顯微攝影技術(shù)

顯微攝影技術(shù)第一頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三什么是顯微攝影？

顯微攝影：利用攝影裝置（傳統(tǒng)相機(jī)、數(shù)碼相機(jī)、專用CCD等）拍攝顯微鏡視野中所觀察到的物像。影像質(zhì)量取決于：樣本制作質(zhì)量；顯微鏡光學(xué)性能；攝影裝置性能；操作者技術(shù)水平。第二頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三內(nèi)容光學(xué)顯微鏡的種類及結(jié)構(gòu)特征光學(xué)顯微鏡主要光學(xué)部件及性能與顯微攝影有關(guān)的基本光學(xué)概念顯微攝影系統(tǒng)的基本構(gòu)成顯微攝影基本操作程序影響顯微成像質(zhì)量的因素第三頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三光學(xué)顯微鏡種類及結(jié)構(gòu)特征按照其光路結(jié)構(gòu)、分辨模式：正置顯微鏡倒置顯微鏡體視鏡偏光鏡等；按照其照明光源性質(zhì)：可見(jiàn)光（明視場(chǎng)、弱視場(chǎng)）熒光（紫外、紅外）顯微鏡激光共聚焦顯微鏡光譜顯微鏡；按機(jī)械部件的控制方式：手動(dòng)電動(dòng)和全自動(dòng)顯微鏡。第四頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三光學(xué)顯微鏡的種類及結(jié)構(gòu)特征明視場(chǎng)（可見(jiàn)光）照明光源采用普通燈泡或鹵素?zé)?，主要用于常?guī)染色組織標(biāo)本的觀察：組織化學(xué)染色樣本免疫組織化學(xué)染色樣本；弱視場(chǎng)包括相差（又稱相忖）、霍夫曼、微分干涉和偏光等，照明光源與明視場(chǎng)通用，但在光路上插入不同的光學(xué)部件，降低背景光強(qiáng)度，增強(qiáng)被觀察物體的光反差，提高對(duì)透明樣本的觀察能力，主要用于活組織未染色樣本的觀察。第五頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三光學(xué)顯微鏡的種類及結(jié)構(gòu)特征熒光顯微鏡：照明光源采用汞燈或高能氙燈，通過(guò)不同的濾光片組合獲得不同波段的激發(fā)/發(fā)射光，用于熒光染色標(biāo)本的觀察。由于冷光源技術(shù)（金屬鹵素?zé)簦┑拈_(kāi)發(fā)及熒光蛋白技術(shù)的日臻成熟，已逐漸克服了強(qiáng)光源對(duì)組織的灼傷及活組織熒光顯色等技術(shù)瓶頸，使熒光顯微技術(shù)在活組織樣本觀察中獲得了廣泛的應(yīng)用。

第六頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三光學(xué)顯微鏡的種類及結(jié)構(gòu)特征激光共聚焦顯微鏡：

利用單色高能激光對(duì)觀測(cè)樣本進(jìn)行逐點(diǎn)、多焦面掃描，通過(guò)計(jì)算機(jī)處理合成高清晰圖像。光譜顯微鏡：采用多濾片組合或分光技術(shù)，獲得連續(xù)激發(fā)/發(fā)射光譜，用于熒光掃描、熒光萃滅、熒光能量轉(zhuǎn)移等細(xì)胞動(dòng)力學(xué)觀察第七頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三內(nèi)容光學(xué)顯微鏡的種類及結(jié)構(gòu)特征光學(xué)顯微鏡主要光學(xué)部件及性能與顯微攝影有關(guān)的基本光學(xué)概念顯微攝影系統(tǒng)的基本構(gòu)成顯微攝影基本操作程序影響顯微成像質(zhì)量的因素第八頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三光學(xué)顯微鏡主要光學(xué)部件及性能透鏡及其性能顯微鏡成像原理影響成像的關(guān)鍵因素—相差主要光學(xué)部件及性能光學(xué)顯微鏡相關(guān)參數(shù)第九頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三透鏡及其性能透鏡（lens):透鏡是由透明物質(zhì)（如玻璃等）制成的一種光學(xué)元件。透鏡是折射鏡，其折射面是兩個(gè)球面，或一個(gè)球面一個(gè)平面。它所成的像有實(shí)像也有虛像。透鏡一般可以分為兩大類：凸透鏡和凹透鏡。中央部分比邊緣部分厚的叫凸透鏡，有雙凸、平凸、凹凸三種；中央部分比邊緣部分薄的叫凹透鏡，有雙凹、平凹、凸凹三種。第十頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三凸透鏡具有會(huì)聚光線的作用，所以也叫會(huì)聚透鏡。凹透鏡具有發(fā)散光線的作用，所以也叫發(fā)散透鏡。透鏡是組成顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的最基本的光學(xué)元件，物鏡、目鏡及聚光鏡等部件均由單個(gè)或多個(gè)透鏡組成。虛像/實(shí)像：光線通過(guò)凹透鏡后，成正立虛像，而凸透鏡則成正立實(shí)像。實(shí)像可在屏幕上顯現(xiàn)出來(lái)，而虛像不能。第十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三焦點(diǎn)與焦平面：

