結(jié)果評定選擇分散良好的中期分裂相，在顯微鏡下進(jìn)行讀片，記錄畸變類型。所得各級的染色體畸變率用X^2檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，以評定試驗組和對照組之間是否有明顯差異。14．6小鼠睪丸精母細(xì)胞染色體畸變試驗14．6．1試驗材料全部試劑除注明外，均勻分析純，試驗用水為蒸鎦水。14．6．1．11%檸檬酸三鈉（AR）：取1g檸檬酸三鈉加蒸鎦水至100mL。14．6．1．260%冰乙酸溶液（AR）：取60mL冰乙酸加蒸鎦水至100mL。均應(yīng)新鮮配制。14．6．2試驗動物選用健康成年雄性小鼠，體重25~30g，每組5只。14．6．3劑量分組設(shè)陰性（溶劑）對照組、陽性對照組及三個試驗農(nóng)藥劑量組。陽性物可用絲裂霉素C（1.5~2mg/kg、ip.一次）或環(huán)磷酰胺（40mg/kg、ip.每天一次，連續(xù)5d）。陽性對照組在同一個實驗室同一品系動物僅做一次即可，如調(diào)換操作人員，應(yīng)重新再做。試驗農(nóng)藥的三個劑量組可根據(jù)急性經(jīng)口LD50，選用可使試驗動物出現(xiàn)輕度中毒癥狀、體重略有下降及不引起動物死亡的劑量為高劑量，以其1/2、1/4LD50為中、低劑量。14．6．4給藥方法灌胃，每天一次，連續(xù)5d。14．6．5試驗步驟14．6．5．1各組均于第一次給藥后的第12~14d將試驗動物處死制片。14．6．5．2動物處死前6h腹腔注射秋水仙素4~6mg/kg體重（按10g體重給受試物）。秋水仙素宜當(dāng)天新鮮配制。14．6．5．3以頸椎脫臼法處死小鼠，取出兩側(cè)睪丸，去凈脂肪，于低滲液中洗去毛和血污，放入盛有適量1%檸檬酸三鈉或0.4%氯化鉀溶液的小平皿中。14．6．5．4用眼科小鑷子撕開被膜，輕輕地分離開曲細(xì)精管，室溫下低滲，低時間視具體條件而（一般為20~40min為宜）。14．6．5．5仔細(xì)吸盡低滲液，加固定液（甲醇：冰乙酸=3：1）10mL，固定20min。14．6．5．6吸盡固定液，加60%冰乙酸1-2mL，待大部分曲細(xì)精管軟化完后，立即加入倍量的固定液，打勻、移入離心管，以1000r/min離心10min。14．6．5．7棄去大部分上清液，留下約，充分打勻制成細(xì)胞混懸液，將細(xì)胞混懸液均勻地滴于冰水玻片上。每個樣本制片2-3張?？諝庵辛栏苫蛭岷娓?。14．6．5．8用1：10Giemsa液（pH6.8）染色20-40min。14．6．6計算方法和結(jié)果評定實驗組與陰性對照組的斷片、易位、畸變細(xì)胞率、常染色體單價本、性染色體單價體等分別按Kas-tenbaum和Bowman所述方法或二項分布檢驗法進(jìn)行統(tǒng)計處理，如P<0.05則可以認(rèn)為有顯著意義。14．7顯性致死突變試驗14．7．1試驗動物選用雄性成年小白鼠（體重30g以上）或大白鼠（體重200g以上），預(yù)先接觸受試物，再進(jìn)行交配。成年雌鼠經(jīng)生死能力預(yù)試，受孕率應(yīng)在70%以上，不接觸試驗農(nóng)藥。14．7．2劑量分組14．7．2．1試驗至少設(shè)三個劑量組，給藥量可在1/10~1/3LD50之間，最大劑量也可按人體實際攝入量的100倍計算。并需設(shè)陰性與陽性對照組，前者用溶劑對照，后者用環(huán)磷酰胺（40mg/kg體重）。14．7．2．2動物數(shù)量：雄性動物每組不少于10~15只，雌性動物則按每組不少于20~30只，雌性：雄性為2：1適宜。14．7．3給藥方法灌胃法：按體重10g0.2mL體積計算。喂飼法：按稱量記錄攝食量與動物體重進(jìn)行計算。給藥次數(shù)：灌胃法一般一日一次，或一日兩次，連續(xù)6d或3個月。14．7．4試驗方法在雄鼠給藥后，按雌雄鼠2：1比例同籠交配6d，取出雌鼠另行飼養(yǎng)。雄鼠則于一周后，再與此同樣數(shù)量的另一批雌鼠同籠交配，如此共進(jìn)行6~8批。14．7．5觀察指數(shù)14．7．5．