高速逆流色譜法的概況及應(yīng)用

高速逆流色譜法的概況及應(yīng)用高速逆流色譜（High-SpeedCountercurrentChromatography,HSCCC）是YoichiroIto博士于二十世紀(jì)八十年代首先研發(fā)、應(yīng)用并發(fā)展起來的一種新型液-液分配色譜技術(shù)；HSCCC運(yùn)用同步多層螺旋管進(jìn)行行星式離心運(yùn)動，使得在互不相溶的兩相溶劑系統(tǒng)中可以實(shí)現(xiàn)樣品在短時間內(nèi)的高效分離，從而制備樣品［槌。高速逆流色譜技術(shù)不需要固體支撐物，主要根據(jù)樣品在兩相中所具有的不同分配系數(shù)進(jìn)而對樣品進(jìn)行分離，相對于其他色譜技術(shù)如高效液相色譜、柱色譜等來說，具有高回收率、無吸附損耗、無峰拖尾等優(yōu)點(diǎn)。1、HSCCC法概況1.1HSCCC法的基本原理HSCCC屬于液-液分配色譜，所以其基本分離原理與其他同類色譜技術(shù)相同，即利用物質(zhì)在兩相間分配系數(shù)的差別進(jìn)行分配。而HSCCC將兩溶劑的分配體系置于高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管內(nèi)，建立起一種單向性流體動力平衡體系。螺旋管的運(yùn)動形式，是在自身自轉(zhuǎn)的基礎(chǔ)上，同時繞一公轉(zhuǎn)軸旋轉(zhuǎn)，成行星運(yùn)動⑶。這樣，加在分配體系上的離心力場不斷發(fā)生變化，使兩相溶劑充分的混合和分配，從而達(dá)到洗脫分離目的。HSCCC技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離。1.2溶劑系統(tǒng)的選擇利用HSCCC分離物質(zhì)的關(guān)鍵是溶劑系統(tǒng)的選擇。經(jīng)查閱多篇文獻(xiàn)，總結(jié)要點(diǎn)如下。對用于HSCCC分離的溶劑體系，應(yīng)該滿足這幾方面的要求：1）不造成樣品的分解與變性；2）足夠高的樣品溶解度；3）樣品在系統(tǒng)中有合適的分配系數(shù)值；4）固定相能實(shí)現(xiàn)足夠高的保留⑷。而對于溶劑體系選擇的原則，Ito博士本人總結(jié)的幾個要點(diǎn)是這樣描的：1）待分析組分應(yīng)易溶于溶劑系統(tǒng)，并不與之發(fā)生反應(yīng)；2）溶劑體系的各組分應(yīng)分成體積比例適合的兩相，以免浪費(fèi)溶劑；3）組分在溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)K應(yīng)為適當(dāng)?shù)亩ㄖ担?.5WKW1）；4）固定相的保留值要滿足一定要求（保留值越大峰形越好）。溶劑系統(tǒng)的一般選擇方法：HSCCC是利用溶質(zhì)在不同溶劑中的分配進(jìn)行分離的，所以在溶劑選擇時要重點(diǎn)考慮溶質(zhì)在兩溶劑中的分配系數(shù)。因而準(zhǔn)確測定待分離組分在兩相中的分配系數(shù)，即可選擇出合適的溶劑系統(tǒng)⑸。常見的溶劑體系有以下幾種：1）弱極性溶劑體系；2）中等極性溶劑體系；3）強(qiáng)極性溶劑體系。這三種溶劑體系分別可以用于分離相應(yīng)性質(zhì)的天然產(chǎn)物。而測定組分的分配系數(shù)，常采用高效液相色譜法、薄層色譜法等方法，都能夠較為準(zhǔn)確地測定特定組分的分配系數(shù)值。HPLC法即將適量的樣品分別溶于已平衡的兩相溶劑，待分配平衡后，進(jìn)行HPLC測定，通過得到的色譜峰面積可精確計(jì)算出樣品在兩相間的分配系數(shù)⑹。程杰⑺等從紅車軸草提取物中分離芒柄花素和鷹嘴豆芽素A時，采用HPLC測定K值的方法最終確定了溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（2：1.5：1.5：2）。薄層色譜法則是利用樣品在等體積上下相中分配平衡后用薄層色譜展開，通過薄層色譜得到的斑點(diǎn)判斷組分的分配情況［8］。