當(dāng)一束平行于光軸的光線通過(guò)凸透鏡后相交于一點(diǎn)，這個(gè)點(diǎn)稱“焦點(diǎn)”；通過(guò)交點(diǎn)并垂直光軸的平面，稱“焦平面”。焦點(diǎn)有兩個(gè)，在物方空間的焦點(diǎn)，稱“物方焦點(diǎn)”，該處的焦平面，稱“物方焦平面”；反之，在像方空間的焦點(diǎn)，稱“像方焦點(diǎn)”，該處的焦平面，稱“像方焦平面”。第十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三光學(xué)顯微鏡主要光學(xué)部件及性能透鏡及其性能顯微鏡的成像原理影響成像的關(guān)鍵因素—相差主要光學(xué)部件及性能光學(xué)顯微鏡相關(guān)參數(shù)第十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三顯微鏡的成像原理a.當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以外時(shí)，則在像方二倍焦距以內(nèi)、焦點(diǎn)以外形成縮小的倒立實(shí)像；b.當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距上時(shí)，則在像方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實(shí)像；c.當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以內(nèi)，焦點(diǎn)以外時(shí)，則在像方二倍焦距以外形成放大的倒立實(shí)像；d.當(dāng)物體位于透鏡物方焦點(diǎn)上時(shí)，則像方不能成像；e.當(dāng)物體位于透鏡物方焦點(diǎn)以內(nèi)時(shí)，則像方也無(wú)像的形成，而在透鏡物方的同側(cè)比物體遠(yuǎn)的位置形成放大的直立虛像。第十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三

顯微鏡的成像原理就是利用上述（c）和（e）的規(guī)律把物體放大的。當(dāng)物體處在物鏡前F-2F（F為物方焦距）之間，則在物鏡像方的二倍焦距以外形成放大的倒立實(shí)像。在顯微鏡的設(shè)計(jì)上，將此像落在目鏡的一倍焦距F1之內(nèi)，使物鏡所放大的第一次像（中間像），又被目鏡再一次放大，最終在目鏡的物方（中間像的同側(cè)）、人眼的明視距離（250mm）處形成放大的直立（相對(duì)中間像而言）虛像。因此，當(dāng)我們?cè)阽R檢時(shí)，通過(guò)目鏡（不另加轉(zhuǎn)換棱鏡）看到的像于原物體的像，方向相反。

第十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三光學(xué)顯微鏡主要光學(xué)部件及性能透鏡及其性能顯微鏡的成像原理影響成像的關(guān)鍵因素—相差主要光學(xué)部件及性能光學(xué)顯微鏡相關(guān)參數(shù)第十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三影響成像的關(guān)鍵因素—相差

色差（Chromatic

aberration）：

色差是透鏡成像的一個(gè)嚴(yán)重缺陷，發(fā)生在以多色光為光源的情況下，單色光不產(chǎn)生色差。白光由紅

橙

黃

綠

青

藍(lán)

紫

七種組成，各種光的波長(zhǎng)不同

，所以在通過(guò)透鏡時(shí)的折射率也不同，這樣物方一個(gè)點(diǎn)，在像方則可能形成一個(gè)色斑。

色差一般有位置色差，放大率色差。位置色差使像在任何位置觀察，都帶有色斑或暈環(huán)，使像模糊不清。而放大率色差使像帶有彩色邊緣。第十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三

球差(Spherical

aberration)：

球差是軸上點(diǎn)的單色相差，是由于透鏡的球形表面造成的。球差造成的結(jié)果是，一個(gè)點(diǎn)成像后，不再是個(gè)亮點(diǎn)，而是一個(gè)中間亮