1以雌雄鼠同籠日算起第17-19d，采用頸椎脫臼法處死雌鼠后，立即剖腹取出子宮，仔細(xì)檢查、計數(shù)，分別記錄每一雌鼠的活胎數(shù)、早期死亡胎數(shù)與晚期死亡胎數(shù)。14．7．5．2胚胎鑒別活胎：完整成形，色鮮紅，有自然運行，機械刺激后有運動反應(yīng)。早期死亡胚胎：胚胎形體較小，外形不完整，胎盤較小或不明顯。最早期死亡胚胎僅在子宮內(nèi)膜上隆起如一小瘤。如已完全被吸收，僅在子宮內(nèi)膜上留一隆起暗褐色點狀物。晚期死亡胚胎：成形，色澤暗淡，無自然運動，機械刺激后無運動反應(yīng)。17．7．6統(tǒng)計分析根據(jù)以上結(jié)果，計算出受孕率，總著床數(shù)、早期和晚期死亡率及平均早期胚胎死亡數(shù)予以比較評價。數(shù)予以比較評價。受孕率（%）=孕鼠數(shù)/交配雌鼠數(shù)x100....................................................................(2)總著床數(shù)=活胎數(shù)+早期胚胎死亡數(shù)+晚期胚胎死亡數(shù)..................................(3)平均著床數(shù)=總著床數(shù)/受孕雌鼠數(shù).........................................................................(4)早期胚胎死亡率（%）=早期胚胎死亡數(shù)/總著床數(shù)x100.........................................................(5)晚期胚胎死亡率（%）=晚期胚胎死亡率/總著床數(shù)x100.........................................................(6)平均早期胚胎死亡數(shù)=早期胚胎死亡數(shù)/受孕雌鼠數(shù)............................................................(7)按試驗組與對照組動物的上述指標(biāo)分別用X2檢驗，單因素，方差分析或其他檢驗方法進(jìn)行統(tǒng)計分析，以評定此農(nóng)藥的致突變性。15致畸試驗15．1目的測定試驗農(nóng)藥能否在胚胎發(fā)育時期引起永久性的肉眼可見的形態(tài)改變。15．2試驗農(nóng)藥原藥。15．3試驗動物15．3．1大鼠或小鼠，特定情況下用兔。15．3．2各劑量組及對照組應(yīng)是剛進(jìn)入性成熟期的雌性大鼠或小鼠12-20只，或孕兔8-12只。15．4交配及受孕檢查讓健康性成熟（生后70-90d）大鼠雌與雄1：1或2：1同籠后，檢查陰栓或陰道涂片，自發(fā)現(xiàn)精子之日作為受孕零天。15．5劑量和對照設(shè)計15．5．1至少應(yīng)選擇三個劑量。高劑量選用引起母鼠體重增重受抑或小于LD10的劑量；低劑量用胚胎鼠不產(chǎn)生顯著反應(yīng)的劑量；中間劑量要有助于觀察評價劑量–反應(yīng)關(guān)系。15．5．2劑量設(shè)計應(yīng)把急性LD50、亞慢性試驗最大無作用劑量以及人體實際攝入量作為依據(jù)，最好通過預(yù)備試驗確定各組劑量水平。15．5．3如果1000mg/kg以上的劑量無胎毒作用，則不必設(shè)計其他劑量。15．5．4應(yīng)設(shè)陰性對照組。除不給試驗農(nóng)藥外，對照組的一切處理均同劑量組。15．5．5應(yīng)設(shè)陽性對照組。一般應(yīng)用敵枯雙（1mg/kg），給藥方法同所試農(nóng)藥，也可用維生素A。15．6給藥時期給藥時期包括器官形成期的主要階段。大鼠孕后7-16d，小鼠為6-15d，兔為6-18d。15．7給藥方式15．7．1一般采用經(jīng)口法。15．7．2試驗農(nóng)藥應(yīng)在每天的同一時間給藥。15．7．3每日劑量按給藥開始之日母鼠體重計；也可每隔3d稱重一次，每日給藥量按最重時的體重計。15．8母鼠觀察15．8．