微衛(wèi)星篩選方法

微衛(wèi)星篩選方法課件第一頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二什么是微衛(wèi)星（Microsatellite）？

短串聯(lián)重復(fù)(shorttandemrepeat，STR)簡單序列重復(fù)(simplesequencerepeat，SSR)由1-5個核苷酸為重復(fù)單位串聯(lián)組成的長達(dá)幾十個核苷酸的序列,重復(fù)數(shù)為10~20次含有串聯(lián)重復(fù)的核心序列兩側(cè)較保守的側(cè)翼序列

動物體中以雙核苷酸（CA/GT）n最為常見第二頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二廣泛分布于各種真核生物基因組中，非常豐富且分布比較均勻數(shù)量多、特異的PCR擴(kuò)增、穩(wěn)定性好、在基因組內(nèi)分布均勻、多態(tài)性信息豐富、易于檢測第三頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二完美（perfect）重復(fù)型第四頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二不完全（imperfect）重復(fù)型第五頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二復(fù)合（compound）重復(fù)型第六頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二所有的微衛(wèi)星分離篩選實驗都是沙里淘金的過程第七頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二傳統(tǒng)篩選法使用限制性內(nèi)切酶或者聲波處理使基因組片段化電泳切膠選擇300-700bp的片段作為篩選庫連接到質(zhì)粒中轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中與放射性的探針做Southern雜交，選擇出陽性克隆后進(jìn)行測序、引物設(shè)計和引物最優(yōu)化第八頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二第九頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二傳統(tǒng)篩選法缺點：實驗成本高、耗時長而無法大批量操作，并且由于使用放射性元素而使得操作過程不安全。第十頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二基于引物擴(kuò)增的方法基因組片段化和片段大小選擇把片段轉(zhuǎn)入噬菌體中從而得到一個單鏈的DNA庫以這些ssDNA為模板，以重復(fù)堿基引物做PCR擴(kuò)增，得到篩選庫第十一頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二基于引物擴(kuò)增的方法缺點：操作繁雜，使用重復(fù)堿基引物擴(kuò)增的效率較低從而使得一些較稀少的位點被忽略，并且這個方法在篩選三四堿基重復(fù)的位點時會出現(xiàn)單克隆的多拷貝情況第十二頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二選擇性雜交法對目標(biāo)物種的基因組進(jìn)行片段化和片段大小選擇將片段接入質(zhì)粒或者加上接頭與一定的探針雜交，雜交后的片斷可以選擇雜交篩選和磁珠吸附兩種方法對雜交片段進(jìn)行富集第十三頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二FLASCO法（FastisolationbyAFLPofSequencesCOtainingrepeats）跳過對基因組片段化和大小的選擇充分利用了基因組，以免稀有微衛(wèi)星的丟失。步驟較為簡單，方便快速，優(yōu)化效率高，實驗成本較低。第十四頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二1DNA抽提2酶切連接3AFLP特異擴(kuò)增4探針雜交5磁珠洗脫6雙鏈恢復(fù)7質(zhì)粒連接8轉(zhuǎn)化克隆9單克隆擴(kuò)增培養(yǎng)10菌落PCR選擇目標(biāo)克隆11測序12引物設(shè)計及優(yōu)化13熒光PCR及基因分型14數(shù)據(jù)分析第十五頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二（1）DNA抽提 -Sambrooketal.1989；其它方法（2）酶切連接 -MseI+T4Ligase（3）AFLP特異擴(kuò)增DNA片段-酶切連接液為模板-MesI–N引物第十六頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二（4）探針雜交-5，端生物素修飾的重復(fù)堿基探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交（5）磁珠洗脫-磁珠特異性吸附雜交片段，洗脫除去未雜交片段第十七頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二（6）雙鏈恢復(fù)-磁珠富集得到的目的單鏈以MesI-N為引物特異擴(kuò)增恢復(fù)為雙鏈（7）質(zhì)粒連接-PMD18-Tvector第十八頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二（8）轉(zhuǎn)化克隆-DH5-α感受態(tài)細(xì)胞涂板，37℃培養(yǎng)11-13h（9）單克隆擴(kuò)增培養(yǎng)-挑取白色飽滿菌落液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5h

（10）菌落PCR選擇目標(biāo)克隆-三引物法擴(kuò)增產(chǎn)物為雙帶第十九頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二（11）測序-目標(biāo)克隆菌液測序（12）引物設(shè)計及優(yōu)化-CID軟件分析序列及設(shè)計引物-引物擴(kuò)增條件優(yōu)化（13）熒光PCR及基因分型-熒光修飾引物特異擴(kuò)增-基因分型第二十頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期二（14）數(shù)據(jù)分析-Genescan讀取基因分型數(shù)據(jù)-位點多態(tài)性信息-位點是否偏離