質(zhì)粒的提取及檢測

質(zhì)粒的提取及檢測第一頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三

質(zhì)粒（plasmid）是染色體外小型（1-200kb）的共價、閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子（cccDNA），能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。

常常編碼一些對宿主有利的酶的基因，這些基因的表型包括抗生素抗性、產(chǎn)生抗生素、限制酶、修飾酶等質(zhì)粒的復(fù)制：嚴(yán)緊型復(fù)制（1~n個）松弛型復(fù)制（20個以上）第二頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三常用的質(zhì)粒載體是通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建而成的。pUC18,pUC19(500~700第三頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三Ampr抗性基因編碼一種周質(zhì)酶（β-內(nèi)酰胺酶）可特異地切割A(yù)mp的β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使其失去殺菌能力第四頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三提純的思路質(zhì)粒的特性：共價、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA要去除的物質(zhì)：蛋白基因組DNA脂類及小分子雜質(zhì)

RNA

第五頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三

質(zhì)粒的檢測——凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）第六頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三第一部分質(zhì)粒DNA的提取第七頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三一、實(shí)驗?zāi)康耐ㄟ^本實(shí)驗學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒。第八頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三

二、實(shí)驗原理

堿法提取主要是利用共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們，在堿性PH，DNA變性，恢復(fù)中性時，線性染色體DNA不能準(zhǔn)確復(fù)性，與其它大分子共沉淀，而質(zhì)粒DNA卻可以準(zhǔn)確復(fù)性，留在上清中。堿性下，變性蛋白是可溶的，酸性、中性下變性蛋白不溶而沉淀。幾乎所有純化質(zhì)粒的方法都用到質(zhì)粒DNA分子相對較小和共價閉合環(huán)狀這兩個特性。由于操作原因提取的質(zhì)粒可有三種結(jié)構(gòu)：線形、開環(huán)、閉環(huán)超螺旋。第九頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三三、實(shí)驗材料、器具及藥品

實(shí)驗器具

微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，臺式高速離心機(jī)，恒溫振蕩搖床，高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)，渦旋振蕩器。實(shí)驗材料含PUCm-T的E.coliDH5α菌株，1.5ml塑料離心管(又稱eppendorf管),離心管架。

第十頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三實(shí)驗藥品1.LB培養(yǎng)基配制及分裝(每升用量)胰蛋白胨(Bacto-tryptone)10g酵母提取物(Bacto-yeastextract)5gNaCl10gpH7.5121℃，20min高壓滅菌

第十一頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三2.溶液溶液Ⅰ200ml50mmol/L葡萄糖1.98g25mmol/LTris-Cl(pH8.0)5ml1M10mmol/LEDTA(pH8.0)5ml0.4M溶液Ⅱ0.4mol/LNaOH2%SDS臨用前1:1混合貯存液即為II液.溶液Ⅲ5mol/L醋酸鉀60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml(最終pH4.8)第十二頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三3.分離液酚/氯仿/異戊醇＝25:24:14.無水乙醇5.70%乙醇6.無菌水第十三頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三各試劑的作用：溶液I作用：分散細(xì)胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活溶液II作用：細(xì)胞壁肽聚糖堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。溶液III作用：酸性下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白－SDS＋線性DNA沉淀，K＋可中和DNA第十四頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三平衡酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）作用：氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機(jī)相的分離。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有機(jī)相，酚的密度大），可使DNA在上清中。異戊醇有助于消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫）注：用時取下層液，酚腐蝕性強(qiáng)，可引起灼傷。無水乙醇：除去DNA水化層，使DNA沉淀TE緩沖液：溶解DNA第十五頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三

四、實(shí)驗步驟接含PUC18(或pET21a)質(zhì)粒的單菌落于3mlLBAmp+液體培養(yǎng)基中370C，190rpm振蕩培養(yǎng)過夜取1.5菌液入1.5ml的dorf管中