邊緣逐漸模糊的亮斑。從而影響成像質(zhì)量。

球差的矯正常利用透鏡組合來(lái)消除，由于凸、凹透鏡的球差是相反的，可選配不同材料的凸凹透鏡膠合起來(lái)給予消除。舊型號(hào)顯微鏡，物鏡的球差沒(méi)有完全矯正，應(yīng)與相應(yīng)的補(bǔ)償目鏡配合，才能達(dá)到糾正效果。一般新型顯微鏡的球差完全由物鏡消除。第十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三慧差(Coma)：

慧差屬軸外點(diǎn)的單色相差。軸外物點(diǎn)以大孔徑光束成像時(shí)，發(fā)出的光束通過(guò)透鏡后，不再相交一點(diǎn)，則一光點(diǎn)的像便會(huì)得到一逗點(diǎn)壯，型如慧星，故稱“慧差”。像散（Astigmatism）：

像散也是影響清晰度的軸外點(diǎn)單色相差。當(dāng)視場(chǎng)很大時(shí)，邊緣上的物點(diǎn)離光軸遠(yuǎn)，光束傾斜大，經(jīng)透鏡后則引起像散。像散使原來(lái)的物點(diǎn)在成像后變成兩個(gè)分離并且相互垂直的短線，在理想像平面上綜合后，形成一個(gè)橢圓形的斑點(diǎn)。像散是通過(guò)復(fù)雜的透鏡組合來(lái)消除。第十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三場(chǎng)曲（Curvature

of

field）：

場(chǎng)曲又稱“像場(chǎng)彎曲”。當(dāng)透鏡存在場(chǎng)曲時(shí)，整個(gè)光束的交點(diǎn)不與理想像點(diǎn)重合，雖然在每個(gè)特定點(diǎn)都能得到清晰的像點(diǎn)，但整個(gè)像平面則是一個(gè)曲面。這樣在鏡檢時(shí)不能同時(shí)看清整個(gè)相面，給觀察和照相造成困難。因此研究用顯微鏡的物鏡一般都是平場(chǎng)物鏡，這種物鏡已經(jīng)矯正了場(chǎng)曲。畸變（Distortion）：

