流式細(xì)胞儀結(jié)果分析課件

流式細(xì)胞儀的檢測范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞顆粒度細(xì)胞表面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量……細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)/外的細(xì)胞因子激素結(jié)合位點(diǎn)、細(xì)胞受體蛋白磷酸化pH值鈣離子濃度細(xì)胞膜電位、線粒體膜電位……1.上機(jī)檢測單色/雙色/多色樣本參數(shù)調(diào)節(jié)電壓、閾值、設(shè)門、補(bǔ)償2.細(xì)胞分選3.細(xì)胞表面和胞內(nèi)標(biāo)志檢測4.細(xì)胞周期(PI單染)

5.細(xì)胞凋亡（AnnexinV與PI雙染）舉例：FACSCalibur可檢測FL1-4四個通道的4個顏色

檢測器組（激光器）所需探測器（PMT）位置帶通/長通透鏡適用染料488nm藍(lán)色激光FL1530/30FITCFL2585/42PE,PIFL3670LPPerCP,PerCP-Cy5.5,PE-Cy7635nm紅色激光FL4661/16APC搭配熒光素原則1.不同型號的流式細(xì)胞儀的同樣的一個通道檢測熒光素的能力是不一樣的。2.每個通道只能選擇1種熒光素。3.各個通道之間的熒光素可以隨意搭配流式抗體熒光標(biāo)記搭配

將光散射特性與細(xì)胞的表面免疫熒光分析結(jié)合起來，區(qū)別經(jīng)這些特殊處理發(fā)生選擇性凋亡的淋巴細(xì)胞亞型以及活細(xì)胞的分類。由流式細(xì)胞儀能檢測多少個通道（由有多少激光以及每激光的功能決定的）、需要同時檢測多少個指標(biāo)、廠家的抗體有多少種熒光標(biāo)記等決定。不推薦APC和PE-Cy5一起使用，上流式以后，容易導(dǎo)致補(bǔ)償過度。推薦使用AlexFluro488和AlexFluro647。因?yàn)檫@些熒光非常明亮，對激光非常穩(wěn)定，適合流式細(xì)胞儀的光譜性質(zhì)，對PH值不敏感，具有水溶性。此外，他們聯(lián)合使用時發(fā)射光譜存在巨大差異，無需補(bǔ)償。數(shù)據(jù)顯示1.直方圖（Histogram）2.二維點(diǎn)圖（DotPlot）3.等高線圖（ContourPlot）4.密度圖（Density）5.三維圖（3DPlot）等“設(shè)門”就是確定陽性細(xì)胞群，去除散點(diǎn)部分。指在細(xì)胞分布圖中，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群（細(xì)胞基本處于同一狀態(tài)，有可比較性）。通過“設(shè)門”得到不同的區(qū)域，從而對其中的細(xì)胞進(jìn)行單參數(shù)或多參數(shù)分析。

設(shè)門是流式細(xì)胞儀分析中的一種重要技術(shù)，只有通過最佳的設(shè)門方式，才能準(zhǔn)確地獲取和分析。包括在線設(shè)門和離線設(shè)門。補(bǔ)償對照（雙色或多色分析中，熒光素發(fā)射光譜重疊時）熒光補(bǔ)償是指在流式細(xì)胞多色分析中，糾正熒光素發(fā)射光譜重疊的過程，即從一個被檢測的熒光信號中去除任何其他的干擾熒光信號。

使用單種熒光素標(biāo)記的單克隆抗體和其余熒光素對應(yīng)的同型對照抗體分別進(jìn)行染色。實(shí)驗(yàn)樣本：自發(fā)熒光＋非特異熒光＋特異熒光同型對照：自發(fā)熒光＋非特異熒光單參數(shù)直方圖分析熒光峰的高低即在縱軸對應(yīng)的高度反映了具有此種熒光強(qiáng)度的細(xì)胞在樣本中所占比例的相對多少，而非絕對數(shù)目。雙參數(shù)散點(diǎn)圖分析散點(diǎn)圖等高線圖密度圖FCM的主要測定指標(biāo)：FSC,SSC,FL1,FL2,FL3(FL4)FCM標(biāo)記方法單標(biāo)：一種單抗/tube--FL1,FSC,SSC（三參數(shù)）雙標(biāo)：兩種單抗/tube--FL1,FL2,FSC,SSC（四參數(shù)）三/四標(biāo)：三種單抗/tube、四種單抗/tube--FL1-FL3/4,FSC,SSC分析時，使用FL2-w和FL2-A顯示。FL2-A是指熒光峰面積，反映了細(xì)胞DNA含量（前提是用Rnase處理去除RNA）；,FL2-H是指熒光峰的脈沖高度；FL2-W是指檢測熒光峰的脈沖寬度，該值通常在做細(xì)胞周期分析時應(yīng)用,用于去除粘連細(xì)胞。流式測細(xì)胞周期，一般分為G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有個凋亡峰(也稱sub-G0期)，而如果分析時細(xì)胞窗口沒設(shè)置好，可能在最前面還有細(xì)胞碎片峰。