1每日應(yīng)稱取母鼠體重，并仔細(xì)觀察母鼠臨床癥狀，包括皮膚、毛、眼、粘膜、呼吸、神經(jīng)狀態(tài)和四肢活動等的變化。15．8．2及時觀察和記錄中毒癥狀，記載中毒的發(fā)生時間、表現(xiàn)程度和持續(xù)時間。15．9畸形檢查15．9．1孕鼠處死分娩前一天處死取胎，避免自然分娩后新生動物被咬死、咬傷。大鼠在孕期第20d，小鼠第18d，兔第29d處死。15．9．2剖腹及胎鼠外觀檢查處死和死亡的母鼠在死后立即取出子宮稱重，記錄著床數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)（估測死胎發(fā)生時間）和吸收胎數(shù)，測量其體重、身長和尾長。15．9．3大鼠每窩取胎鼠二分之一至三分之一做骨骼檢查，其余做內(nèi)臟及軟組織檢查（參見表10）。必要時留一部分母鼠讓其自然分娩，然后觀察仔鼠的畸形。表10致畸試驗胎鼠體表檢查項目頭部軀干部四肢無腦癥腦膨出頭蓋裂腦積水小頭癥顏面裂小眼癥眼球突出無耳癥小耳癥耳低位無鄂癥小鄂癥下鄂癥口唇裂口蓋裂胸骨裂胸部裂脊椎裂脊椎側(cè)彎脊椎后彎臍疝尿道下裂無肛門短尾、卷尾無尾腹裂多肢無肢短肢半肢多指無指合指短指缺指15．9．4檢查對胎仔各器官的影響，包括外觀和內(nèi)臟出現(xiàn)的各種畸形（參見表11，表12）：檢查對胎仔骨骼發(fā)育的影響，包括頭顱骨、胸骨、前后肢骨和其他骨骼的骨化程度，異變和畸形等（參見表13）。表11致畸試驗胎鼠內(nèi)臟檢查項目頭部（脊髓）胸部腹部嗅球發(fā)育不會側(cè)腦室擴張第三腦室擴張無腦癥無眼球癥右位心房中隔缺損室間隔缺損主動脈弓食道閉鎖肝分葉異常腎上腺缺失多囊腎馬蹄腎膀胱缺失續(xù)表11頭部（脊髓）胸部腹部小眼球癥角膜缺損單眼癥氣管狹窄無肺癥多肺癥肺葉融合膈疝氣管食管瘺內(nèi)臟異位睪丸缺失隱睪癥卵巢缺失卵巢異位子宮缺失子宮發(fā)育不全腎積水腎缺失輸尿管積水表12致畸試驗胎鼠骨骼檢查項目枕骨脊柱骨骨盆四肢骨腕骨掌骨趾骨肋骨胸骨骨化中心、發(fā)育不全數(shù)目、融合、縱裂、部分裂開、骨化中心數(shù)、發(fā)育不全、縮窄、脫離、形狀弓數(shù)目、骨化中心數(shù)、形狀異常、融合、裂開、縮窄、脫離形狀、數(shù)目骨化中心數(shù)形狀形狀數(shù)目、形狀、融合分開、缺損、發(fā)育不全形狀、完全缺失、胸骨節(jié)融合、裂開、形狀異常、發(fā)育不全表13致畸試驗記錄內(nèi)容動物交配投藥期解剖檢查時胎仔檢查動物編號動物種、品種交配時周齡確認(rèn)受孕臨床癥狀進(jìn)食進(jìn)水量藥物幾溶劑劑量給藥途徑給藥期間母體解剖所見卵巢重量黃體數(shù)著床數(shù)胎盤重量胎仔子宮內(nèi)位置死胎數(shù)活胎數(shù)胎仔數(shù)體表檢查骨骼檢查內(nèi)臟檢查15．10數(shù)據(jù)處理、結(jié)果評定15．10．1數(shù)據(jù)匯總成表，全部觀察結(jié)果須經(jīng)統(tǒng)計處理，例如胎鼠身長、尾長和體重等用t值檢驗，胎鼠吸收率，死亡率及畸形率用X2處理。15．10．2鑒定農(nóng)藥是否有母體毒性，胚胎毒性以及致畸性。如有致畸效應(yīng)，可得出最小致畸量，以最小致畸量求得致畸指數(shù)，表示致畸強度。致畸指數(shù)=雌性動物L(fēng)D50/最小致畸劑量...............................................................(8)致畸指數(shù)小于10為基本無致畸危害；致畸指數(shù)10-100為有致畸危害；致畸指數(shù)大于100為致畸危害。16兩代繁殖試驗16．1目的本試驗的目的在于獲得試驗農(nóng)藥對動物親代生殖與仔代早期發(fā)育影響的一般性資料；同時也可在仔代病老、死亡畸型等方面取得初步資料，為其他有關(guān)毒性試驗提供參考。16．2試驗代數(shù)一般進(jìn)行連續(xù)兩代各繁殖一窩的試驗。以大鼠為例，兩代繁殖試驗程序見表14。