1.3HSCCC法的優(yōu)點(diǎn)及發(fā)展情況HSCCC所有的優(yōu)點(diǎn)都源于其不用固體固定相，有廣泛的溶劑體系可供選擇，它獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)概括起來為：1）HSCCC不用固體支撐體，避免了由于樣品與固定相發(fā)生作用而導(dǎo)致的不可逆吸附、污染、變性等缺點(diǎn)；2）分離過程不是吸附與淋洗的過程，而是對流穿透的過程，所以能節(jié)省昂貴的填料費(fèi)用，節(jié)約溶劑的消耗；3）由于可選的溶劑系統(tǒng)非常多，故其可以分離各種不同極性范圍的物質(zhì)，適用范圍廣。而其缺點(diǎn)在于溶劑系統(tǒng)選擇沒有一個完整的、有指導(dǎo)意義的理論體系。近年來，由于此項(xiàng)技術(shù)具有很多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，國內(nèi)外對HSCCC的研究越來越多，應(yīng)用也越來越廣。就天然產(chǎn)物分離而言，曹學(xué)麗⑼在其著作中列舉了如下幾個方面:天然藥用植物活性成分分離及標(biāo)準(zhǔn)品制備、快速分離和重要指紋圖譜分析、天然新藥的研發(fā)和篩選。可見，HSCCC技術(shù)在天然產(chǎn)物分離中有著廣泛的應(yīng)用。2、HSCCC法的應(yīng)用。2.1在天然藥物活性成分研究中的應(yīng)用2.1.1生物堿類生物堿廣泛分布于植物界，對疾病治療和藥物開發(fā)等具有重要意義。近年來，用HSCCC已成功分離了多種生物堿。Li等［10］用HSCCC分離辣椒粗提物中的辣椒堿，以四氯甲烷-甲醇-水（4:3：2）為溶劑系統(tǒng)，下相為流動相。得到二氫辣椒堿、辣椒堿的純度分別為97.4%和99.0%。吳三橋等uh用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（22：25:23:17）為溶劑體系，從延胡索總堿中一步純化得到原阿片堿和延胡索乙素，純度分別為99.3%和98.8%，可作為延胡索乙素、原阿片堿化學(xué)對照品的制備分離方法。梁鎮(zhèn)然等［12］用HSCCC與硅膠柱層析聯(lián)用分離巖黃連中的2種原小檗堿型季胺生物堿，選定正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水-氨水（0.4：1.5：4:0.4:5:0.11）為兩相溶劑系統(tǒng)，下相為固定相，上相為流動相，通過1次高速逆流色譜，即可得到純度為97.0%的去氫碎葉紫堇堿。HSCCC還成功分離了長春花中的長春新堿［13］、紅豆杉中的三尖杉寧堿［14］、附子中的苯甲酰新烏頭堿［15］、白鮮皮中的白鮮皮堿［16］、鉤吻中的鉤吻堿［17］、蓖麻籽中的蓖麻堿［18］等。2.1.2黃酮及其昔類黃酮類化合物多存在于高等植物和蕨類植物中，常以游離或昔的形式存在，生理活性多種多樣。傳統(tǒng)的制備方法是柱層析或薄層層析，操作繁瑣，收率較低。改用HSCCC法后，目標(biāo)組分的分離效率增加，純度也得到相應(yīng)提高。袁媛等［19］利用HSCCC分離純化木蝴蝶中的黃酮類活性成分，以氯仿-甲醇-水（9.5：10：5）為溶劑系統(tǒng)，從木蝴蝶乙酸乙酯粗提物中得到5種化合物，分別為白楊素、黃苓素、黃苓素-7-O-葡萄糖昔、黃苓素-7-O-雙葡萄糖昔和一種新的白楊素雙葡萄糖昔，各成分的純度均〉97%。孫印石等如用HSCCC分離制備陳皮中的黃酮類化合物，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（2：4:3:3）為兩相溶劑系統(tǒng)，從陳皮粗提物中一步分離制備得到橙皮昔、桔皮素和5-羥基-6,7,8,3,4-五甲氧基黃酮，純度均〉97.0%。2.1.3木脂素和香豆素類香豆素類成分廣泛分布于高等植物的根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等各部位。木脂素是2個苯丙烷骨架結(jié)構(gòu)通過其中的乃，乃或8,8'-碳相連的一類天然產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)多樣。這兩類化合物的分離純化難度較大，但HSCCC法的使用解決了這一難點(diǎn)。