前面所說(shuō)各種相差除場(chǎng)曲外，都影響像的清晰度。畸變是另一種性質(zhì)的相差，光束的同心性不受到破壞。因此，不影響像的清晰度，但使像與原物體比，在形狀上造成失真。第二十頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三光學(xué)顯微鏡主要光學(xué)部件及性能透鏡及其性能顯微鏡的成像原理影響成像的關(guān)鍵因素—相差主要光學(xué)部件及性能光學(xué)顯微鏡相關(guān)參數(shù)第二十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三主要光學(xué)部件及性能物鏡（objective）:物鏡是顯微鏡最主要的光學(xué)部件，顯微鏡的分辯力主要取決于物鏡的數(shù)值孔徑（鏡口率，numericalaperture,NA）。目前常見(jiàn)物鏡：消色差物鏡、復(fù)消色差物鏡、半復(fù)消色差物鏡、平場(chǎng)消色差物鏡。第二十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三數(shù)值孔徑(NA)數(shù)值孔徑（numericalaperture,NA），是物鏡和聚光鏡的重要技術(shù)參數(shù)，是判斷光學(xué)元件性能的重要標(biāo)志。它是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質(zhì)的折射率(η(Eta))和孔徑角(u(upsilon))半數(shù)的正弦之乘積。用公式表示如下：NA=ηsinu/2。第二十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三消色差物鏡（achromaticobjective,Ach）。這是一種常見(jiàn)的物鏡，物鏡外殼上不列代表標(biāo)志。物鏡把光譜中紅藍(lán)光聚焦于一點(diǎn)，黃綠光聚焦于一點(diǎn)，最清晰范圍為510～630納米。這種物鏡一般不適宜作攝影用，如加黃綠濾光鏡，可獲得較為清晰的照片。第二十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三復(fù)消色差物鏡（apochromaticobjective,Apo）。這種物鏡能把光鏡中紅、藍(lán)、黃光聚焦于一點(diǎn)，糾正了紅藍(lán)光的色差和黃綠光的球差，最佳清晰范圍為400～720納米。這種物鏡適用于在任何色光下或加用各色濾色鏡進(jìn)行觀察攝影，適用于彩色攝影。但Apo物鏡殘留有像場(chǎng)彎曲，使平面物體形成類似球面的彎曲影像，結(jié)果使視野中心和邊緣的影像不能同時(shí)聚焦，拍出的底片中心清晰，邊緣模糊或者相反。第二十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三半復(fù)消色差物鏡（熒光石鏡，fluoriteobjective,Fl）。最佳清晰范圍430～680納米，色差校正介于消色差物鏡與復(fù)消色差物鏡之間。平場(chǎng)消色差物鏡(planachromaticobjective,lp)。這種物鏡糾正了以上三種物鏡的缺陷，校正了像場(chǎng)彎曲，不存在視野中心與邊緣不能同時(shí)準(zhǔn)焦的現(xiàn)像。由于影像展開(kāi)，在同樣倍數(shù)下，影像要比一般物鏡的影像大。平場(chǎng)消色差物鏡有多種類型，外殼上刻有plan.Apo。平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡是最佳物鏡。第二十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三物鏡標(biāo)識(shí)物鏡色差程度：Apo(復(fù)消色差物鏡)Fl(熒石物鏡)plan或pl(平場(chǎng)消色差物鏡)。放大倍數(shù)/數(shù)字孔徑：2.5，4（5），10/0.25，20，40/0.65，63，100/1.25。標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械筒長(zhǎng)：160mm或170mm。蓋玻片厚：0.17mm，常以170mm/0.17mm表示，載玻片厚小于1.2mm。物鏡與被檢樣品的介質(zhì)：干燥系物鏡無(wú)標(biāo)志；油浸鏡標(biāo)有OIL、OEL、HL或IMM字樣；水浸鏡標(biāo)為W；甘油為Glyz。第二十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三目鏡(eyepiece)目鏡是位于實(shí)像和肉眼間的放大鏡，將物像進(jìn)行第二次放大，并糾正物鏡造成的像差和色差。目鏡由兩片（組）透鏡組成，其中，場(chǎng)透鏡可使視野邊緣的成像光線向內(nèi)折射，進(jìn)入眼透鏡中，使物體的影像均勻明亮，眼透鏡決定放大倍數(shù)和成像的優(yōu)劣。目鏡筒內(nèi)裝有以金屬光闌，物鏡放大后的中間像就落在金屬光闌平面處。從目鏡中透出來(lái)的光線在目鏡外相交，這個(gè)相交點(diǎn)稱為眼點(diǎn)（eyepoint）。觀察時(shí)眼睛應(yīng)在眼點(diǎn)位置上，這樣才能接收從目鏡射出的全部光線，看到最大的視場(chǎng)，否則會(huì)造成圖像晃動(dòng)和不適的感覺(jué)，影響觀察效果。第二十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三目鏡(eyepiece)由前述已知顯微鏡的分辨能力是由物鏡的數(shù)字孔徑所決定的，而目鏡只是起到放大作用。因此，對(duì)于物鏡不能分辯出的細(xì)微結(jié)構(gòu)，目鏡放得再大，也仍然不能辨認(rèn)。目鏡有標(biāo)準(zhǔn)型和廣視場(chǎng)型。按用途又分為觀察目鏡、照相目鏡和取景目鏡。照相目鏡專供顯微照相之用，它是一種負(fù)焦目鏡，眼點(diǎn)位于目鏡內(nèi)，因而不能用于觀察。它的特點(diǎn)是視場(chǎng)平坦，可校正物鏡的殘留色差，使投射到感光片（或CCD）上的圖像四周與中心都盡可能在一個(gè)焦點(diǎn)平面上。照相目鏡用于顯微照相，其放大率不高，一般在2.5～6.7倍之間。照相目鏡外側(cè)或端面刻有“PHOTO”、“FK”、“NFK”字樣。第二十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三目鏡與物鏡的組合物鏡放大倍數(shù)1040100物鏡數(shù)值孔徑0.250.651.25有效放大倍數(shù)125～250325～650625～1250目鏡放大倍數(shù)12.5～258～166～12.5