表14大鼠兩代繁殖試驗程序表試驗工作周親代（P）子一代（F1）子二代（F2）第3周末第4-6周^1)第7周第8-15周第16-18周^2)第18周末第19-21周第21周末第22-24周^1)第25周第26-33周第34-36周^2)第36周末第37-39周第39周末第40-42周^1)第42周末出生哺乳基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)給藥喂養(yǎng)交配（給藥）交配結(jié)束雄性處死妊娠（給藥）授乳（給藥）全處死出生哺乳（每窩留雌性4只、雄性4只，其余處死）基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)給藥喂養(yǎng)交配（給藥）交配結(jié)束，雄性處死妊娠（給藥）授藥（給藥）全處死出生哺乳全處死注：1）可以增加1-7d；2）可能不需要3周。16．3試驗農(nóng)藥試驗農(nóng)藥原則上用原藥。但如原藥有強烈腐蝕性或高毒不適于直接接觸動物者，可用生產(chǎn)中使用的制劑。如在試驗農(nóng)藥中加有溶劑或其他添加物，而這些物質(zhì)的毒性不明時，須設(shè)溶劑或添加物的動物對照組。16．4試驗動物用一種哺乳動物，道選大鼠，而且是一般毒理試驗中常用且產(chǎn)仔較多的品系。16．5劑量分組16．5．1一般設(shè)高、中、低三個劑量組。高劑量應(yīng)能使動物產(chǎn)生明顯毒性效應(yīng)，但死亡不超過10%；低劑量不應(yīng)使動物出現(xiàn)任何毒性效應(yīng)；中劑量介于高、低劑量中間，應(yīng)使動物稍有毒性效應(yīng)。16．5．2每個組至少要有保證能交配的雄性動物10只以上（最好20只），分娩時能有20只妊娠動物；雌性動物須是未經(jīng)產(chǎn)仔的。16．5．3至少要設(shè)一個陰性對照組，即除不給試驗農(nóng)藥外，其他一切條件均與劑量組相同，有必要和可能時還應(yīng)設(shè)溶劑（添加物或賦形劑）對照組。16．6給藥時間以大鼠為例，經(jīng)哺乳期3~4周后；8周齡前雌雄動物同時給藥，給藥至少8周后交配，交配期最長持續(xù)（雌雄合籠）3周；雌性動物妊娠、授乳期繼續(xù)給藥，直至幼仔斷奶為止，雄性動物給藥至交配結(jié)束為止。動物停藥后立即處死檢查。16．7給藥方法16．7．1一般是按所定劑量將試驗農(nóng)藥摻入飼料中，混合均勻后給藥（必要時做化學(xué)分析抽查）。16．7．2如有必要，也可用灌胃方式或用膠囊給予。在這種情況下，給藥量要按逐周、逐只動物的體重計算。妊娠期可按妊娠0d和妊娠第6d的體重，分兩階段計算給藥量。16．8給藥期檢查16．8．1每日對動物進(jìn)行仔細(xì)的臨床觀察。16．8．2每日記錄動物攝食量。16．8．3每周稱量一次（或兩次）體重。16．8．4在臨給藥前、給藥4周和8周后，每組動物至少隨機抽取雌雄各6只，檢查項目至少包括Hb濃度、血液RBC數(shù)，血液WBC數(shù)及分類，AST和ALT。16．9交配方法16．9．1用于交配的雌雄動物須屬于同一劑量組或?qū)φ战M，但不是同窩所生。16．9．2雌雄動物以一對一或二對一合籠方式交配。每日早晨檢查陰道中有無精子或陰栓的動物，以檢出之日定為妊娠0日，并從即日起將該動物單籠飼養(yǎng)。16．9．3交配（合籠）期以3周為限，對屆時仍未交配（陰道中迄未發(fā)現(xiàn)精子或陰栓）的動物，改換配偶重新交配，以確定未能交配問題屬于雌方或雄方；必要時對不交配動物的生殖器官進(jìn)行病理組織學(xué)或發(fā)情周期、精子形成周期等的檢查，以進(jìn)一步研究試驗對動物繁殖可能產(chǎn)生的影響和毒性。16．10對動物分娩前后的觀察和處理16．10．1對雌性動物交配、妊娠和授乳期連續(xù)給藥。16．10．2所有雄性動物在交配后均處死觀察。16．10．3妊娠動物要單籠飼養(yǎng)，并在分娩前給予造窩材料。16．11對新生幼仔的觀察和處理16．11．1對每一妊娠動物要在分娩后，盡快查清幼仔數(shù)、死產(chǎn)仔數(shù)、活產(chǎn)仔數(shù)以及幼仔外觀有無異常和畸形。16．11．2檢查記錄幼仔出生當(dāng)時及生后4、7、14和21d的體重、身長和尾長以及一窩幼仔出生當(dāng)時和生后4d的總體重。