外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖

（紅細(xì)胞溶解后）

顆粒雜質(zhì)、氣泡對檢測的影響FSC：反映細(xì)胞相對大小及其表面積

SSC：反映顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對復(fù)雜性對血液中淋巴細(xì)胞設(shè)門（R1）分析其免疫表型在線設(shè)門離線設(shè)門TB細(xì)胞分選細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測從增殖的角度分類高等動物細(xì)胞

①連續(xù)分裂細(xì)胞，在細(xì)胞周期中連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)因而又稱為周期細(xì)胞，如表皮生發(fā)層細(xì)胞、部分骨髓細(xì)胞。②休眠細(xì)胞暫不分裂，但在適當(dāng)?shù)拇碳は驴芍匦逻M(jìn)入細(xì)胞周期，稱G0期細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、肝、腎細(xì)胞等。③不分裂細(xì)胞，指不可逆地脫離細(xì)胞周期，不再分裂的細(xì)胞，又稱終端細(xì)胞，如神經(jīng)、肌肉、多形核細(xì)胞等等。不同類型細(xì)胞的G1長短不同，是造成細(xì)胞周期差異的主要原因。細(xì)胞周期的時間長短與物種的細(xì)胞類型有關(guān)。G1期(gap1)；S期(synthesisphase)；G2期(gap2)；M期又稱D期(mitosisordivision)

依據(jù)細(xì)胞DNA含量（橫坐標(biāo)）：G1期：DNA復(fù)制還沒開始，也是DNA含量最少的，即流式檢測結(jié)果圖的第一個峰；

S期：DNA開始復(fù)制，到完成復(fù)制，是一個一倍DNA到二倍DNA的過程，在流式結(jié)果圖中顯示期跨度特別大（第二個不高但很寬的峰）；

G2期：DNA復(fù)制完成至分裂的一段時間，此時細(xì)胞內(nèi)含二倍DNA，在流式結(jié)果圖中的第三個峰；

M期：細(xì)胞分裂過程，此時細(xì)胞內(nèi)也是二倍DNA，用DNA含量的方法是無法與G2期分開，所以有第三峰明顯升高時報告：G2/M期阻滯。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

1.細(xì)胞核的改變凋亡細(xì)胞核的改變，造成各種染色體熒光染料對凋亡細(xì)胞DNA可染性發(fā)生改變。研究表明，用各種染色體熒光染料對經(jīng)固定的凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色，其DNA可染性降低。許多學(xué)者把這種DNA可染性的降低認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一。DNA可染性降低也可能是因?yàn)镈NA含量的降低，或者DNA結(jié)構(gòu)的改變使其與染料結(jié)合的能力發(fā)生改變所致。在分析結(jié)果時應(yīng)該注意。細(xì)胞凋亡會產(chǎn)生特征性改變，包括細(xì)胞核、細(xì)胞器、細(xì)胞膜成分和細(xì)胞形態(tài)等的改變，其中細(xì)胞核的改變最具特征性。2.光散射特性凋亡細(xì)胞形態(tài)的改變影響其光散射特性。前散射光（FSC）與細(xì)胞的大小有關(guān)，而側(cè)散射光(SSC)反映的是光在細(xì)胞內(nèi)的折射作用，與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少有關(guān)。細(xì)胞凋亡時，細(xì)胞固縮，體積變小，F(xiàn)SC降低；染色體降解，核破裂形成，胞內(nèi)顆粒往往增多，SSC常增加。細(xì)胞壞死時，細(xì)胞腫脹，F(xiàn)SC增大；SSC亦增大，故可根據(jù)FSC和側(cè)SSC區(qū)別凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。但該檢測受細(xì)胞形態(tài)的均一性和核胞漿比率影響很大。在某些淋巴細(xì)胞凋亡中，用光散射特性檢測凋亡的可靠性較好，而在腫瘤細(xì)胞凋亡中，其可靠性就較差。ForwardScatter雙染和單染