顯微鏡的有效放大率為所用物鏡數(shù)值孔徑的500～1000倍。目鏡與物鏡組合前提是使放大倍數(shù)在有效放大率范圍內(nèi)。在有效放大率前提下，要提高對(duì)物像細(xì)節(jié)的分辯能力和清晰度，必須使用高數(shù)值孔徑的物鏡和低倍目鏡的組合。第三十頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三目鏡和物鏡的組合當(dāng)所選目鏡的放大倍數(shù)低于有效放大倍數(shù)時(shí)，會(huì)造成物鏡本來(lái)可以辨認(rèn)的細(xì)節(jié)因總的放大倍數(shù)太小而擠在一起，難以分辯。當(dāng)所選目鏡的放大倍數(shù)高于有效放大倍數(shù)時(shí)，所得放大倍數(shù)叫“空的放大”，影像細(xì)節(jié)的分辯能力沒(méi)有提高。在有效放大率前提下，要提高對(duì)物像細(xì)節(jié)的分辯能力和清晰度，必須使用高數(shù)值孔徑的物鏡和低倍目鏡的組合。第三十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三目鏡和物鏡的組合例如數(shù)值孔徑為1.3的物鏡（標(biāo)記為100/1.3）與放大倍數(shù)為4的目鏡組合，總放大倍數(shù)為400，若入射光為綠色光（550納米），分辯力為270納米。數(shù)值孔徑為0.65的物鏡（標(biāo)記為40/0.65）與放大倍數(shù)為10的目鏡組合，總放大倍數(shù)為400，λ＝550納米時(shí)分辯力為500納米。兩種組合結(jié)果，顯然第一種能提高物像分辯力。第三十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三不同照像目鏡/物鏡組合的效果照像目鏡的選擇：在物鏡的有效放大倍率內(nèi)，盡量?jī)?yōu)選低倍照像目鏡。第三十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三聚光器(condenser)第三十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三聚光器的主要作用是使光線集中于標(biāo)本，配合物鏡提高物像的分辯力。聚光鏡：聚光鏡由一至數(shù)片透鏡組成。聚光鏡有聚光作用，它的數(shù)值孔徑在0.25～1.40不等，聚光鏡的數(shù)值孔徑受孔徑光闌控制?？讖焦怅@：孔徑光闌的開(kāi)放與收縮，調(diào)節(jié)聚光鏡數(shù)值孔徑的大小，使圖像分辯力、反差和焦深處在最佳狀態(tài)。第三十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三顯微鏡的功能主要取決于物鏡的性能，而物鏡的性能又取決于物鏡的數(shù)值孔徑，物鏡的數(shù)值孔徑與聚光鏡的數(shù)值孔徑相關(guān)，兩者孔徑相等時(shí)，物鏡分辨力最高。但顯微攝影不同于一般攝影，其最大的區(qū)別是影像反差小、焦深淺，這兩點(diǎn)可隨孔徑光闌縮小而提高?？讖焦怅@小于物鏡的數(shù)值孔徑時(shí)，物鏡的分辯力的亮度降低，但影像反差和焦點(diǎn)深度提高，使影像更加清晰。所以，在不過(guò)多降低分辯力前提下，要將孔徑光闌數(shù)值調(diào)到所用物鏡數(shù)值孔徑的60％～80％。

第三十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三物鏡有效數(shù)值孔徑＝(物鏡NA+聚光鏡NA)/2第三十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三注意若顯微攝影的照明光線過(guò)強(qiáng)，可以改變燈的亮度（降低電壓），用深色濾光片或增加濾光片的數(shù)目。千萬(wàn)不要改變聚光器的位置或縮小光圈，否則會(huì)降低顯微鏡的分辯力。若被檢物為活體標(biāo)本或未染色標(biāo)本時(shí)，應(yīng)縮小孔徑光闌，加強(qiáng)明暗對(duì)比。但為了防止物鏡的分辯力的降低，必須加強(qiáng)照明光線的強(qiáng)度，但孔徑光闌數(shù)值一般不能小于物鏡孔徑光闌數(shù)值的60％。若聚光器外方?jīng)]有刻度時(shí)，可以在標(biāo)本調(diào)焦后，取下目鏡，眼睛離目鏡頭5～10厘米，左眼觀察鏡筒，邊看物鏡的后焦點(diǎn)平面，邊緩慢增大孔徑光闌，至物鏡后透鏡呈一明亮園時(shí)再將孔徑光闌適當(dāng)縮小（估計(jì)其為物鏡孔徑數(shù)值的2/3），然后放回目鏡。第三十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三視場(chǎng)光闌

