鴨疫里默氏桿菌病診斷技術(shù)規(guī)程

I鴨疫里默氏桿菌病診斷技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鴨疫里默氏桿菌病的臨床診斷、細(xì)菌分離、病原核酸檢測(cè)和綜合判定的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于鴨疫里默氏桿菌病的診斷與檢測(cè)。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.28食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范臨床診斷流行病學(xué)該病一年四季均可發(fā)生，鴨、鵝、野生水禽和火雞均可發(fā)病，1周齡~8周齡鴨高度敏感，5周齡以下死亡較快，較大的鴨可能存活時(shí)間較長(zhǎng)，該病在種鴨中少見。臨床癥狀最急性型很少出現(xiàn)明顯癥狀即突然死亡。急性型常見于2周齡～3周齡的雛鴨，病程1日～3日?；鉴喚癯劣?、嗜睡、厭食、離群、不愿走動(dòng)或行動(dòng)遲緩，眼鼻分泌物增多，患鴨呼吸困難、縮頸或以喙抵地，瀕死期出現(xiàn)神經(jīng)癥狀呈角弓反張、抽搐等。慢性型常見于4周齡～7周齡鴨，病程可達(dá)一周以上。主要表現(xiàn)為精神沉郁、厭食、腿軟弱無力、不愿走動(dòng)、伏臥或呈犬坐姿勢(shì)，共濟(jì)失調(diào)、痙攣性點(diǎn)頭或頭左右搖擺，難以維持軀體平衡，部分病例頭頸歪斜，當(dāng)遇到驚擾時(shí)呈轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)或倒退，部分患鴨跛行。感染后存活的鴨往往生長(zhǎng)遲緩。病理變化特征性病變?yōu)椴∷励啙{膜出現(xiàn)廣泛性的纖維素性滲出，包括心包炎、氣囊炎和肝周炎。慢性病例可見腦炎。判定標(biāo)準(zhǔn)若發(fā)病鴨符合3.1流行病學(xué)特征、3.2臨床癥狀和3.3病理變化，可判為鴨疫里默氏桿菌病疑似病例，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌分離和核酸檢測(cè)確診。實(shí)驗(yàn)室診斷除非另有規(guī)定，實(shí)驗(yàn)室診斷所用化學(xué)試劑均為分析純；試驗(yàn)用水符合GB/T6682二級(jí)水的規(guī)定；實(shí)驗(yàn)室生物安全要求按照GB19489執(zhí)行。細(xì)菌分離儀器和設(shè)備生物安全柜。CO2培養(yǎng)箱。顯微鏡。試劑或材料血清X脂平板（見附錄A.1）。麥康凱X脂平板（見附錄A.2）。革蘭氏染色液。瑞氏染色液。操作步驟取樣按NY/T541要求無菌采集發(fā)病鴨的肝臟或腦（有典型纖維素性滲出時(shí)采集肝臟，有神經(jīng)癥狀時(shí)采集腦）。分離培養(yǎng)將接種環(huán)伸入組織內(nèi)部，然后劃線接種于血清X脂平板和麥康凱X脂平板，平板的配制根據(jù)根據(jù)GB

4789.28的規(guī)定進(jìn)行操作，含5%～10%CO2的37℃培養(yǎng)箱或燭缸中培養(yǎng)24h～48h。挑取符合描述的典型菌落，劃線接種于血清X脂平板進(jìn)行純化培養(yǎng)。菌落形態(tài)在血清X脂平板培養(yǎng)基上見有濕潤(rùn)、呈露滴樣、圓形隆起、表面光滑、邊緣整齊的菌落，直徑為1