Cazal等［20］以環(huán)己烷-乙醇-乙臘-水（10:8:1:1）為溶劑系統(tǒng)，上相為流動相，下相為固定相，利用HSCCC從橙樹根中分離出花椒內(nèi)酯，純度〉99%。Shi等［21］采用的溶劑系統(tǒng)為乙酸乙酯-正丁醇-水（2：5:7）,下相為流動相，用HSCCC從蒲公英中分離純化木脂素，從蒲公英提取物中一步獲得蒙古蒲公英素A和rufescidride，純度分別為98.7%和98.5%。此外，HSCCC還可以用于分離純化續(xù)隨子中的七葉內(nèi)酯⑵］、連翹中連翹苷⑵］、五味子中的五味子酚％］、望春花中的木蘭脂素盜等。2.2建立指紋圖譜圓：鑒于HSCCC有很好的分辨率和重現(xiàn)性，一般分離物有2?3以上的組分峰,不僅可定性定量分析，還可以制定出某一天然產(chǎn)物的特征峰和指紋圖譜，進(jìn)而制定標(biāo)準(zhǔn)圖譜用于天然藥物的質(zhì)量控制，并且通過調(diào)節(jié)溶劑系統(tǒng)可以對非極性、極性等任何極性范圍的物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定，應(yīng)用較為廣泛；另一方面，HSCCC具有分離時間短、快速、方法簡單的特點(diǎn)，且儀器本身廉價易于推廣，具有良好前景。顧銘等⑵］選用正己烷、乙醇、水體系，采用分步洗脫，分離純化3個不同產(chǎn)地丹參提取物，各分離得到12個洗脫組分，經(jīng)高效液相色譜儀和紫外光譜儀檢測證明3張HSCCC洗脫圖譜中對應(yīng)洗脫峰為同一組分。HSCCC洗脫圖譜不包含非共有峰，并且對應(yīng)洗脫峰保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜3%，符合國家標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于制訂指紋圖譜方法學(xué)考察資料的技術(shù)參數(shù)。因此，HSCCC作為制訂指紋圖譜的方法之一具有可行性。3、展望HSCCC其分離度和重現(xiàn)性與HPLC相似，但儀器價格低廉、性能可靠、分析成本低、易于操作，是一種適用于中藥和天然產(chǎn)物研究的現(xiàn)代化儀器。對于天然藥物的提取分離非常適用。在質(zhì)控方面，可用于中藥和天然產(chǎn)物的定性定量分析，若能進(jìn)一步研究，整理出中藥材一系列的特征和色譜指紋圖譜，用于中藥材、中藥飲片的質(zhì)量控制，將能提供一種快速、簡便、價廉的新方法和新標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)在HSCCC在國外已經(jīng)廣泛應(yīng)用，但在國內(nèi)還非常有限，深度和廣度均不夠，僅在天然藥物的提取分離中略有應(yīng)用，在中藥的質(zhì)量分析和控制中應(yīng)用還很少，鑒于HSCCC本身所具有的優(yōu)點(diǎn)，相信在以后應(yīng)用會越來越廣泛。參考文獻(xiàn)張?zhí)煊?高速逆流色譜技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2011.黃寶康，秦路平,鄭漢臣，等.高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離及中藥質(zhì)控中的應(yīng)用[J].中藥材，2001,24(10):757-761.孫力，李鴻飛，尚靖，等.國內(nèi)應(yīng)用高速逆流色譜技術(shù)用于植物成分分離的概況[J].新疆醫(yī)學(xué)，2003,33(6),134-136.曹學(xué)麗.高速逆流色譜分離技術(shù)及應(yīng)用[M].化學(xué)工業(yè)出版社，2005.李愛峰，劉寧寧，柳仁民.高速逆流色譜原理及其在天然產(chǎn)物化學(xué)成分分離中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].理化檢驗(yàn):化學(xué)分冊，2008,44(5):481-489.姚舜，柳仁民，黃雪峰，等.高速逆流色譜在天然產(chǎn)物分離中的方法學(xué)研究[J].中國天然藥物，2008,6(1)13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