視場(chǎng)光闌位于鏡座之中，用以控制照明光束的直徑，它根據(jù)物鏡的倍率給予不同直徑的光束面積。視場(chǎng)光闌過(guò)小，視野亮度不足，影像不清晰；視場(chǎng)光闌過(guò)大，光束直徑超出孔徑光闌，造成光線的亂反射，也影響影像的清晰度。第三十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三一般觀察時(shí)，應(yīng)先用聚光器上的調(diào)中螺旋把視場(chǎng)光闌調(diào)到視場(chǎng)中心位置，然后讓視場(chǎng)光闌多邊形光闌處于視場(chǎng)的外切位。顯微攝影時(shí)，視場(chǎng)光闌收縮至取景框邊緣的外方（但不能接觸取景框），此位可使圖像反差得到改善。如果視場(chǎng)光闌收縮得過(guò)于接近取景框時(shí)，則圖像的四角將被切去。因?yàn)閷?shí)際拍攝的視場(chǎng)范圍要比取景框略大一些。第四十頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三第四十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三視場(chǎng)光闌的配合使用根據(jù)不同倍率物鏡給予不同直徑的光束；避免散射光，增加圖像反差；適度：視場(chǎng)光闌像恰在取景框的外緣。過(guò)于接近或超過(guò)則會(huì)將圖像的四角切掉。第四十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三視場(chǎng)光闌配合使用第四十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三光學(xué)顯微鏡主要光學(xué)部件及性能透鏡及其性能顯微鏡的成像原理影響成像的關(guān)鍵因素—相差主要光學(xué)部件及性能光學(xué)顯微鏡相關(guān)參數(shù)第四十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三分辨率：顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區(qū)分的兩個(gè)物點(diǎn)的最小間距，又稱“鑒別率”。其計(jì)算公式是σ=λ/NA式中σ(sigma)為最小分辨距離；λ為射光線的波長(zhǎng)；NA為物鏡的數(shù)值孔徑?？梢?jiàn)物鏡的分辨率是由物鏡的NA值與照明光源的波長(zhǎng)兩個(gè)因素決定。放大率和有效放大：物像經(jīng)過(guò)物鏡和目鏡的兩次放大，所以顯微鏡總的放大率是物鏡放大率和目鏡放大率的乘積,顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率。第四十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三焦深：焦深為焦點(diǎn)深度的簡(jiǎn)稱，即在使用顯微鏡時(shí)，當(dāng)焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)某一物體時(shí)，不僅位于該點(diǎn)平面上的各點(diǎn)都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度內(nèi)，也能看得清楚，這個(gè)清楚部分的厚度就是焦深。焦深大,可以看到被檢物體的全層，而焦深小，則只能看到被檢物體的一薄層。視場(chǎng)直徑：所看到的明亮的圓形范圍叫視場(chǎng)，它的大小是由目鏡里的視場(chǎng)光闌決定的。視場(chǎng)直徑也稱視場(chǎng)寬度，是指在顯微鏡下看到的圓形視場(chǎng)內(nèi)所能容納被檢物體的實(shí)際范圍。視場(chǎng)直徑愈大，愈便于觀察。第四十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三覆蓋差：由于蓋玻片的厚度不標(biāo)準(zhǔn)，光線從蓋玻片進(jìn)入空氣產(chǎn)生折射后的光路發(fā)生了改變，從而產(chǎn)生了相差，這就是覆蓋差.國(guó)際上規(guī)定，蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度為0.17mm，許可范圍在0.16-0.18mm，在物鏡的制造上已將此厚度范圍的相差計(jì)算在內(nèi)。物鏡外殼上標(biāo)的0.17，即表明該物鏡所要求的蓋玻片的厚度。工作距離(WD)：工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。第四十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三內(nèi)容光學(xué)顯微鏡的種類及結(jié)構(gòu)特征光學(xué)顯微鏡主要光學(xué)部件及性能與顯微攝影有關(guān)的基本光學(xué)概念

顯微攝影系統(tǒng)的基本構(gòu)成顯微攝影基本操作程序影響顯微成像質(zhì)量的因素第四十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三折射和折射率折射：