mm～2mm，顏色為灰白色；而麥康凱X脂平板上無菌落生長(zhǎng)。挑選單個(gè)典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色和瑞氏染色，并鏡檢。革蘭氏陰性，為無鞭毛、不運(yùn)動(dòng)、不形成芽胞的小桿菌。單個(gè)、成雙或呈短鏈狀排列，菌體形態(tài)除桿狀外，部分呈橢圓形，偶見呈長(zhǎng)絲狀。細(xì)菌大小寬為0.2μm～0.5μm，長(zhǎng)為1μm～5μm，呈絲狀的菌體可長(zhǎng)達(dá)11μm～24μm。瑞氏染色可見大多數(shù)菌體呈兩極著染。結(jié)果判定分離的細(xì)菌如同時(shí)符合和，可判定為疑似鴨疫里默氏桿菌。病原核酸檢測(cè)PCR方法儀器和設(shè)備高速冷凍離心機(jī)。PCR擴(kuò)增儀。電泳儀。紫外分析儀。微量加樣器：0.5μL～10μL；2μL～20μL；20μL～200μL；100μL～1000μL。試劑或材料陰性質(zhì)控。陽性質(zhì)控（滅活細(xì)菌培養(yǎng)物）。蛋白酶K。PBS（附錄B.1）。TE（附錄B.2）。SDS（附錄B.3）。X脂糖凝膠（附錄B.4）。TAE電泳液（附錄B.5）。樣品處理及核酸提取組織樣品無菌取疑似鴨疫里默氏桿菌病的肝臟、脾臟等臟器組織1.0g～5.0g，按10%（g/mL）加入PBS，研磨勻漿。-20℃保存?zhèn)溆?。?00μL組織勻漿液加入400μLTE中充分混勻，再加終濃度為1%的SDS和100μg/mL的蛋白酶K，置56℃水浴消化2h，冷至室溫后用酚及氯仿各抽提兩次，無水乙醇沉淀，75%乙醇洗滌，最后用40μLDEPC水溶解DNA，作為PCR模板，或保存于-20℃?；蛘哂蒙唐坊腄NA提取試劑盒提取DNA。菌落樣品挑取4.1.3.2可疑菌落，加到含20μL滅菌去離子水的PCR離心管中，壓緊管蓋，煮沸10min，再冰浴10min后離心取上清作為PCR模板樣品?；蛘哂蒙唐坊腄NA提取試劑盒提取DNA。引物根據(jù)GenBank中發(fā)表的鴨疫里黙氏桿菌16sRNA基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增片段大小為475bp。上游引物RA-001F:5’-TTAGATAGTTGGTGAGGTAA-3’。下游引物RA-002R:5’-ATCGGTGTTCTGAGTAAT-3’。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系反應(yīng)體系為25μL，配制見表1。PCR反應(yīng)體系配制PCR反應(yīng)體系中各成分每個(gè)樣品反應(yīng)組分用量/μL10×PCRbuffer2.52.5mmol/LdNTP2.010μmol/L引物F0.510μmol/L引物R0.55U/μLTaqE0.5模板1.0無RNA酶去離子水18.0總體積25.0反應(yīng)程序采用以下反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增：第一階段：95℃5min；第二階段：95℃30s，56℃30s，72℃40s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；第三階段：72℃10min。PCR擴(kuò)增也可使用商品化的PCR試劑盒，按說明書要求操作。電泳反應(yīng)結(jié)束后取10.0μLPCR產(chǎn)物與1.0μL10×上樣緩沖液混合，加到1%X脂糖凝膠板的加樣孔中，同時(shí)設(shè)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照，以5V/cm電壓進(jìn)行電泳20min～40min，在凝膠成像儀上觀察結(jié)果。結(jié)果判定試驗(yàn)成立的條件在陽性質(zhì)控出現(xiàn)一條大小475bp的單一條帶，同時(shí)陰性質(zhì)控?zé)o此條帶的情況下，檢測(cè)結(jié)果成立。結(jié)果的判定被檢樣品出現(xiàn)與陽性質(zhì)控同樣大小的條帶時(shí)，判為陽性；被檢樣品未出現(xiàn)與陽性質(zhì)控同樣大小的條帶時(shí)，判為陰性。如果陰、陽性質(zhì)控結(jié)果不成立，則全部樣品應(yīng)該重做。參見附錄C。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法儀器和設(shè)備實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)儀。臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)。渦旋振蕩器?？烧{(diào)移液器：0.5μL～10μL；2μL～20μL；20μL～200μL；100μL～1000μL。無RNA酶的熒光定量PCR管。試劑或材料陰性質(zhì)控。陽性質(zhì)控（滅活細(xì)菌培養(yǎng)物）。蛋白酶K。SDS。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒。樣品處理及核酸提取組織樣品參見4.2.1.3.1。菌落樣品參見4.2.1.3.2。引物根據(jù)GenBank中發(fā)表的鴨疫里黙氏桿菌16sRNA基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增片段大小為190bp。上游引物RA-003F:5’-GCTGGAATGAGTAGTGTAG-3’。下游引物RA-004R:5’-GCTTAGTCTCTGAACCATATAG-3’。熒光定量PCR反應(yīng)體系采用20μL反應(yīng)體系，組成見表2。熒光PCR反應(yīng)體系配制反應(yīng)體系中各成分每個(gè)樣品反應(yīng)組分用量/μL2×SYBRPremix10.010μmol/L引物P31.010μmol/L引物P41.0模板2.0無RNA酶去離子水6.0總體積20.0反應(yīng)程序采用以下反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增：第一階段：95℃2min；第二階段：95℃20s，57℃1min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，57℃時(shí)收集熒光。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)分析軟件得出的Ct值和擴(kuò)增曲線來判XX果。結(jié)果判定試驗(yàn)成立的條件閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。陰性質(zhì)控的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)無特異性擴(kuò)增；陽性質(zhì)控的Ct值應(yīng)＜28.0，則試驗(yàn)成立。結(jié)果的判定當(dāng)被檢樣品Ct值≤30且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線時(shí)，判為陽性；當(dāng)被檢樣品無Ct值或者Ct值≥35時(shí)，判為陰性；當(dāng)被檢樣品在30＜Ct值＜35時(shí)判為可疑，需重做，再次檢測(cè)結(jié)果的Ct值＜35，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，則可判為陽性，否則判為陰性。結(jié)果判定見附錄E。綜合判定符合3.4臨床診斷規(guī)定的疑似病例經(jīng)4.2.1和4.2.2中的任一方法檢測(cè)，結(jié)果為陽性者，可判定為鴨疫里默氏桿菌病。