16．11．3幼仔出生后第4d高速留取數(shù)。即每窩隨機留取幼仔雌雄各4只，雌或雄幼仔有不足4只者，則總數(shù)留取8只，幼仔總數(shù)不足8只者，則全部留取。此外多余幼仔當(dāng)時處理掉。16．12動物剖檢對下列試驗動物在處死后立即進(jìn)行解剖，并對生殖系統(tǒng)進(jìn)行肉眼病理檢查。16．12．1所有劑量組與對照組交配后處死的雄性動物，每組隨機抽取不少于6只。16．12．2所有劑量組對對照組在給仔代授乳后處死的雌性動物，每組隨機抽取不少于6只。16．12．3所有劑量組與對照組在斷奶后不用于交配而處死的雌雄性動物，每組至少隨機抽取雌雄性動物各不少于6只。16．12．4試驗中途死亡或瀕死處理的所有動物都應(yīng)剖檢。16．13病理組織學(xué)檢查16．13．1對上項剖檢的所有動物，均須在剖檢中留取下列組織器官的病理組織學(xué)檢查標(biāo)本：陰道、子宮、卵巢、睪丸、附睪、精囊、前列腺和腦下垂體。16．13．2對上項標(biāo)本的最高劑量組和陰性對照組（也包括如果設(shè)有的陽性對照組及溶劑、添加物和賦形劑對照組）的動物標(biāo)本以及剖檢中發(fā)現(xiàn)有意義病變的組織和器官的相應(yīng)標(biāo)本，均須作切片鏡檢。16．13．3如最高劑量組沒有發(fā)現(xiàn)有意義的病變，則中、低劑量組的相應(yīng)動物和器官標(biāo)本可不必制片鏡檢，也無須繼續(xù)保存。16．13．4在項動物中發(fā)現(xiàn)有意義的病變時，對與之有聯(lián)系的組織和器官標(biāo)本，要參考最高劑量組動物標(biāo)本的檢查結(jié)果，決定是否有必要進(jìn)一步檢查。16．14繁殖指數(shù)指標(biāo)16．14．1交配成功率按式（9）計算：交配成功率（%）=交配成功動物數(shù)/用于交配的雌動物數(shù)x100..............................................(9)注：交配成功指陰道中檢出精子或陰栓者。16．14．2受孕率按式（10）計算：受孕率（%）=受孕動物數(shù)/用于交配的雌性動物數(shù)x100.............................................................(10)16．14．3活產(chǎn)率按式（11）計算：活產(chǎn)率按式(%)=產(chǎn)生活仔的雌性動物數(shù)/受孕動物數(shù)x100..........................................................(11)16．14．4出生存活率按式（12）計算：出生存活率(%)=出生后4d幼仔存活數(shù)/受孕動物數(shù)x100...............................................................(12)16．14．5哺育成活率按式（13計算：哺育成活率(%)=21d斷奶時幼仔成活數(shù)/出生后4d幼仔存活數(shù)x100............................................(13)16．15結(jié)果評定按各項指標(biāo)，逐一比較試驗組動物組動物與對動物之間的差異顯著性，以評定試驗農(nóng)藥對試驗動物有無繁殖毒性，同時還可根據(jù)統(tǒng)計學(xué)差異出現(xiàn)在哪個指標(biāo)，進(jìn)一步估計繁殖毒性的損害作用特點。17致癌試驗17．1目的通過一定途徑給予試驗動物不同劑量的試驗農(nóng)藥，觀察動物在接近終生的時間內(nèi)（一般大鼠的試驗時間為兩年，小鼠為18個月）腫瘤發(fā)生的情況，以評定長期接觸試驗農(nóng)藥對整體動物的致癌性。17．2試驗農(nóng)藥用原藥，并要求多次抽樣實測，以保證其穩(wěn)定性。所用飼料需具有合格證，以確保無黃曲霉毒素或其他可能致癌物。17．3實驗動物17．3．1種屬和品系首選大鼠或小鼠。特殊情況下可選擇其他動物，但應(yīng)闡明原因。