光線在均勻的各向同性介質(zhì)中，兩點(diǎn)之間以直線傳播。當(dāng)光從一種介質(zhì)斜射入另一種介質(zhì)時(shí)，傳播方向發(fā)生變化，這種現(xiàn)像叫光的折射，這是由于光線在不同介質(zhì)的傳播速度不同造成的。折射光線與發(fā)線之間的夾角稱折射角，同理入射光線與法線之間的夾角稱入射角。光的折射規(guī)律：光從空氣斜射入水或其他介質(zhì)中時(shí)，折射光線與入射光線、法線在同一平面上，折射光線和入射光線分居法線兩側(cè)；折射角小于入射角；入射角增大時(shí)，折射角也隨著增大；當(dāng)光線垂直射向介質(zhì)表面時(shí)，傳播方向不變，在折射中光路可逆。第四十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三折射和折射率折射率：是表示同一光線在兩種（各向同性）介質(zhì)中光速比值的物理量。絕對(duì)折射率光從真空射入介質(zhì)發(fā)生折射時(shí)，入射角i與折射角r的正弦之比n叫做介質(zhì)的“絕對(duì)折射率”，簡(jiǎn)稱“折射率”。它表示光在介質(zhì)中傳播時(shí)，介質(zhì)對(duì)光的一種特征。相對(duì)折射率光從介質(zhì)1射入介質(zhì)2發(fā)生折射時(shí)，入射角θ1與折射角θ2的正弦之比n21叫做介質(zhì)2相對(duì)介質(zhì)1的折射率，即“相對(duì)折射率”。因此，“絕對(duì)折射率”可以看作介質(zhì)相對(duì)真空的折射率。第五十頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三色溫與白平衡黑體（blackbody）：黑體是一種可將落在其上的所有熱量吸收，而無(wú)損的轉(zhuǎn)化成為“光”向外輻射的理想物質(zhì)，輻射光的顏色成分與該黑體所受熱量值（溫度）相對(duì)應(yīng)。色溫（colourtemperature）：色溫是表示光顏色視覺(jué)印像的物理量，是量度和計(jì)算光線顏色成分的尺度。光源發(fā)射的光的顏色與黑體在某一溫度下輻射光色相同的光時(shí)，黑體的溫度即為該光源的色溫。色溫用開(kāi)氏溫標(biāo)表示（Kelvintemperaturescale.K）,K=℃+273.15。光源色溫不同，光色亦不同。第五十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三色溫與白平衡白平衡（WhiteBalance）：物體顏色會(huì)因投射光線顏色產(chǎn)生改變，在不同光線條件下拍攝出的圖像會(huì)有不同的色溫。白平衡就是在特定光線條件下，按視野中圖像特質(zhì)，找出白色區(qū)域，默認(rèn)為“白色”，并調(diào)整整個(gè)圖像紅綠藍(lán)三色的強(qiáng)度，以修正照射光線所造成的誤差，進(jìn)而解決色彩還原和色調(diào)處理等一系列問(wèn)題，使圖像的色調(diào)恢復(fù)到原色狀態(tài)。第五十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三開(kāi)氏溫標(biāo)示意圖越低的數(shù)值表示越“紅”，越高的數(shù)值表示越“藍(lán)”。紅和藍(lán)并不是光線本身顏色，只是表明光譜中的紅或藍(lán)成分較多。第五十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三不同光源環(huán)境的色溫表第五十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三內(nèi)容光學(xué)顯微鏡的種類及結(jié)構(gòu)特征光學(xué)顯微鏡主要光學(xué)部件及性能與顯微攝影有關(guān)的基本光學(xué)概念顯微攝影系統(tǒng)的基本構(gòu)成顯微攝影基本操作程序影響顯微成像質(zhì)量的因素第五十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三傳統(tǒng)光學(xué)顯微攝影系統(tǒng)第五十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)系統(tǒng)配置：◆萬(wàn)能研究級(jí)顯微鏡◆專用攝影頭◆定制高清晰度專用圖像采集卡◆進(jìn)口原裝攝影頭專用標(biāo)準(zhǔn)C接口◆高性能商用計(jì)算機(jī)◆專用圖像分析軟件