（規(guī)范性附錄）

試劑的配制PBS（0.01mol/L，pH7.2）氯化鈉8.00g氯化鉀0.2mL磷酸二氫鉀0.2mL磷酸氫二鈉2.89g硫柳汞0.1g去離子水加至1000mL100kPa15min滅菌，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?0×TE羥基甲基氨基甲烷（Tris）12.11g乙二胺四乙酸二鈉3.72g水800mLHCl調(diào)PH至8.0水加至1000mL100kPa15min滅菌后備用。20%SDS十二烷基硫酸鈉20g水80mLHCl調(diào)PH至7.2水加至100mL1.0%X脂糖凝膠X脂糖1.0g1×TAE電泳緩沖液加至100mL加熱完全融化，待冷至50℃～60℃時(shí)，加Goodview溶液5μL，搖勻，倒入電泳板上，凝固后取下梳子，備用。50×TAE緩沖液羥基甲基氨基甲烷（Tris）242.0g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（PH8.0）27.5mL滅菌去離子水加至1000mL2℃～8℃保存。

（規(guī)范性附錄）

培養(yǎng)基的配制血清培養(yǎng)基X脂牛肉膏 0.5g蛋白胨 1.0g氯化鈉 0.5gX脂粉 1.0g去離子水加至100mL，100kPa20min滅菌，待冷卻到50℃～60℃時(shí)加入5mL無菌雞血清。置4℃