6000rpm、離心2min，棄上清，收集菌體100uL溶液I懸浮菌體（充分振蕩），室溫（或冰?。?0min加入200uL溶液II（輕輕混勻），冰上靜置5min裂解菌體第十六頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三加入150uL溶液III（輕輕混勻），冰上靜置15min質(zhì)粒DNA復(fù)性12000rpm，離心15min，取上清記錄體積到一新管上清加等體積的酚：氯仿：異戊醇（振蕩混勻）12000rpm，離心15min，取上清記錄體積到一新管（可省略）上清加等體積的氯仿：異戊醇（振蕩混勻）12000rpm，離心15min，取上清記錄體積到一新管上清加2倍體積的無水乙醇（充分混勻），冰浴30min第十七頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三12000rpm，離心15min沉淀用75%乙醇1mL洗滌兩次（振蕩混勻、離心）12000rpm，離心10min沉淀超凈臺中風(fēng)干沉淀用20uLRTE溶解，-200C保存第十八頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三第二部分瓊脂糖凝膠電泳第十九頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三

相關(guān)知識電泳：泳動速度決定于？

瓊脂糖凝膠天然瓊脂（Agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（Agarose，約占80％）及瓊脂膠（Agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。瓊脂糖透明無紫外吸收，因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳。第二十頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系瓊脂糖濃度

0.3

0.6

0.7

0.9

1.2

1.5

2.0線狀DNA大小/kb

5-601-200.8-100.5-70.4-60.2-40.1-3第二十一頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系

不同構(gòu)型DNA的移動速度次序為：共價閉環(huán)超螺旋DNA（cccDNA）＞直線DNA（LDNA，2條鏈發(fā)生斷裂）＞開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA（ocDNA，1條鏈發(fā)生斷裂）。

第二十二頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三影響遷移率的因素DNA分子的大小、瓊脂糖凝膠的濃度、DNA的構(gòu)象、所加電壓一般5V/cm、電場方向、嵌入染料的存在、電泳緩沖液的組成。第二十三頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三常用染料EB:溴化乙錠（3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴鹽Ethidium

Bromide，EB），EB能插入DNA分子堿基對之間，導(dǎo)致EB與DNA結(jié)合。DNA吸收的260nm的紫外光傳遞給EB，或者結(jié)合的EB本身在300和360吸收的射線，均可在可見光區(qū)以590波長發(fā)射出來，呈橙紅色。EB染料優(yōu)點(diǎn)：染色操作簡便，快速，室溫下15-20min；不會使核酸斷裂；靈敏度高，10ng或更少的DNA即可檢出；可以加到樣品中可膠中。EB是誘變劑，使用時一定要戴手套。EB廢液要經(jīng)過處理才能丟棄。SYBR:新型低毒，高靈敏度染料，加入樣品中，價格較昂貴。Genefinder:新型低毒，高靈敏度染料，加入樣膠中，價格較低。第二十四頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三一、實(shí)驗?zāi)康?/p>

通過本實(shí)驗學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)。第二十五頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三二、實(shí)驗原理

DNA在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。核酸為兩性分子，在PH3.5時，整個分子帶正電；PH8左右時，堿基幾乎不解離，整個分子帶負(fù)電。在堿性環(huán)境下，相同堿基數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈負(fù)電荷，能以同樣的速度向正極方向移動。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系，可以近似用于估算分子的大小。可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。共價閉環(huán)超螺旋DNA（cccDNA）＞直線DNA（LDNA，2條鏈發(fā)生斷裂）＞開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA（ocDNA，1條鏈發(fā)生斷裂）。

第二十六頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期三三、儀器、材料與試劑

（一）

儀器（二）材料1.自已提取的質(zhì)粒DNA2.相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品（三）試劑

1．5×TBE儲液(PH8.0)使用時稀釋10倍成0.5×TBE（1×TBE也可）。

2．凝膠加樣緩沖液0.2%溴酚藍(lán)，50%蔗糖

3.瓊脂糖

4.10mg/ml溴化乙錠溶液