第五十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三顯微圖像分析系統(tǒng)第五十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三顯微熒光圖像分析系統(tǒng)第五十九頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三成像質(zhì)量要求BF：追求分辨率、色彩還原FL:追求敏感度定量分析：圖像可比性第六十頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三環(huán)境要求?無(wú)塵、無(wú)振動(dòng)；?避免強(qiáng)光照射-影響對(duì)焦準(zhǔn)確性；?房間照度不能過(guò)強(qiáng)，散射光、照明的眩光透過(guò)物鏡、聚光鏡等會(huì)反射到光路中，干擾正常成像；?無(wú)腐蝕性氣、物；?防潮、防霉。第六十一頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三軟件基本功能要求◆可充分利用WINDOWS系統(tǒng)資源，全面支持多種操作系統(tǒng)；◆可與顯微鏡聯(lián)動(dòng)或控制顯微鏡的相關(guān)功能；◆具有程序設(shè)計(jì)手段，可進(jìn)行分析過(guò)程的全自動(dòng)設(shè)置；◆悔步、重復(fù)功能，方便尋找最佳處理路徑；◆在線幫助；第六十二頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三圖像輸入：支持視窗平臺(tái)，支持模擬CCD、數(shù)字CCD、數(shù)字冷CCD、數(shù)碼相機(jī)、掃描儀等圖像攝入設(shè)備；支持多種圖像采集卡；支持JPEG、TIFF、BMP、GIF、PCX、DIB、EPS、WMF、TGA、WPG和部分非標(biāo)準(zhǔn)圖像格式；支持24/48位真彩色圖像采集；符合GB15445、美國(guó)ASTM112及ISO9276標(biāo)準(zhǔn)。第六十三頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三特征范圍選?。壕哂卸喾N圖像特征的選取工具（矩形框、圓形框和自畫任意框等），不限制多層彩色分割，圖像數(shù)學(xué)運(yùn)算。專業(yè)圖像處理與分析功能：包括色度調(diào)整，圖像變形，數(shù)字形態(tài)學(xué)處理，圖像增強(qiáng)，圖像匹配，紋理分析，特征識(shí)別等。具有顆粒自動(dòng)識(shí)別、粘連顆粒自動(dòng)切分功能，以利復(fù)雜圖像的準(zhǔn)確分析。第六十四頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三圖像參數(shù)測(cè)量圖像定量分析提供點(diǎn)、線、面積和角度測(cè)量四大類；提供多種的測(cè)量參數(shù)，如面積、周長(zhǎng)、長(zhǎng)軸、短軸、形態(tài)因子、異型指數(shù)、圓形度、平均灰度、平均光密度、積分光密度、絕對(duì)光密度、光密方差度、核漿比等。分析數(shù)據(jù)的可視化處理使分析結(jié)果與圖像之間構(gòu)成直接映射關(guān)系，便于觀察分析。第六十五頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三數(shù)值統(tǒng)計(jì)：自動(dòng)對(duì)目標(biāo)圖像進(jìn)行分割、計(jì)算、統(tǒng)計(jì)、歸類等操作，并可自動(dòng)編號(hào)，逐個(gè)顯示被跟蹤目標(biāo)的全部參數(shù)；用戶可自行設(shè)置測(cè)量參數(shù)或編輯用戶所需測(cè)量參數(shù)，并可進(jìn)行分類。白平衡：軟件支持將不同時(shí)間、不同亮度、不同拍攝曝光設(shè)置下圖片進(jìn)行背景修正，以更科學(xué)的計(jì)算光密度相關(guān)的參數(shù)。

第六十六頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三免疫組化分析：支持對(duì)免疫組化圖片進(jìn)行面積含量、數(shù)目含量以及和光密度有關(guān)的各類參數(shù)。

圖像定標(biāo)和校正：可定標(biāo)圖像到任何測(cè)量單位，并以實(shí)際尺寸參數(shù)對(duì)目標(biāo)進(jìn)行分析計(jì)算或打印相應(yīng)定倍圖片。圖像輸出：照片質(zhì)量輸出圖像，輸出圖像的大小和位置可任意調(diào)整，并能按嚴(yán)格的標(biāo)尺輸出圖像。第六十七頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三熒光圖片合成與濾色：將不同波段下的熒光圖片合成一張圖片或?qū)⒑铣蓤D片濾色成不同波段的多張圖片。景深擴(kuò)展：對(duì)同一視野下不同焦距下拍攝的多張圖片進(jìn)行景深擴(kuò)展，處理成一張各區(qū)域都清晰的圖片。第六十八頁(yè)，共八十五頁(yè)，編輯于2023年，星期三大圖拼接：