17．3．2性別一般使用兩種性別，雌雄各半。17．3．3年齡和體重用4~6周齡斷奶不久的健康動物開始實驗。體重差異不超過平均體重的10%。17．3．4數(shù)量應(yīng)滿足統(tǒng)計學(xué)要求。大鼠、小鼠每劑量組至少50只雌性和50只雄性動物。如試驗期間計劃提前剖殺一些動物，應(yīng)在實驗開始時相應(yīng)增加。17．4劑量分組一般設(shè)三個劑量組和一個對照組。17．4．1高劑量組可使實驗動物產(chǎn)生輕度毒性反應(yīng)，如體重增長輕度抑制（大于10%），但不應(yīng)明顯改變動物除腫瘤因素外的正常壽命期限。17．4．2低劑量組不影響動物的正常生長、發(fā)育和壽命，即不引起任何毒性效應(yīng)。但應(yīng)高于人的接觸劑量。一般不低于高劑量的10%。17．4．3中劑量組在高劑量和低劑量之間，一般不低于高劑量組的10%。如有可能按試驗農(nóng)藥的薌動力學(xué)來確定。17．4．4對照組除不接觸試驗農(nóng)藥外，其他應(yīng)與試驗組相同，試驗農(nóng)藥為制劑時，還應(yīng)設(shè)助劑或添加劑對照。17．5給藥途徑經(jīng)口是致癌試驗常用的給藥途徑，必要時可采用經(jīng)皮或吸入途徑。17．5．1經(jīng)口a．給藥方式：一般采用將試驗農(nóng)藥放于飼料或飲水中連續(xù)給予動物，7d/周。放入試驗農(nóng)藥的飼料或飲水，應(yīng)不影響動物的正常攝入量。若因適口性不良影響攝入量時，可用管飼法。b．放入飼料或飲水中的試驗農(nóng)藥濃度應(yīng)定期監(jiān)測，觀察其均勻性和穩(wěn)定性。除營養(yǎng)素外，混入飼料中的試驗農(nóng)藥的最高濃度一般應(yīng)不超過5%。17．5．2經(jīng)皮a．染毒面積：一般約相當(dāng)動物體表面積的10%左右，小鼠約為5~10cm2，大鼠約為20~50cm2，高毒性物質(zhì)可略減。必須保證試驗農(nóng)藥與皮膚良好接觸，并防止動物舔食。b．給藥頻率：每天一次，每周3~7次。17．5．3吸入a．給藥時間：每天4h，每周5~7d。b．染毒柜空氣中氧含量不得低于19%，換氣指數(shù)大于6~10次/h，溫度22±2℃，相對濕度40%~70%（水劑除外）。c．染毒柜內(nèi)試驗農(nóng)藥濃度，應(yīng)定期或連續(xù)監(jiān)測，其分布應(yīng)均勻、恒定。固體試驗農(nóng)藥尚應(yīng)測定其顆粒的分散度。17．6試驗期限17．6．1致癌試驗期間必須包手試驗動物正常生命期的大部分，甚至終生。一般情況下，小鼠18個月，大鼠24個月，某些生命期較長，自發(fā)腫瘤率低的動物品系，試驗期可適當(dāng)延長至小鼠24個月，大鼠30個月。17．6．2當(dāng)?shù)蛣┝拷M或?qū)φ战M存活動物少于或等于25%時，應(yīng)提前結(jié)束試驗，但有明顯性別差異時，不同性別的動物試驗時間可以不同。高劑量組因毒作用而過早死亡時，仍可繼續(xù)試驗。17．6．3一個合格的致癌試驗，在試驗期結(jié)束時，對照組存活數(shù)不應(yīng)少于50%。各組因死后組織自溶，被同類動物吃掉或管理不善造成試驗動物損失不可超過10%。17．7臨床觀察和檢查17．7．1所有動物的外觀體征、行為活動、糞便性狀等檢查，應(yīng)每天一次。根據(jù)試驗需要，尤其在試驗后期，每天還應(yīng)增加數(shù)次有目的觀察，以便及時發(fā)現(xiàn)毒作用。如有動物死亡或瀕死，應(yīng)及時解剖，減少試驗動物損失率。17．7．2記錄所有動物出現(xiàn)的中毒癥狀或死亡情況，尤其應(yīng)詳細(xì)記錄每個腫瘤的首次發(fā)現(xiàn)時間、部位、大小、外形、硬度和發(fā)展情況等。17．7．3在試驗最初3個月內(nèi)，每周測量一次體重、飼料攝入量和試驗農(nóng)藥溶于飲水時的飲水量，以后每月一次。17．7．4試驗期間如動物健康惡化，應(yīng)進(jìn)行白細(xì)胞計數(shù)。在實驗結(jié)束時，所有處死動物都應(yīng)做血涂片。