在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。AnnexinV是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與PS有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的PS與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。故AnnexinV被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將AnnexinV進(jìn)行熒光素（EGFP、FITC）標(biāo)記，作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。與FITC的綠色熒光信號相比，EGFP的綠色熒光信號具有信號強(qiáng)，不易淬滅，穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。

碘化丙啶（PropidiumIodide,PI）是一種核酸染料，溴化乙錠的類似物，不能透過完整的細(xì)胞膜，但能夠透過凋亡中晚期細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞膜，嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。故將AnnexinV與PI匹配使用，可將處于不同凋亡時期的細(xì)胞區(qū)分開。注：1.AnnexinV-EGFP，PI避光保存及使用。PI有毒，操作時要戴手套。2.上機(jī)前要過濾細(xì)胞！因?yàn)镻I具有很強(qiáng)的粘附性，容易使細(xì)胞聚團(tuán)。流式細(xì)胞儀檢測時，細(xì)胞數(shù)量不應(yīng)低于1×105，不適用于檢測組織樣本。3.如果是貼壁細(xì)胞，胰酶消化不當(dāng)會引起假陽性，而用細(xì)胞刮子會造成細(xì)胞粘連成團(tuán)影響檢測?？蓪⒁让赶蠹?xì)胞的保存在含2%BSA的PBS中，防止進(jìn)一步的損傷。操作步驟1.細(xì)胞培養(yǎng)：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，接板，藥物處理，特定時間后終止培養(yǎng)。2.細(xì)胞固定：離心，收集細(xì)胞沉淀。貼壁細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化收集，消化時間不易過長。預(yù)冷PBS洗滌，加入預(yù)冷75%乙醇，4℃固定4h以上。3.細(xì)胞染色：離心棄上清，PBS洗滌，加入PI和RNaseA，4℃避光孵育30min。（PI單染）或者加入500μLBindingBuffer懸浮細(xì)胞。加入5μLAnnexinV-EGFP混勻后，加入5μLPropidiumIodide，混勻。室溫、避光、反應(yīng)5～15min；（雙染）6.請?jiān)?h內(nèi)，進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測。一般計(jì)數(shù)2~3萬個細(xì)胞，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析。AnnexinV-EGFP的綠色熒光通過FITC通道（FL1）檢測；PI紅色熒光通過PI通道（FL2或FL3）檢測，建議使用FL3。

因檢測細(xì)胞的類型、凋亡誘導(dǎo)劑種類、使用的檢測儀器不同，因而流式檢測的熒光補(bǔ)償也不同，建議每次檢測均需使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞作為對照，將熒光補(bǔ)償調(diào)整到適合，去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。若沒有調(diào)節(jié)好，會導(dǎo)致細(xì)胞分群不明顯或者流式檢測得到的結(jié)果圖非常不漂亮，而且會影響到檢測結(jié)果的不真實(shí)。結(jié)果解讀:縱坐標(biāo)CellNumber：即計(jì)數(shù)的有效細(xì)胞數(shù)；橫坐標(biāo)DNAContent：即DNA含量；

G0/G1期細(xì)胞占總的61.2%，DNA含量平均值為45.76。G2/M期占13.07%，DNA含量平均值為91.43。S期占25.73%。G2/G1為2.0。細(xì)胞碎片為0.48%，細(xì)胞聚集體有0.06%?？偟募?xì)胞數(shù)（儀器檢測到的）為17525個。在細(xì)胞周期中分析的細(xì)胞數(shù)為17431個（即排除了碎片及聚集體后）。峰的變異系數(shù)為4.54%（好）------CV是變異系數(shù)。一般CV越小，峰形越好，越尖銳。能控制在5%左右是比較好的結(jié)果，一般小于10%就可以認(rèn)可了。PI標(biāo)記法測細(xì)胞周期在FSC-SSC物理圖中圈定目標(biāo)細(xì)胞群，排除多細(xì)胞團(tuán)塊的影響，再以FL2A接受PI熒光信號檢測細(xì)胞中DNA含量為例，將目標(biāo)細(xì)胞顯示群在FL2A(area)-FL2W(width)散點(diǎn)圖中，粘連的兩個二倍體細(xì)胞可能與一個四倍體細(xì)胞的FL2A信號相同，但是FL2W的信號卻不同，粘連的雙細(xì)胞的FL2W值比單細(xì)胞要大，可以在散點(diǎn)圖中將單細(xì)胞設(shè)門顯示于FL2A直方圖中，再分析細(xì)胞周期。FL2-W/FL2-A設(shè)門排除雙連體細(xì)胞對G2/M期細(xì)胞