高劑量組和對照組還要進(jìn)行白細(xì)胞分類計數(shù)。當(dāng)有差別時，進(jìn)行其他劑量組的白細(xì)胞分類計數(shù)。17．8病理檢查17．8．1大體解剖17．8．1．1所有試驗動物，包括試驗過程中死亡或瀕死而處死的動物及試驗期滿處死的動物都應(yīng)進(jìn)行解剖和全面的系統(tǒng)的肉眼觀察。觀察所見的腫瘤和可穎病變部位都應(yīng)留樣，進(jìn)一步作組織學(xué)檢查。17．8．1．2所有動物的全部臟器和組織都應(yīng)留樣、固定，供進(jìn)一步系統(tǒng)檢驗用。一般留樣的臟器和組織包括：腦、垂體、甲狀腺（包括甲狀旁腺）、胸腺、肺（包括氣管）、心、唾液腺、肝、脾、腎、腎上腺、食管、胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、膀胱、淋巴結(jié)、胰腺、性腺、附性器官、乳腺、外周神經(jīng)、坐骨神經(jīng)、脊髓、胸骨或股骨、眼球。在吸入試驗時，尚應(yīng)包括：鼻腔、咽、喉等呼吸道。經(jīng)皮試驗時，應(yīng)包括與農(nóng)藥接觸的皮膚。17．8．2病理組織學(xué)檢查上述所有臟器和組織都應(yīng)進(jìn)行組織切片檢查，實施有困難時，可選擇性進(jìn)行鏡檢，但是對下列情況必須進(jìn)行鏡檢：17．8．2．1大體解剖時所見的腫瘤或可疑病變組織。17．8．2．1試驗過程中死亡或因病提前處死的所有動物及高劑量組和對照組的全部動物。17．8．2．2試驗過程中死亡或因病提前處死的所有動物及高劑量組和對照組的全部動物。17．8．2．3如高劑量組和對照組的腫瘤、瘤前病變或增生發(fā)生率有明顯差別時，則各劑量組所有動物的有關(guān)器官和組織都要檢查。17．8．2．4如高劑量組存活動物明顯少于對照組，或產(chǎn)生一些影響腫瘤發(fā)生的毒作用時，則中劑量組亦應(yīng)按上述高劑量組一樣進(jìn)行統(tǒng)檢。17．9結(jié)果評定根據(jù)各組的腫瘤及惡性腫瘤發(fā)生率、潛伏期和多發(fā)性等進(jìn)行全面評定。17．9．1腫瘤發(fā)生率腫瘤發(fā)生率是指試驗終了時患瘤動物總數(shù)在有效動物總數(shù)中所占的百分率，按式（14）計算：腫瘤發(fā)生率(%)=患瘤動物總數(shù)/有效動物總數(shù)x100.....................................................................(14)17．9．2結(jié)果判定凡符合下列情況之一，并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理有顯著差異者，可認(rèn)為致癌試驗結(jié)果陽性。若存在劑量反應(yīng)關(guān)系，則判斷陽性更可靠。17．9．2．1腫瘤僅發(fā)生在染毒組，對照組無此類型腫瘤。17．9．2．2染毒組和對照組均發(fā)生腫瘤，但染毒組發(fā)生率明顯高于對照組。17．9．2．3染毒組中動物多發(fā)性腫瘤明顯，對照組中多發(fā)性或只有少數(shù)動物有多發(fā)性腫瘤。17．9．2．4染毒組與對照組腫瘤發(fā)生率無顯著差異，但染毒組腫瘤發(fā)生時間較早。17．9．3染毒組和對照組腫瘤發(fā)生率差別不明顯，但癌前期病變差別顯著時，不能輕易否定試驗農(nóng)藥的致癌性。17．9．4自發(fā)性腫瘤一般只出現(xiàn)于生命較晚期和好發(fā)于內(nèi)分泌腺或與內(nèi)泌功能有密切聯(lián)系的組織，如垂體、腎上腺、睪丸及乳腺等。18慢性毒性試驗18．1目的通過一定途徑長期、反復(fù)給予試驗動物不同劑量的試驗農(nóng)藥，觀察試驗動物除腫瘤外的慢性毒性效應(yīng)、嚴(yán)重程度、靶器官和損害的可逆性。確定無作用劑量（濃度），為擬定人類接觸試驗農(nóng)藥的每日容許攝入量（ADI）提供依據(jù)。慢性毒性試驗亦可與致癌試驗在同一批動物中聯(lián)合進(jìn)行（見第19章）。18．2試驗農(nóng)藥原藥（具體要求見17.2）。18．3試驗動物18．3．1種屬和品系首選大鼠。需要時可增加一種非嚙齒類哺乳動物。18．3．2性別一般使用兩種性別，雌雄各斗。18．3．3年齡和體重用剛斷奶的健康動物開始試驗。大鼠一般用4~6周齡。同性別體重差異不大于平均體重的10%。18．3．4數(shù)量應(yīng)滿足觀察指標(biāo)的統(tǒng)計學(xué)要求。在試驗結(jié)束時，各劑量組每種性別大鼠不少于10只。非嚙齒類不少于4只。18．4劑量分組一般設(shè)三個劑量組和一個對照組。18．4．1高劑量組使動物產(chǎn)生較明顯的毒性效應(yīng)，甚至個別動物死亡。18．4．2中劑量組使動物產(chǎn)生輕微的毒性效應(yīng)。若設(shè)多個中劑量組，則應(yīng)產(chǎn)生不同程度的毒性效應(yīng)。18．4．3低劑量組不應(yīng)產(chǎn)生毒性效應(yīng)。18．4．4對照組除不接觸試驗農(nóng)藥外，其他與試驗組相同。當(dāng)試驗農(nóng)藥為制劑，其助劑、添加劑等的生物活性不清楚時，還應(yīng)設(shè)相應(yīng)的助劑對照組。18．5給藥途徑一般采用經(jīng)口。18．6給藥方式一般把試驗農(nóng)藥混入飼料或溶于飲水，連續(xù)給予動物，每周5~7d。放入試驗農(nóng)藥后，若飼料和飲水的適口性不良，影響動物正常攝入量時，則可用管飼法。除營養(yǎng)素外，混入飼料的試驗農(nóng)藥的最高濃度一般不超過5%。飼料或飲水中的試驗農(nóng)藥濃度應(yīng)定期監(jiān)測，觀察其均勻性和穩(wěn)定性。18．7試驗期限大鼠24個月，小鼠18個月。18．8臨床觀察和檢查18．8．1臨床觀察外觀體征、行為活動和糞便形狀等每天逐個觀察。詳細(xì)記錄毒性效應(yīng)出現(xiàn)時間和變化，如發(fā)現(xiàn)死亡或瀕死動物應(yīng)及時解剖。體重和食物消耗量在試驗的前13周內(nèi)，每周測量一次，以后如動物健康狀況或體重等無異常改變，則每月測量一次。18．8．2血液學(xué)檢查檢查指標(biāo)包括紅細(xì)胞計數(shù)、白細(xì)胞計數(shù)及其分類、血紅蛋白含量等。實驗開始后每隔6個月及結(jié)束時各檢查一次。每次檢查各劑量組雌雄大鼠各10只。非嚙齒類動物則全部檢查。18．9病理學(xué)檢查18．9．1系統(tǒng)解剖所有試驗動物，包括試驗過程中死亡動物都應(yīng)進(jìn)行完整系統(tǒng)解剖和詳盡的肉眼觀察。所有肉眼可見的病變或可疑病變組織都應(yīng)留樣固定，作進(jìn)一步組織學(xué)檢查。18．9．2臟器重復(fù)稱取腦、心、肺、肝、脾、腎、腎上腺、睪丸等臟器重量并計算其臟器系數(shù)（臟器重/體重×100%）。18．9．3組織學(xué)檢查對照組和高劑量組動物及系統(tǒng)解剖時發(fā)現(xiàn)的異常組織均需作詳盡的組織學(xué)檢查。其他劑量組一般僅在高劑量組有異常發(fā)現(xiàn)時才進(jìn)行組織學(xué)檢查。檢查臟器一般包括腦、脊髓、心、肺、肝、脾、腎、胰、胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、膀胱、腎上腺、垂體、甲狀腺（包括甲狀旁腺）、胸腺、睪丸、附睪、前列腺、卵巢、子宮、乳腺、皮膚、肌肉、骨、淋巴結(jié)、眼球等。18．10根據(jù)試驗農(nóng)藥的毒作用特點，可對血液生化項目和病理學(xué)檢查臟器作適當(dāng)增減。19慢性毒性與致癌合并試驗19．1目的將試驗農(nóng)藥長期反復(fù)給予試驗動物，同時觀察對試驗動物的慢性毒性作用和致腫瘤作用，確定慢性毒性的最大無作用劑量和致癌的可能性。19．2試驗農(nóng)藥原藥（具體要求見17.2）。19．3試驗農(nóng)藥19．3．1種屬和品系首選大鼠。19．3．2性別、年齡和體重選用雌雄各半、斷奶不久的4~6周齡的健康動物，同性動物體重差異不超過平均體重的10%。19．3．3數(shù)量各劑量組雌雄動物均50只以上，如試驗期間計劃提前剖殺一些動物，試驗開始